柠檬酸生产工艺简介 第一节概述 、柠檬酸的用途 (一)在食品工业的应用 柠檬酸被称为第一食用酸味剂,在食品工业上极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲 剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、合剂等,其具体用途,不胜枚举。 1、饮料 据统计75%~80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、果酱与果冻 3、糖果 4、冷冻食品 5、酿造酒 6、冰淇淋和酸奶 7、脂肪与油 柠檬酸作为抗氧化剂,并能鳌合微量元京使脂肪、油和含脂肪食品不易变质。在精 炼植物油和动物油中添加0.005%~0.02%柠槺酸,有较明显效果。 8、腌制品 9、罐头食品和水果加工 豆制品和调味品 二)柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用 1、药物 “999胃泰” 柠檬酸铋钾即枸橼酸铋钾是一种有效的胃药和收敛剂。 柠檬酸镁是泻下剂,用于X光透视前的清肠,使老人缓解便秘痛苦。在日本已列 为常用的泻药而生产。它与小苏打、柠酸、糖浆混合使用具有起泡性。 柠檬酸普遍应用于各种营养口服液等,辍冲pH3.5-4.5,维持活性配料的稳定性, 加强防腐剂的效果。柠檬酸与水果香精合用,赋予人们喜爱的香酸口感以掩盖药物的苦 味,尤其是中药制剂,在液态配料中加入0.02%柠檬酸可形成微量铁和铜的络合物, 延缓活性配料的降解作用。在口嚼药片中采用0.1%~0.2%柠檬酸能改善药片的风味, 使其具有柠橼风味。 2、发蜡与化妆品 在配制发蜡过程中用柠檬酸调节pH,在抗氧化剂体系中,作为金属离子合剂 都需要柠槺酸作为标准配料。在酸性染发液和电烫发中和液中也部含有柠檬酸(视头发 需要而定)。柠檬酸与柠橡酸钠配成缓冲液保持pH4.5~5.0之间可增强发蜡的防腐剂 作用,采用02%-18%柠檬酸制成低pH(40~50)洗发剂和去头皮屑洗发剂,洗 头时可增加头发的光泽,恢复头发弹性。 通过柠檬酸与碳酸钠或碳酸氢钠相结合提供CO2的气溶胶喷射器喷射药物与化妆 品已迅速发展。例如:在国外普遍使用泡腾型牙齿清洁剂。 (三)柠檬酸在工业上应用 1、金属净化 柠榛酸是高效登合清洗剂,对钙、镁、铁、铬、铜等污垢有效,广泛用于各种金属 表面的清洗,洗后废水可生物降解不污染环境
柠檬酸生产工艺简介 第一节 概述 一、柠檬酸的用途 （一） 在食品工业的应用 1、 饮料 据统计 75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。 2、 果酱与果冻 3、 糖果 4、 冷冻食品 5、 酿造酒 6、 冰淇淋和酸奶 7、 脂肪与油 8、 腌制品 9、 罐头食品和水果加工 10、 豆制品和调味品 （二） 柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用 1、 药物 “999 胃泰” 2、 发蜡与化妆品 （三） 柠檬酸在工业上应用 1、 金属净化
2、去垢剂 柠橄酸钠能增加去污性能,在许多家用去垢剂产品中可加快生物降解,可作为磷酸 盐的代用品,大量应用于洗衣粉、去污剂之中,柠檬酸钠与铝硅酸盐一起增强洗净剂的 3、无土栽培农艺 乳酸的用途 L乳酸聚合成聚乳酸(PLA) 利用PLA可生产溶延薄膜、定向薄膜、吹塑薄膜、食品保鲜薄膜、纤维、无纺组织、硬 质容器纸和板涂层、食品包装材料、手术缝合线、修复骨折的骨片、人造皮肤、无毒透明的 儿盦玩具,并可望在混纺织物中取代聚酯等。乳酸在低脂食品市场用量也在增加、而且新 苹果酸的用途 据报道,1988年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为4%,到1991年上升到 4.5%。但由于苹果酸的价格太高,故只用于特殊食品。一步发酵法一旦大规模投产 L苹果酸的价格将会有大幅度地下降。 1997年Byer公司称,美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中,将减少柠檬酸用量,增 加L苹果酸用量,尤其在使用二肽甜味剂时更能突出L苹果酸风味,改善口感,提高 产品质量。 、葡萄糖酸的用途 葡萄糖酸是众多有机酸中唯一的双歧杆菌增殖因子。作为补钙剂的葡萄糖酸钙和作 为豆腐凝固剂的葡萄糖酸8-内酯已在许多国家生产并应用,以日本最为普遍。葡萄糖 酸的口感也相当好,应是软饮料和食品较理想的酸味剂。 四、琥珀酸的用途 琥珀酸有贝类特有的鲜味,广泛应用于清酒、黄酒等酒类和酱油、发酵食品和各种 调味料。日本年产1.0万吨左右。生产厂商有川崎化成公司、日本触媒化学工业研究 所、武田制药公司和理研化学公司。日本“花王浴皂”每年使用琥珀酸2000~2500t 我国柠檬酸发展简史 68年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同 期,天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后 上海工微所用该所的“东酒2号”黑曲霉为出发菌株,用薯干粉做培养基,很快选出了 我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种AL558,由原轻工业部立项,组织上海、天津两个 工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵∫(筹)、上海酵母厂、天津柠檬酸厂(筹)、 南通油洒厂(南通发酵厂前身)等单位,在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取 工艺的中、大型试验工作,并取得了成功,因而推动了我国柠檬酸工业于20世纪70年 代初形成了工业体系。⑦0年代中期到80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期,先后选 育岀5代薯干原料髙产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。 上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技 人员和生产工人通过不懈地努力,提高了柠檬酸行业的整体水平,特别在缩短发酵周 提高单产方面成绩突出,使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和 天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量,已成为行业发展的骨干。1995 年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于 脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功,使我国的柠檬酸工业进入一个
