实验一普通光学显微镜 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成,而当前使用的显微镜 由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500--2000倍。 (一)显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分:一为机械装置,一为光学系统,这两部分很好的配合,才能发挥显 微镜的作用 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件 (1)镜座镜座是显微镜的基本支架,它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒,它是 用来安装光学放大系统部件的基础。 2)镜筒镜筒上接接目镜,下接转换器,形成接目镜与接物镜(装在转换器下)间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒 长度的变化,不仅放大倍率随之变化,而且成像质量也受到影响。因此,使用显微镜时,不能任意改变镜筒 长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm,此数字标在物镜的外壳上 3)物镜转换器物镜转换器上可安装3一4个接物镜,一般是三个接物镜(低倍、高倍、油镜)。 Nikon 显微镜装有四个物镜。转动转换器,可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通,与镜筒上面的接目镜 构成一个放大系统 (4)载物台载物台中央有一孔,为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器,其作用为固定或移动标 本的位置,使得镜检对象恰好位于视野中心 5)推动器是移动标本的机械装置,它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的,好的显微镜在纵横 架杆上刻有刻度标尺,构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分,在第一次检 查时,可记下纵横标尺的数值,以后按数值移动推动器,就可以找到原来标本的位置 (6)粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件,老式显微镜粗螺旋向前扭,镜头下 降接近标本。新近出产的显微镜(如 Nikon显微镜)镜检时,右手向前扭载物台上升,让标本接近物镜,反 之则下降,标本脱离物镜 〔⑦)微动螺旋用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距,要得到最清晰的物象,需要用微动螺旋做进一步调节 微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米(100微米)。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是 共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜,聚光器,接物镜,接目镜等组成,光学系统使物体放大,形成物体放大 像。见图1-2。 (1)反光镜较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体,在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另 凹面的镜子组成,可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央,照明标本。不用聚光器时用凹面 镜,凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时,一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有 光源,并有电流调节螺旋,可通过调节电流大小调节光照强度。 (2)豪光器聚光器在载物台下面,它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场 聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器,明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光 器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和 慧差的校正程度很高,是明视场镜检中质量最好的聚光器,但它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚 光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜(4×)大视场照明的需要 聚光器安装在载物台下,其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上,以得到最强的照明 使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节,使焦点落在被检物体上,以得到最大亮度。一般聚光 器的焦点在其上方1.25mm处,而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此,要求使用的载玻片厚度应在 0.8-1.2mm之间,否则被检样品不在焦点上,影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈,它可以
实验一 普通光学显微镜 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜 由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大 1500—2000 倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显 微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件 （1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是 用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒 长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒 长度。国际上将显微镜的标准筒长定为 160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器 物镜转换器上可安装 3—4 个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon 显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜 构成一个放大系统。 （4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标 本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横 架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检 查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。 （6）粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下 降接近标本。新近出产的显微镜（如 Nikon 显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反 之则下降，标本脱离物镜。 （7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。 微动螺旋每转一圈镜筒移动 0.1 毫米（100 微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是 共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大 像 。见图 1—2。 （1）反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另 一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面 镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有 光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。 （2）聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可分为明视场 聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光 器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于 0.6 时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和 慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于 4 倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚 光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明， 使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光 器的焦点在其上方 1.25mm 处，而其上升限度为载物台平面下方 0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在 0.8—1.2mm 之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以