2、 去垢剂 3、 无土栽培农艺 4、 矿物 5、 …… 二、乳酸的用途 L-乳酸聚合成聚乳酸（PLA） 三、L-苹果酸的用途 三、葡萄糖酸的用途 四、琥珀酸的用途 我国柠檬酸发展简史 1968 年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同 期，天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后， 上海工微所用该所的“东酒 2 号”黑曲霉为出发菌株，用薯干粉做培养基，很快选出了 我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种 AL558，由原轻工业部立项，组织上海、天津两个 工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵厂(筹)、上海酵母厂、天津柠檬酸厂(筹)、 南通油洒厂(南通发酵厂前身)等单位，在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取 工艺的中、大型试验工作，并取得了成功，因而推动了我国柠檬酸工业于 20 世纪 70 年 代初形成了工业体系。70 年代中期到 80 年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后选 育出 5 代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。 上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技 人员和生产工人通过不懈地努力，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别在缩短发酵周期、 提高单产方面成绩突出，使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和 天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量，已成为行业发展的骨干。1995 年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于 脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功，使我国的柠檬酸工业进入一个
新时期 柠檬酸的命名 柠檬酸( citric acid)又名枸櫞酸,学名2-羟基丙烷三羧酸(2- hydroxytricarboxylic acid)、2-羟基丙烷1,2,3-三羧酸(2 hydroxypropane1,2,3- tricarboxylic acid) 分子式;C6HO 相对分子质量:192.13 商品柠檬酸有一水物和无水物之分,一水物的分子式为 C6H0. HO,相对分子质 量为210.14 无水柠檬酸的英文名称: Anhydrous citric acid 水柠檬酸的英文名称: Monohydrate citric acid 柠檬酸的分子结构式: HO-C-COOH HC-COOH CH,-COOH CHz-COOH 柠槺酸 异柠橡酸 第二节柠檬酸发酵机制与代谢调控 黑曲霉柠檬酸生物合成途径 淀粉 萄糖 生长时EMP/HMP*2:1 EMP HMP 产激时EM/HMP=4:1 确酸烯式丙酸 丙酮 乙股 乙院CoA 草魔乙酸 拧配—积暴柠酸 苹暴 顺马头驶 言马酸 乙盛酿 异柠據酸 北珀酸 酰犹珀酸 珀CoA 制戊二 柠檬酸积暴径 图23-3柠槺酸生物合成途径
新时期。 柠檬酸的命名 第二节 柠檬酸发酵机制与代谢调控 黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是,葡萄糖经EMP、HMP途径 降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA,另一方面经CO2固定化反应 生成草酰乙酸,草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸 (1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径,前者EMP:HMP=2:1,后者EMP: HMP=4 一步证实 Cleland和 Johnson(1954)研究提出的结论。黑曲霉柠檬酸产生菌在生长期, 葡萄糖的降解是由酵解(EMP)和戊糖磷酸途径(HMP)共同完成的。其比率为 EMP/HMP=2:1,在柠檬酸产酸期,也存在HMP途径的酶,其比率为 EMP/HMP 4:1,即80%的葡萄糖由酵解(EMP)途径代谢的。HMP邀径主要存在于孢子形成阶 段,因为它提供合成核酸所需的前体物质。因此酵解(EMP)途径在黑曲莓柠檬酸产 生菌中起主要作用。 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环,在以糖质原料发酵时, 当柠檬酸积累时,TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱 (3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱,草酰乙酸是由丙酮酸(PYR)或磷酸 烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系,其中以丙 酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。 柠檬酸生物合成的理想途径 9ATP 3H, 0 1 2ATP 丙酮酸脱羧 CHO 2xCHO3T 径 丙酬 ∞国定 图2-3-5由葡萄糖发酵柠祿酸的理想途径 由图235所示,葡萄糖生成柠檬酸的全过程中,在碳平衡方面没有碳原子的损 失,在乙酰COA和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子,总反应式为: CH1206+1.502→CHO+2H2O 可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为1067%,以含一个结晶水的柠檬酸计为 116.7%。 黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经 EMP、HMP 途径 降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰 CoA，另一方面经 CO2 固定化反应 生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰 CoA 缩合生成柠檬酸。 （1） 生长期与产酸期都存在 EMP 与 HMP 途径，前者 EMP：HMP=2：1，后者 EMP： HMP=4 （2） 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在 TCA 循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时， 当柠檬酸积累时，TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱。 （3） 由于 TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸 烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个 CO2 固定化反应体系，其中以丙 酮酸羧化酶作用下固定化 CO2 生成草酰乙酸为主。 柠檬酸生物合成的理想途径 黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控
豪2315 柠檬酸生物合就有关降的调节性质 底物亲和力 激活剂 抑制剂 确股果糖激藻 F-6-P: So, =1.7mmol/L NH4 柠檬酸:K;=0.25mmo/L EC2.7.1.11 AMP PEPt I0,=0.25mmoV/L P ATP(浓度较高时) 丙同酸激露 ATP:K=0.0Smmal/L NH: K,26mmol/ EC2.7.1.40 PEP:Kn=0.0m/L|K∵:K。=20m∥L 丙剽股羧化 ADP, K.=0.05mmoV/L ASP: K: =1.9mmol/L EC6,4.1.1 PYP:K。=0.28mmo/L Pi: K;=40-140mmol/L mmol/L ATP:K。=0.28mmML 柠娘酸合成酪 乙酰CoA:Km=001mmoL EC4,1.37 享院乙酸:K。=0.0045mM/ ATP-Mg:K≈6mmoL 二二一葡萄糖 6-酸果糖 AMPR⊕二二ATP 1、6二磷酸果糖 藏丙糖 cOs 乙酰C。A 1「广二章乙酸 柠酸二 享果 鱼 反馈抑制 顺乌头酸 激活 富马酸 异拧酸 唬珀酸 戊二酸 图2-3-6無曲霉柠檬酸积眾的代谢调节
(一)柠檬酸积累的调节 1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 (1)磷酸果糖激酶(PFK酶)调节黑曲霉柠檬酸产生菌的PFK酶是酵解途径中 第一个调节酶,也是决定EMP途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受正常的生理浓 度范围的柠檬酸和ATP的抑制,为AMP、Pi、NH所激活,NH还能有效地解除柠 檬酸和ATP对PFK酶的抑制,如表23-15所示。 NH*在细胞内的生理浓度水平下,PK酶对柠檬酸不敏感(见表2316)。考察柠 檬酸发酵时,PFK酶的这些效应物在细胞内的浓度表明,铵离子浓度与柠檬酸生产速 率有密切关系,并且显示在锰缺乏和充足条件下的显著差别,可以认为,锰的效应是通 过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK酶的抑制。 夜23-16 锰离子充足和锰离子缺乏下具曲零PK活力 柠檬酸/(mmoJ/L) 铵离子/(mmd/L) 活力/u 15 1.1 锰足 3 1,0 (3)丙酮酸羧化酶的调节丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点,丙酮酸既可以 由丙酮酸脱氢酶催化脱羧生成乙酰CoA,也可以由丙酮酸羧化酶催化经CO2固定反应 生成草酰乙酸,CO2固定反应的强度对柠檬酸积累非常重要。保持丙酮酸这两个反应的 平衡是获得柠檬酸高产率的一个重要条件。如上所述黑曲霉柠檬酸产生菌中存在磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶,以丙酮酸羧化酶为主,此酶已被提纯,其酶学性质 已清楚,其活性不受代谢产物的调节。 2、三羧酸循环的调节 (1)柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是T℃A环中的第一个酶,但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节 作用。 (2)顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节 顺乌头酸水合酶、NAD、NAD异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时,这 种酶均存在,而当铜离子0.3mg,铁离子2mgL和pH2.0情况下,这3种酶均不出 现活力,发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸心顺乌头酸◇异柠檬酸正逆反应的酶,研究表明 黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶,它在催化时能建立下面的平 衡:柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7。并发现在柠檬酸发酵中,无论培养基 中是否存在铁离子,顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧,保证柠檬酸得 到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平.细胞内的PH下降,就能抑制顺乌头酸水 合酶和异柠檬酸 脱氢酶的活性,就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。 黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种:一种NAD异柠檬酸脱氢酶.活力很低。两 种NAD异柠檬酸脱氢酶,其一在细胞质中,不受柠檬酸抑制,其二在线粒体中.与 TCA循环有关,它受生理浓度的柠檬酸抑制,所以当柠檬酸积累到一定水平时,就抑 制此酶的活力,从而更加促进柠檬酸的积累。NAD异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性 pH和3 Ommon/L锰离子时被解除,这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故