开大和缩小,影响着成像的分辨力和反差,若将虹彩光圈开放过大,超过物镜的数值孔径时,便产生光斑 若收缩虹彩光圈过小,分辨力下降,反差增大。因此,在观察时,通过虹彩光圈的调节再把视场光阑(带有 视场光阑的显微镜)开启到视场周缘的外切处,使不在视场内的物体得不到任何光线的照明,以避免散射光 的干扰 3〕物镜安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像,物镜成像的质量,对分 辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径( numerical apeature简写为NA),每个物镜 的数值孔径都标在物镜的外壳上,数值孔径越大,物镜的性能越好。 物镜的种类很多,可从不同角度来分类 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同,可分为: ①干燥系物镜以空气为介质,如常用的40×以下的物镜,数值孔径均小于1。 ②油浸系物镜常以香柏油为介质,此物镜又叫油镜头,其放大率为90×—100×,数值孔值大于1。 根据物镜放大率的高低,可分为 ①低倍物镜指1×-6×,NA值为0.04-0.15 中倍物镜指6×-25×,NA值为0.15-0.40 ③高倍物镜指25×-63×,NA值为0.35-0.95; ④油浸物镜指90×-100×,NA值为1.25-1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为: ①消色差物镜是最常用的物镜,外壳上标有“Ach”字样,该物镜可以除红光和青光形成的色差 镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样,除能校正红、蓝、绿三色光的色差外,还能校正黄 色光造成的相差,通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜在上述物镜基础上,为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如:带校正环物镜,带视 场光阑物镜,相差物镜,荧光物镜,无应变物镜,无罩物镜,长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜 还有:半复消色差物镜(FL),平场物镜(Plan),平场复消色差物镜( Plan apo),超平场物镜( Splan, 平场复消色差物镜( Splan apo)等 (4)目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次,并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物 镜简单,普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成,上端的一块透镜称“接目镜”,下端的透镜称“场镜” 上下透镜之间或在两个透镜的下方,装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”,物镜放大后的中间像就落 在视场光阑平面处,所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜( Huygens eyepiece),如要进行研究用时,一般选用性能 更好的目镜,如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广视场目镜(WF)。照相时选用照相目镜(NFK)。 (二)光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的,单透镜成像具有像差,影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于 个凸透镜,放大作用更好。图1—4是显微镜的成像原理模式。AB为标本 (三)显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高,而且清晰,物体放大 后,能否呈现清晰的细微结构,首先取决于物镜的性能,其次为目镜和聚光镜的性能 1、数值孔径也叫做镜口率(或开口率),简写为N.A,在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径,数值孔 径是物镜和聚光器的主要参数,也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关 系,它与显微镜的分辨力成正比,与焦深成反比,与镜象亮度的平方根成正比 数值孔径可用下式表示: N. A=n. sin 式中: n一物镜与标本之间的介质析射率
开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑； 若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有 视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光 的干扰。 （3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分 辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature 简写为 NA），每个物镜 的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。 物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小于 1。 ②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为 90×—100×，数值孔值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜 指 1×—6×，NA 值为 0.04—0.15； ②中倍物镜 指 6×—25×，NA 值为 0.15— 0.40； ③高倍物镜 指 25×—63×，NA 值为 0.35—0.95； ④油浸物镜 指 90×—100×，NA 值为 1.25—1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。 镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外，还能校正黄 色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正环物镜，带视 场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜 还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超 平场复消色差物镜（Splan Apo）等。 （4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物 镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。 上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落 在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时，一般选用性能 更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。 （二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一 个凸透镜，放大作用更好。图 1—4 是显微镜的成像原理模式。AB 为标本 （三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大 后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。 1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为 N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔 径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关 系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。 数值孔径可用下式表示： N.A=n.sin α 2 式中： n—物镜与标本之间的介质析射率
a一物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度,见图1 镜口角a总是小于180°。因为空气的折射率为1,所以干燥物镜的数值孔径总是小于1,一般为0.05 0.95:油浸物镜如用香柏油(折射率为1.515)浸没,则数值孔径最大可接近1.5。虽然理论上数值孔径 的极限等于所用浸没介质的折射率,但实际上从透镜的制造技术看,是不可能达到这一极限的。通常在实用 范围内,高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4 几种物质的介质的折射率如下 空气为1.0,水为1.33,玻璃为1.5,甘油为1.47,香柏油为1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图1-6。 2、分辨力 D可用下式表示: λ/2N.A 可见光的波长为0.4-0.7微米,平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜,则D=0.55微米 /2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到,若小于0.42微米就不能视见。如果 使用数值孔径为1.25的物镜,则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值,均能视见。由此可见,D值 愈小,分辨力愈高,物象愈清楚。根据上式,可通过:(1)减低波长:(2)增大折射率:(3)加大镜口 角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的 物镜分辨力的高低与造象是否淸楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率 显微镜放大物体,首先经过物镜第一次放大造象,目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最 后的象和原物体两者体积大小之比例。因此,显微镜的放大率(V)等于物镜放大率(V1)和目镜放大率(V2) 的乘积,即 V=V1×V2 比较精确的计算方法,可从下列公式求得 F1=接物镜焦距,F2=接目镜焦距△=光学筒长,D=明视距离(=250毫米) 接物镜的放大倍 =接目镜放大倍 M=显微镜放大倍 数 数 数 设△=160毫米F=4毫米D=250毫米F2=150毫米 60 =40×16.7=668 5 4、焦深: 在显微镜下观察一个标本时,焦点对在某一象面时,物象最清晰,这象面为目的面。在视野内除目的 面外,还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象,这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径 及放大率成反比:即数值孔径和放大率愈大,焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细,否则容易 使物象滑过而找不到 二、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密,使用时必须细心,要按下述操作步骤进行
α—物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图 1— 5。 镜口角α总是小于 180°。因为空气的折射率为 1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于 1，一般为 0.05 —0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为 1.515）浸没，则数值孔径最大可接近 1.5。虽然理论上数值孔径 的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用 范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是 1.4。 几种物质的介质的折射率如下： 空气为 1.0，水为 1.33，玻璃为 1.5，甘油为 1.47，香柏油为 1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图 1—6。 2、分辨力 D 可用下式表示： D=λ/2N.A. 可见光的波长为 0.4—0.7 微米，平均波长为 0.55 微米。若用数值孔为 0.65 的物镜，则 D=0.55 微米 /2×0.65=0.42 微米。这表示被检物体在 0.42 微米以上时可被观察到，若小于 0.42 微米就不能视见。如果 使用数值孔径为 1.25 的物镜，则 D=2.20 微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D 值 愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口 角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。 物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率： 显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最 后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2） 的乘积，即： V=V1×V2 比较精确的计算方法，可从下列公式求得 M = △ × D F 1 F 2 F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距 △=光学筒长，D=明视距离（=250 毫米） △ =接物镜的放大倍 数 D =接目镜放大倍 数 M=显微镜放大倍 数 F 1 F 2 设△=160 毫米 F1=4 毫米 D=250 毫米 F2=150 毫米 则 M= △ × D = 1 60 × 2 50 =40×16.7=668 倍 F 1 F 2 4 1 5 4、焦深： 在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的 面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径 及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易 使物象滑过而找不到。 二、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行
(-)观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时,要用右手紧握镜臂,左手托住镜座,平稳地将显微镜搬运到实 验桌上 2、将显微镜放在自己身体的左前方,离桌子边缘约10cm左右,右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照不带光源的显微镜,可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照,但不能用直射阳光, 直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。 将10×物镜转入光孔,将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置,用左眼观察目镜中视野的亮度,转动 反光镜,使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时,用平面反光镜,光线较弱时,用凹面反光镜 自带光源的显微镜,可通过调节电流旋钮来调节光照强弱 4、调节光轴中心显微镜在观察时,其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心 必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜,先将光阑缩小,用10×物镜观察,在视场内可见 到视场光阑圆球多边形的轮廓像,如此像不在视场中央,可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央, 然后缓慢地将视场光阑打开,能看到光朿向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接 说明光线已经合轴。 二)低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大,易于发现 目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上,用标本夹夹住,移动推动器,使被观察的标本处在物镜正下方,转动粗调节旋钮, 使物镜调至接近标本处,用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒(或下降载物台),直至物像岀现 再用细调节旋钮使物像淸晰为止。用推动器移动标本片,找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 〔三)高倍镜親察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜,低倍、高倍镜头是同焦的 在正常情况下,高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜,在转换物镜时要 从侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察,调节光照,使亮度适中,缓慢调节粗调节旋钮,使载 物台上升(或镜筒下降),直至物像出现,再用细调节旋钮调至物像清晰为止,找到需观察的部位,并移至 视野中央进行观察。 (四)油镜观察油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短,一般在0.2mm 以内,再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”,因此使用油浸物镜时要特别细心,避免由于“调 焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损 使用油镜按下列步骤操作 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升(或将载物台下降)约2cm,并将高倍镜转出 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视,用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升,(或镜筒下降),使油浸物镜浸入香柏油中,使镜头 几乎与标本接触 4、从接目镜内观察,放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑),上调聚光器 使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升),当岀现物像一闪后改用细调节旋钮调至 最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象,必须再从侧面观察,重复上述操作 5、观察完毕,下降载物台,将油镜头转岀,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合 液(乙醚2份,纯酒精3份)或二甲苯,擦去镜头上残留油迹,最后再用擦镜纸擦拭2-3下即可,(注意 向一个方向擦拭)。 6、将各部分还原,转动物镜转换器,使物镜头不与载物台通光孔相对,而是成八字形位置,再将镜筒下降 至最低,降下聚光器,反光镜与聚光器垂直,用一个干净手帕将接目镜罩好,以免目镜头沾污灰尘。最后用 柔软纱布清洁载物台等机械部分, 显微镜放回柜内或镜箱中 实验二相差显微镜 (一)相差显微镜的特点相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差(即相位差)转化 为光强差的特种显微镜。 光线通过比较透明的标本时,光的波长(颜色)和振幅(亮度)都没有明显的变化。因此,用普通光学
（一）观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实 验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约 10cm 左右，右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光， 直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。 将 10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动 反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。 自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。 4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心 必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用 10×物镜观察，在视场内可见 到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央， 然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接， 说明光线已经合轴。 （二）低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现 目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮， 使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现， 再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 （三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的， 在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要 从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载 物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至 视野中央进行观察。 （四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在 0.2mm 以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调 焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约 2cm，并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头 几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器， 使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至 最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。 5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合 液（乙醚 2 份，纯酒精 3 份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭 2—3 下即可，（注意 向一个方向擦拭）。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降 至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用 柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 实验二 相差显微镜 （一）相差显微镜的特点 相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化 为光强差的特种显微镜。 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学
显微镜观察未经染色的标本(如活的细胞)时,其形态和内部结构往往难以分辨。然而,由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同,光线通过这种标本时,直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加 或减少,加快或落后的光波的相位会发生改变(产生相位差)。光的相位差人的肉眼感觉不到,但相差 显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板,利用光的干涉现象,将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差(明暗差),从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异,对比度増强,使我们能比较淸楚 观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 二)相差显微镜的成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环,经聚光器后聚成光束,这束光线通 过被检物体时,因各部分的光程不同,光线发生不同程度的偏斜(衍射)。由于透明圆环所成的像恰好落在 物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此,未发生偏斜的直射光便通过共轭面,而发生偏斜的衍射光则 经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同,它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位 差和强度的减弱,两组光线再经后透镜的会聚,又复在同一光路上行进,而使直射光和衍射光产生光的干涉 变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时,通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼 可以分辨的振幅差(明暗差)。 (三)相差显微镜的结构和装置相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的,所不同的是它具有 四部分特殊结构:即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片 1、环状光阑具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上,光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相 匹配的,并有一个明视场光阑,与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2、相板位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域,直射光通过的部分叫“共轭面”,衍射光通过 的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜,常以“Ph”字样标在物镜外壳上, 相板上镀有两种不同的金属膜:吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜,它 能把通过的光线吸收掉60%—93%,相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成,它能把通过的光线相位推迟1/4 波长 根据需要,两种膜有不同的镀法,从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭 面上,通过共轭面的直射光不但振幅减弱,而且相位也被推迟1/4λ,衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4 λ,这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理,合成光等于直射光与衍射光振幅 之和,因背景只有直射光的照明,所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差,镜检效 果是暗中之明 如果吸收膜镀在共轭面,相位膜镀在补偿面上,直射光仅被吸收,振幅减少,但相位未被推迟,而通过补偿 面的衍射光的相位,则被推迟了两个1/4λ,因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉 原理,这样通过被检物体的合成光要比背景暗,这种效果叫正相差,即镜检效果是明中之暗。 负相差物镜( Negative contrast)用缩写字母“N”表示,正相差物镜( Positive contrast)用缩写字 母“P”表示,由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同,可分为高、中、低及低低,如0 lympus光的透过 率分为:7%、15%、20%、40%四个等级,因此分为高(High略写为H),中( Medium略写为M),低(Low 略写为L)及低低(Low-Low略写成LL)四类,构成了负高(N)、负中(NM)、正低(PL)和正低低(PL) 四种类型相差物镜,这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的 相差物镜。 3、合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合,才能 实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉,而不该吸收的衍射光反被吸收,应推迟 的相位有的不能被推迟,这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的, 因而环状光阑与相板常不同轴。为此,相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜(在镜的外壳上标有“CT”符 号),用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜,插入合轴调节望远镜,旋转合轴调节望远镜的焦点,便能清楚 看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮,使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共 轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大,可调节聚光器的升降旋钮,使两环完全吻合。如果聚光器已 升到最高点或降到最低点而仍不能矫正,说明玻片太厚了,应更换。调好后取下望远镜,换上目镜即可进行 镜检观察