（一） 柠檬酸积累的调节 1、 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 已清楚，其活性不受代谢产物的调节。 2、 三羧酸循环的调节 （1）柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是 TCA 环中的第一个酶，但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节 作用。 （2）顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节 顺乌头酸水合酶、NAD、NAD-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这 3 种酶均存在，而当铜离子 0.3mg/L，铁离子 2mg/L 和 pH2.0 情况下，这 3 种酶均不出 现活力，发酵中柠檬酸正是在这个 pH 条件下积累的。 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明， 黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平 衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7。并发现在柠檬酸发酵中，无论培养基 中是否存在铁离子，顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧，保证柠檬酸得 到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平．细胞内的 PH 下降，就能抑制顺乌头酸水 合酶和异柠檬酸 脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。 黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：一种 NAD 异柠檬酸脱氢酶．活力很低。两 种 NAD 异柠檬酸脱氢酶，其一在细胞质中，不受柠檬酸抑制，其二在线粒体中．与 TCA 循环有关，它受生理浓度的柠檬酸抑制，所以当柠檬酸积累到一定水平时，就抑 制此酶的活力，从而更加促进柠檬酸的积累。NAD 异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性 pH 和 30mmol／L 锰离子时被解除，这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故
(3)a-酮戊二酸脱氢酶酌调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中,TCA循环的一个显著 特点是。α-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳 源时,在柠檬酸生长期,菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸 脱氢酶催化的反应是了TCA循环中唯一不可逆反应,一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失 就会引起:⑦TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆T℃A循环生成, 使T℃CA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制NM一异柠檬酸脱氢酶的活性 (二)Mn2+调节 比较Mn2丰富和Mn2缺乏的分批培养时发现,当黑曲霉在缺Mn2的产柠橡酸培 养基中,菌体的组成代谢(戊糖磷酸途径,生糖途径)的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力 显著降低。不论锰丰富或缺乏,都未检岀α-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也 几乎无活力。 当缺锰时,HMP和TCA循环水平低,生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明 减少,而氨基酸和铵离子水平升高,丙酮酸和草酰乙酸水平升高,柠檬酸大量积累。 当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中,细胞内铵离子异常高,达25mmol/L 随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和γ氨基丁酸的积累和分泌,使铵离 子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰,导致蛋白 质分解增加,细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时,添加环己酰亚胺 可促进铵离子和氨基酸积累,由此可知,铵离子积累是由于蛋白质和RNA转换过程 中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反 应酶所需的,若猛离于缺乏,核酸、蛋白质合成受阻,而使细胞内的铵离子水平升高。 铵离子水平升高解除了柠檬酸和AIP对PFK酶的抑制.从而增加EM代谢流量,丙 酮酸和草酰乙酸水平升高,而使柠檬酸大量积累,这就是锰离子的调节效应 三)氧对柠檬酸积累的调节 乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子,因此氧也可以看 作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为: (1)从图2-3—7可知氧是发酵过程(EMP途径和丙酮酸脱氢)生成的NADH2重新 氧化的氢受体。 〔2〕近来的研究发现,黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外,还有一条侧系 吸 链,如图2-3-7所示 SHAM抑制 侧系呼吸链 蛋自 制零家抑制 氰化物抑制 细胞色囊b 细匙色囊c 细胞色a、43 标准呼吸链 图23-7黑曲霉的标准呼吸链和侧系呼吸链 此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸(SHAM)敏感,在黑曲霉生长期,此侧链不受水 杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受SHAM的强烈抑制。通过标准呼吸链氧 化时产生ATP,会反馈抑制PFK酶,而通过侧系呼吸链不产生AP,而当缺氧时.只 要很短时间中断供氧,就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活,从而导致柠檬酸产酸急
之一。 (3)α-酮戊二酸脱氢酶酌调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA 循环的一个显著 特点是。α-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳 源时，在柠檬酸生长期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸 脱氢酶催化的反应是了 TCA 循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失， 就会引起：⑦TCA 循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆 TCA 循环生成， 使 TCA 循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制 NM—异柠檬酸脱氢酶的活性。 （二） Mn2+调节 比较 Mn2+丰富和 Mn2+缺乏的分批培养时发现，当黑曲霉在缺 Mn2+的产柠橡酸培 养基中，菌体的组成代谢(戊糖磷酸途径，生糖途径)的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力 显著降低。不论锰丰富或缺乏，都未检出 α-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也 几乎无活力。 当缺锰时，HMP 和 TCA 循环水平低，生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明 显减少，而氨基酸和铵离子水平升高，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。 当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中，细胞内铵离子异常高，达 25mmol／L， 随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和 γ—氨基丁酸的积累和分泌，使铵离 子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰，导致蛋白 质分解增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时，添加环己酰亚胺， 可促进铵离子和氨基酸积累，由此可知，铵离子积累是由于蛋白质和 RNA 转换过程 中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反 应酶所需的，若猛离于缺乏，核酸、蛋白质合成受阻，而使细胞内的铵离子水平升高。 铵离子水平升高解除了柠檬酸和 ATP 对 PFK 酶的抑制．从而增加 EMP 代谢流量，丙 酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。 （三） 氧对柠檬酸积累的调节 乙酰 CoA 和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看 作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为： (1)从图 2—3—7 可知氧是发酵过程(EMP 途径和丙酮酸脱氢)生成的 NADH2 重新 氧化的氢受体。 〔2〕近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系 呼吸 链，如图 2—3—7 所示。 此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸(SHAM)敏感，在黑曲霉生长期，此侧链不受水 杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受 SHAM 的强烈抑制。通过标准呼吸链氧 化时产生 ATP，会反馈抑制 PFK 酶，而通过侧系呼吸链不产生 ATP，而当缺氧时．只 要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，从而导致柠檬酸产酸急
剧下降。一旦恢复供氧,标准呼吸链复活,而不影响菌的生长;但侧系呼吸链却不能 恢复,故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中,特别是产酸期,一定要充 足氧的供给,以保证更多的NHDH通过侧系呼吸链将H2交给O2生成CO2和H20, 使呼吸产生的ATP减少,解除ATP对PK酶的反馈抑制。使EMP代谢流增大,丙酮 酸和草配乙酸生成水平提高,柠檬酸产率提高。 黑曲霉柠檬酸发酵机制 (1)由于严格限制供给话离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、 铁离子等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力 使细胞中形成高水平的铵离子,从而解除柠檬酸和AP对PFK酶的反馈抑制,使EMP 途径的代谢流增大 (2)存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生AP,这样使 细胞内的ATP浓度下降。