显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加 或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差 显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉 的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚 的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。 （二）相差显微镜的成像原理 镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通 过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在 物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则 经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位 差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉， 变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼 可以分辨的振幅差（明暗差）。 （三）相差显微镜的结构和装置 相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有 四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。 1、环状光阑 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相 匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2、相板 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过 的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。 相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它 能把通过的光线吸收掉 60%—93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟 1/4 波长。 根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭 面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟 1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟 1/4 λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅 之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效 果是暗中之明。 如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿 面的衍射光的相位，则被推迟了两个 1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后 1/2λ。根据相消干涉 原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。 负相差物镜（Negative contrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positive contrast）用缩写字 母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如 Olympus 光的透过 率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High 略写为 H），中（Medium 略写为 M），低（Low 略写为 L）及低低（Low—Low 略写成 LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL） 四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的 相差物镜。 3、合轴调节望远镜 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能 实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟 的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的， 因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符 号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚 看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共 轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已 升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行 镜检观察
4、绿色滤光片由于使用的照明光线的波长不同,常引起相位的变化,为了获得良好的相差效果,相差显 微镜要求使用波长范围比较窄的单色光,通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。 Olympus厂家生产的相差 显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件 (四)相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项 1、使用范围相差显微镜能观察到透明样品的细节,适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、増增殖情 况及细微结构的观察。因此,是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生 物学研究的必备工具。 2、操作步骤 (1)根据观察标本的性质及要求,挑选适合的相差物镜 (2)将标本片放到载物台上 (3)进行光轴中心的调整。 4)取下一侧目镜,换上合轴调节望远镜,调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合,然后取下 合轴调节望远镜,换回目镜。在使用中,如需要更换物镜倍数时,必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环 吻合的调整 (5)放上绿色滤光片,即可进行镜检,镜检操作与普通光学显微镜方法相同。 3、注意事项 (1)视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大,而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光,物镜相板上 共轭面又吸收大部分光 (2)不同型号的光学部件不能互换使用 (3)载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准,不能过薄或过厚。 (4)切片不能太厚,一般以5-10μm为宜,否则会引起其他光学现象,影响成像质量 实验三细菌的简单染色和革兰氏染色 (一)实验目的:学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 (二)实验原理:用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正 电荷,能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常 带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带 负电荷,能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷増加,因此 易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊 红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞的构造 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性 菌(G)和革兰氏阴性菌(G-)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁 中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质 増加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗岀,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成 红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小, 通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色 (三)实验器材 1、活材料:培养12-16h的苏云金杆菌( Bacillus thuringiensis)或者枯草杆菌( Bacillus subtilis), 培养24小时的大肠杆菌( Escherichia coli) 2、染色液和试剂:结晶紫(附二、(一)、3)、卢哥氏碘液(附二、(一)、4)、95%酒精、蕃红(附二、 (一)、5)、复红(附二(一)、2)、二甲苯、香柏油 3、器材:废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜 (四)实验方法: 1、简单染色:
4、绿色滤光片 由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显 微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus 厂家生产的相差 显微镜在镜检时要使用该厂规定的 IF550 绿色滤光片作为配套器件。 （四）相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项 1、使用范围 相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情 况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生 物学研究的必备工具。 2、操作步骤 （1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。 （2）将标本片放到载物台上。 （3）进行光轴中心的调整。 （4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下 合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环 吻合的调整。 （5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。 3、注意事项 （1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上 共轭面又吸收大部分光。 （2）不同型号的光学部件不能互换使用。 （3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。 （4）切片不能太厚，一般以 5—10μm 为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。 实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色 （一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 （二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正 电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常 带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带 负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，因此 易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊 红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性 菌（G +）和革兰氏阴性菌（G —）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为 G +菌和 G —菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G —菌的细胞壁 中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质， 增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成 红色。G +菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 （三）实验器材 1、活材料：培养 12-16h 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）， 培养 24 小时的大肠杆菌（Escherichia coli） 2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、 （一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜 （四）实验方法： 1、简单染色：
(1)涂片:取干净载玻片一块,在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂苏云 金杆菌,右边涂大肠杄菌,做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杄菌浓菌液挑2-3环涂在左 边制成薄的涂面,将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面,注 意取菌不要太多。 (2)晾干:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干 (3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜) (4)染色:将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色1-2min (5)水洗:用水洗去涂片上的染色液 (6)干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干 (7)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色 (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干:与简单染色法相同 (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。 (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色,立即水洗 (9)复染:滴加蕃红复染5min (10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性 (13)实验完毕后的处理 ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜 头擦2一3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。 (五)实验作业 给出 Bacillus thuringiensis和 Escherichia coli的形态图,并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 (六)注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌:如脱色时间过 短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响, 难以严格规定 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果 3.选用幼龄的细菌。G菌培养12h-16h,E.coli培养24h。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳 性菌转呈阴性反应 实验四细菌的荚膜染色 (一)实验目的:学习细菌的荚膜染色法: (二〕实验原理:由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体和背 景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上,故染色时一般不 加热固定,以免荚膜皱缩变形。 (三)实验器材
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云 金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑 2-3 环涂在左 边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取 2-3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注 意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜） （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色 1-2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色 1 分 钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染 1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇脱色 20—25s 至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染 5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜 头擦 2—3 次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦 2—3 次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。 （五）实验作业 给出 Bacillus thuringiensis 和 Escherichia coli 的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。 （六）注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过 短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G +菌培养 12h-16h，E.coli 培养 24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳 性菌转呈阴性反应。 实验四 细菌的荚膜染色 （一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法： （二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背 景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在 90%以上，故染色时一般不 加热固定，以免荚膜皱缩变形。 （三）实验器材
1.活材料:培养3-5天的胶质芽胞杆菌( Bacillus mucilaginosus,俗称“钾细菌”)。该菌在甘露醇作碳 源的培养基上生长时,荚膜丰厚。 2.染色液和试剂: Tyler法染色液:(见附二、(一)、14)、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液(见 附二、(一)、2)、黑素(见附二、(一)、7)、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuS0水 溶液、香柏油、二甲苯 3.器材:载玻片、玻片搁架,擦镜纸、显微镜等。 (四)实验方法 推荐以下四种染色法,其中以湿墨水方法较简便,并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效 果更佳。 1.负染色法 (1)制片:取洁净的载玻片一块,加蒸馏水一滴,取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。 (2)干燥:将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 (3)染色:在涂面上加复红染色液染色2-3min。 (4)水洗:用水洗去复红染液 (5)干燥:将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 (6)涂黑素:在染色涂面左边加一小滴黑素,用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素,使黑素沿玻片边缘散 开,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成为一薄层,并迅速风干 (7)镜检:先低倍镜,再高倍镜观察 结果:背影灰色,菌体红色,荚膜无色透明。 2.湿墨水法 (1)制菌液:加1滴墨水于洁净的载玻片上,挑少量菌体与其充分混合均匀。 (2)加盖玻片放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸去多余的菌液 (3)镜检:先用低倍镜、再用高倍镜观察。 结果:背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 3.干墨水法 (1)制菌液:加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端,挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合,再加1环墨水 充分混匀 (2)制片:左手执玻片,右手另拿一边缘光滑的载玻片,将载玻片的一边与菌液接触,使菌液沿玻片接触 处散开,然后以30度角,迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端,使菌液铺成一薄膜。 (3)干燥:空气中自然干燥 (4)固定:用甲醇浸没涂片,固定1min,立即倾去甲醇。 (5)干燥:在酒精灯上方,用文火干燥 (6)染色:用甲基紫染1-2min (7)水洗:用自来水轻洗,自然干燥。 (8)镜检:先用低倍镜再高倍镜观察。 结果:背景灰色,菌体紫色,荚膜呈一清晰透明圈。 4. Tyler法 (1)涂片:按常规法涂片,可多挑些菌体与水充分混合,并将粘稠的菌液尽量涂开,但涂布的面积不宜过 大 (2)干燥:在空气中自然干燥。 (3)染色:用 Tyler染色液染5-7min (4)脱色:用20%CuS0水溶液洗去结晶紫,脱色要适度(冲洗2遍)。用吸水纸吸干,并立即加1-2滴香 柏油于涂片处,以防止CuS04结晶的形成 (5)镜检:先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油 结果:背景蓝紫色,菌体紫色,荚膜无色或浅紫色