因而减轻了ATP对PK酶、CS酶的反馈抑制,促进了EMP 途径的畅通,增加柠檬酸的生物合成: (3)丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙 酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡,保证前体物乙酰CoA和 草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能 (4)α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏.使黑曲霉中的TA循环 变成“马蹄形”的代谢方式,减弱TA循环,降低细跑内AP浓度,另外使,a-酮 戊二酸浓度升高。反过来.又反馈抑制异柠檬政脱氢酶,降低柠檬酸的自身分解; (5)顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7的 平衡,顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸,即柠檬政分解活力低。一旦柠 檬酸浓度升高到某一水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进柠檬酸自身 积累,pH降至2.o以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸 积累并排出体外。 第三节柠檬酸发酵生产菌种 黑曲霉(Asp,nger) 黑曲霉柠檬酸的形态特征 (1)在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色,不是绒球状,凸起,边缘整齐,菌 落较小,带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。 (2)在察氏培养基上生长较慢,菌落边缘整齐,分生孢子梗短,分生孢子着生 较密。 (3)菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德,成熟后呈开花状而崩裂 (4)孢子柄(14-15)(1.5-2)以。 (5)顶囊球形d直径为50-72um (6)小梗分二层,初生小梗和次生小梗区别明显,初生小梗(30~31)×7pm, 次生小便大多是3根,也有2根的,大小为(9~13)μm×3.8um。 (⑦分生孢子串珠状着生,黑褐色,表面组糙且有明显的刺状突起,4.7 5.2μm,成熟后遇振动易散落。 、生活周期 黑曲霉属半知菌纲,一般只进行无性繁殖,由孢子发芽开始到新孢子形成 成熟,为一个生活周期。图2-3-1所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程 孢子在液体培养基中培养6—鼬开始萌发出芽,长出多根芽,逐渐形成菌丝
剧下降。一旦恢复供氧，标准呼吸链复活，而不影响菌的生长；但侧系呼吸链却不能 恢复，故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要充 足氧的供给，以保证更多的 NHDH2 通过侧系呼吸链将 H2 交给 O2 生成 CO2 和 H20， 使呼吸产生的 ATP 减少，解除 ATP 对 PFK 酶的反馈抑制。使 EMP 代谢流增大，丙酮 酸和草配乙酸生成水平提高，柠檬酸产率提高。 三、黑曲霉柠檬酸发酵机制 (1)由于严格限制供给话离子等金属离子，或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、 铁离子等金属离子的菌株，降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力， 使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除柠檬酸和 ATP 对 PFK 酶的反馈抑制，使 EMP 途径的代谢流增大； (2)存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生 ATP，这样使 细胞内的 ATP 浓度下降。因而减轻了 ATP 对 PFK 酶、CS 酶的反馈抑制，促进了 EMP 途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成； (3)丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙 酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定反应取平衡，保证前体物乙酰 CoA 和 草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能 力； (4)α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏．使黑曲霉中的 TcA 循环 变成“马蹄形”的代谢方式，减弱 TcA 循环，降低细跑内 ATP 浓度，另外使，α-酮 戊二酸浓度升高。反过来．又反馈抑制异柠檬政脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解； (5)顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7 的 平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬政分解活力低。一旦柠 檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进柠檬酸自身 积累，pH 降至 2．o 以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸 积累并排出体外。 第三节 柠檬酸发酵生产菌种 黑曲霉（Asp.niger） 一、黑曲霉柠檬酸的形态特征 (1)在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起．边缘整齐，菌 落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长 4d 成熟的孢子呈黑褐色。 (2)在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生 较密。 (3)菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。 (4)孢子柄(14—15)μ (1．5—2)μ。 (5)顶囊 球形 d 直径为 50 一 72μm。 (6)小梗 分二层，初生小梗和次生小梗区别明显，初生小梗(30～31 )×7μm， 次生小便大多是 3 根，也有 2 根的，大小为(9～13)µm ×3．8µm。 (7)分生孢子 串珠状着生，黑褐色，表面组糙且有明显的刺状突起，4．7— 5．2µm，成熟后遇振动易散落。 二、生活周期 黑曲霉属半知菌纲，一般只进行无性繁殖，由孢子发芽开始到新孢子形成、 成熟，为一个生活周期。图 2—3-1 所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程。 孢子在液体培养基中培养 6—8h 开始萌发出芽，长出多根芽，逐渐形成菌丝
菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构,有横隔,其中可育细胞称为足 细胞。由足细胞长出分生孢子梗,分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融 合,使顶端膨大形成顶囊,上面退生二层小梗,小梗上长出成链的孢子。这样一 个生活周期约50h,但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的,孢子也逐渐不断地产生 直至营养枯竭为止。 5 图2-31黑曲霉生活周期 、培养基
菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足 细胞。由足细胞长出分生孢子梗，分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融 合，使顶端膨大形成顶囊，上面退生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一 个生活周期约 50h，但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢子也逐渐不断地产生， 直至营养枯竭为止。 三、培养基
233 外黑曲零柠微酸生产曹的培养基 培养基组成 生孢培养基/(g/L) 发聯培养基/(g/L) 蔗糖 琼脂 硝酸铵 2.5 酸二氢钾 2.5 MgSO4·TH2O 0.25 0.00048 0.0006 0.001 234 日内具曲零c827、T419柠檬酸生产曹的培养基 培养基组成 生孢培养基 发酵培养基 (1)斜面培养基 麦芽汁 10~12Bx (2)款曲培养基 麦麩 约7g湿皮/1n (3)薯千粉 16%~20% (4)玉米液化液《总糖) 13%~14% NANO, 4%~5% 四、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征 (1)能耐高浓度的柠檬酸(15%以上),而不利用和分解柠檬酸。 (2)耐高浓度葡萄糖,能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶。其 淀粉酶在pH20仍能保持原活力的80%以上。在PH2.5,40℃下作用30min尚 不失活。其糖化酶最适作用PH在4.O一4.6,最适温度为60一65℃。在柠 檬酸发酵条件下,当培养pH下降至2.o以下时,仍能保持大部分活力。 (3)能抗微量金属离子,尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+ (4)在深层液体发酵培养时,能形成大量的细小菌球体,菌球体直径为o.lmr 菌球量达104个/mL以上。 (5)在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上,生长不好,生成小菌落,孢子形 成能力弱。 (6)在生长、繁殖期,细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+,即NH4库水平 (7)菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。 (8)细胞壁几丁质含量高,但β葡聚糖和聚半乳糖含量低 (9)在生长和产酸期,细胞内蛋白质、核酸水平低 (10)具有很强的侧系呼吸链活性,此侧系呼吸链不产生AIP 五、黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育
四、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征 (1)能耐高浓度的柠檬酸(15％以上)，而不利用和分解柠檬酸。 (2)耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶。其 α淀粉酶在 pH2.0 仍能保持原活力的 80％以上。在 PH2.5，40℃下作用 30min 尚 不失活。其糖化酶最适作用 PH 在 4．O 一 4．6，最适温度为 60 一 65℃。在柠 檬酸发酵条件下，当培养 pH 下降至 2．o 以下时，仍能保持大部分活力。 (3)能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的 Mn2+、Zn2+、Cu2+。 (4)在深层液体发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，菌球体直径为 o．1mm， 菌球量达 104 个／mL 以上。 (5)在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不好，生成小菌落，孢子形 成能力弱。 (6)在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4 +，即 NH4 +库水平 高。 (7)菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。 (8)细胞壁几丁质含量高，但β葡聚糖和聚半乳糖含量低。 (9)在生长和产酸期，细胞内蛋白质、核酸水平低。 (10)具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生 ATP。 五、黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育