1.活材料：培养 3-5 天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳 源的培养基上生长时，荚膜丰厚。 2.染色液和试剂 ：Tyler 法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见 附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4 水 溶液、香柏油、二甲苯。 3.器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜等。 （四）实验方法 推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效 果更佳。 1.负染色法： （1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。 （2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 （3）染色：在涂面上加复红染色液染色 2—3min。 （4）水洗：用水洗去复红染液。 （5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 （6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散 开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。 （7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。 2.湿墨水法 （1）制菌液：加 1 滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 （2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。 （3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 3.干墨水法 （1）制菌液：加 1 滴 6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加 1 环墨水， 充分混匀。 （2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触 处散开，然后以 30 度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。 （3）干燥：空气中自然干燥。 （4）固定：用甲醇浸没涂片，固定 1 min，立即倾去甲醇。 （5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 （6）染色：用甲基紫染 1—2min。 （7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。 （8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。 4.Tyler 法 （1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过 大。 （2）干燥：在空气中自然干燥。 （3）染色：用 Tyler 染色液染 5—7min。 （4）脱色：用 20%CuSO4 水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗 2 遍）。用吸水纸吸干，并立即加 1—2 滴香 柏油于涂片处，以防止 CuSO4 结晶的形成。 （5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色
(五)实验作业: 绘出 Bacillus mucilaginosus的形态图,并注明各部位的名称 (六)注意事项 1.加盖玻片时不可有气泡,否则会影响观察 2.应用干墨水法时,涂片要放在火焰较高处并用文火干燥,不可使玻片发热 3.在采用 Tyler法染色时,标本经染色后不可用水洗,必须用20%CuS04冲洗 实验五细菌的芽胞染色 (一)实验目的:学习细菌的芽胞染色法 (二〕实验原理:细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体着色而芽 胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点 而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的染料外,还需要加热,以促进芽胞着色 当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗,芽胞染上的颜色难以渗出,而菌体会脱色。然后用对比度强的染料 对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察。 (三)实验器材 活材料:培养36小时的苏云金杆菌( Bacillus thuringiensis)或者枯草杆菌( Bacillus subtilis)。 2.染色液和试剂:5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液[见附录二(一)6、5]。 3.器材:小试管(75m×10mm)、烧杯(300皿L)、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。 (四)实验方法 1.改良的 Schaeffer和 Fulton氏染色法 (1)制备菌液:加1-2滴无菌水于小试管中,用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀 制成浓稠的菌液。 (2)加染色液:加5%孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)加热:将此试管浸于沸水浴(烧杯),加热15-20min 4)涂片:用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上,做成涂面 (5)固定:将涂片通过酒精灯火焰3次。 (6)脱色:用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止 (⑦)复染:加蕃红水溶液染色5min后,倾去染色液,不用水洗,直接用吸水纸吸干 (8)镜检:先低倍,再高倍,最后用油镜观察 结果:芽胞呈绿色,芽胞囊和菌体为红色 2. Schaeffer与 Fulton氏染色法 (1)涂片:按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片 (2)晾干固定:待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2-3次 (3)染色 ①加染色液:加5%孔雀绿水溶液于涂片处(染料以铺满涂片为度),然后将涂片放在铜板上,用酒精灯火焰 加热至染液冒蒸汽时开始计算时间,约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液,切勿让标本干涸。(加 热时温度不能太高)。 ②水洗:待玻片冷却后,用水轻轻地冲洗,直至流出的水中无染色液为止。 ③复染:用蕃红液染色5min (4)水洗、晾干或吸干。 (5)镜检:先低倍,再高倍,最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态 结果:芽胞呈绿色,菌体为红色 (五)实验作业: 绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图 (六)注意事项 1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄
（五）实验作业： 绘出 Bacillus mucilaginosus 的形态图，并注明各部位的名称 （六）注意事项 1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。 2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。 3.在采用 Tyler 法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用 20%CuSO4 冲洗。 实验五 细菌的芽胞染色 （一）实验目的：学习细菌的芽胞染色法 （二）实验原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽 胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点 而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。 当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料 对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。 （三）实验器材 1.活材料：培养 36 小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。 2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液[见附录二（一）6、5]。 3.器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。 （四）实验方法 1.改良的 Schaeffer 和 Fulton 氏染色法 （1）制备菌液：加 1—2 滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2—3 环的菌体于试管中并充分打匀， 制成浓稠的菌液。 （2）加染色液：加 5%孔雀绿水溶液 2—3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 （3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热 15—20min。 （4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 （5）固定：将涂片通过酒精灯火焰 3 次。 （6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 （7）复染：加蕃红水溶液染色 5min 后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 （8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。 结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。 2.Schaeffer 与 Fulton 氏染色法 （1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 （2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过 2—3 次。 （3）染色： ①加染色液：加 5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰 加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持 15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加 热时温度不能太高）。 ②水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 ③复染：用蕃红液染色 5min。 （4）水洗、晾干或吸干。 （5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。 结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。 （五）实验作业： 绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。 （六）注意事项 1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄
2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越,可优先使用。 3.用改良法时,欲得到好的涂片,首先要制备浓稠的菌液,其次是从小试管中取染色的菌液时,应先用接种 环充分搅拌,然后再挑取菌液,否则菌体沉于管底,涂片时菌体太少。 实验六细菌的鞭毛染色 (一)实验目的:学习细菌的鞭毛染色法 (二)实验原理:细菌的鞭毛极细,直径一般为10-20n,只有用电子显微镜才能观察到。但是,如采用 特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先 用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁 或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法 (三)实验番材 1.活材料:培养12-16h的水稻黄单胞菌( anthomonas oryzae),粘质赛氏杆菌( Serratia marcescens) 或假单细胞菌( Pseudomonas sp.)斜面菌种 2.染色液和试剂:硝酸银染色液(见附二、(一)、8)、 Leifson染色液(见附二、(-—)、9)、香柏 油、二甲苯 3.器材:载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环,显微镜。 (四)实验方法 1.镀银法染色 (1)清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。为了避免玻片相互重叠,应将玻片插在专用金属 架上,然后将玻片置洗衣粉过滤液中(洗衣粉煮沸后用滤纸过滤,以除去粗颗粒),煮沸20min。取出稍冷 后用自来水冲洗、晾干,再放入浓洗液中浸泡5-6天,使用前取出玻片,用自来水冲去残酸,再用蒸馏水 洗。将水沥干后,放入95%乙醇中脱水 (2)菌液的制备及制片:菌龄较老的细菌容易失落鞭毛,所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋 白胨培养基斜面上(培养基表面湿润,斜面基部含有冷凝水)连续移接3-5代,以増强细菌的运动力。最后 代菌种放恒温箱中培养12-16h。然后,用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环,移至盛有1-2mL 无菌水的试管中,使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min(放置时间不宜太长,否则鞭 毛会脱落),让幼龄菌的鞭毛松展开。然后,吸取少量菌液滴在洁浄玻片的一端,立即将玻片倾斜,使菌液 缓慢地流向另一端,用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿 中,待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌,恒温培养12-16h后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 (3)染色 ①滴加A液,染4-6min ②用蒸馏水充分洗净A液 ③用B液冲去残水,再加B液于玻片上,在酒精灯火焰上加热至冒气,约维持0.5-1min(加热时应随时补 充蒸发掉的染料,不可使玻片出现干涸区 ④用蒸馏水洗,自然干燥。 (4)镜检:先低倍,再高倍,最后用油镜检查。 结果:菌体呈深褐色,鞭毛呈浅褐色。 2.改良 Leifson染色法 (1)清洗玻片法同1。 (2)配制染料见附录二(一)9。染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好 (3)菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同1。 ②用记号笔在洁净的玻片上划分3-4个相等的区域
2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。 3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种 环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。 实验六 细菌的鞭毛染色 （一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法 （二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为 10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用 特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先 用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁 或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。 （三）实验器材 1.活材料：培养 12-16h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens） 或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。 2.染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson 染色液（见附二、（一—）、9）、香柏 油、二甲苯。 3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。 （四）实验方法 1.镀银法染色 （1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属 架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸 20min。取出稍冷 后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡 5—6 天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水 洗。将水沥干后，放入 95%乙醇中脱水。 （2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋 白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接 3-5 代，以增强细菌的运动力。最后 一代菌种放恒温箱中培养 12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有 1—2mL 无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在 37℃恒温箱中静置 10min（放置时间不宜太长，否则鞭 毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液 缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将 0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿 中，待凝固后在平板中央点接活化了 3-4 代的细菌，恒温培养 12-16h 后，取扩散菌落的边缘制作涂片。 （3）染色 ①滴加 A 液，染 4—6min。 ②用蒸馏水充分洗净 A 液。 ③用 B 液冲去残水，再加 B 液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持 0.5—1min（加热时应随时补 充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。 ④用蒸馏水洗，自然干燥。 （4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 2.改良 Leifson 染色法 （1）清洗玻片法同 1。 （2）配制染料 见附录二（一）9。染料配好后要过滤 15-20 次后染色效果才好。 （3）菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同 1。 ②用记号笔在洁净的玻片上划分 3—4 个相等的区域