实验三基因突变分析(PCR-SSCP) 一、实验目的 1.了解检测PCR-SSCP的基本原理和实验过程。 二、实验用品 垂直板电泳仪、普通电泳仪、紫外透射仪、Eppendorf离心机、离心管、 Tip、微量移液器等。 三、实验原理 DCR.SSCp为CR特术结合单链DNA非变性聚丙搭酷胺凝胶由泳而形 的、检测点突变的、快速而敏感的 一种方法。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 下，单链DNA片段的迁移率主要取决于DNA的空间构象。由于DNA的构 象由组成DNA的碱基顺序所决定，一个碱基的变异足以使其空间构象发生 改变，碱基的异常可通过电泳时DNA区带的迁移速率的差异表现出来。这 种检测碱基变异的方法称为单链构象多态性(single-strand comformation polymorph i sm,SsCp)。 四、实验内容与方法 1.制备10%的中性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为29： 1).其中含5%的甘油，0.375mol/LTri-HC(pH8.8)(或含10%甘油，1×TBE) 凝胶大小为140×150×1m 2.PCR扩增获得待测目 DNA片段 3.上述产物经氯仿抽提去油后，加2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻 颠倒混匀，置冰浴中30分钟。 4.12,000rpm离心15分钟，小心弃去上清液。 5.加70%的乙醇至离心管的1/2处 12,000pm离心2分钟 空抽干（或开盖使残留的液体挥发干） 7.加20l变性上样缓冲液(95%甲酰胶，0.02%溴酚蓝，0.02%二甲基 蓝，1XTBE)重新溶解沉淀的DNA。 8.95℃水浴5分钟后，立即置冰浴中35分钟。 9.取10±1上样于预先制备的10%的中性聚丙烯酰胺胶。 10.室温下100V电泳15小时，电泳缓冲液为1×Tms甘氨酸(50mM Tris,380mM甘 氨酸 pH8.3)( 11.将凝胶（连同支架玻板）浸于含0.5士gml溴乙锭的水中，室温染 色30-45分钟。 12.于紫外透射仪上观察样本与正常对照之间有无泳动速率的改变， 照相保存结果。 五、实验注意事项 1.由于聚丙烯酰胺对溴乙锭有灭活作用，所以溴乙锭染色要求DNA 的上样量要较大， 才能有效检测，这就要求PCR 广增效率要高。 > 7 实验三 基因突变分析(PCR-SSCP) 一、实验目的 1．了解检测 PCR-SSCP 的基本原理和实验过程。 二、实验用品 垂直板电泳仪、普通电泳仪、紫外透射仪、Eppendorf 离心机、离心管、 Tip、微量移液器等。 三、实验原理 PCR-SSCP为PCR技术结合单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳而成 的、检测点突变的、快速而敏感的一种方法。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 下，单链 DNA 片段的迁移率主要取决于 DNA 的空间构象。由于 DNA 的构 象由组成 DNA 的碱基顺序所决定，一个碱基的变异足以使其空间构象发生 改变，碱基的异常可通过电泳时 DNA 区带的迁移速率的差异表现出来。这 种检测碱基变异的方法称为单链构象多态性（single-strand comformation polymorphism,SSCP)。 四、实验内容与方法 1．制备 10%的中性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为 29： 1）。其中含 5%的甘油，0．375 mol/L Tri-HCl(pH8.8)(或含 10%甘油，1×TBE）。 凝胶大小为 140×150 ×1mm3。 2．PCR 扩增获得待测目的 DNA 片段。 3．上述产物经氯仿抽提去油后，加 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻 颠倒混匀，置冰浴中 30 分钟。 4．12,000rpm 离心 15 分钟，小心弃去上清液。 5．加 70%的乙醇至离心管的 1/2 处，12,000 rpm 离心 2 分钟。 6．真空抽干（或开盖使残留的液体挥发干）。 7．加 20μl 变性上样缓冲液（95%甲酰胺，0.02%溴酚蓝，0.02%二甲基 蓝，1×TBE)重新溶解沉淀的 DNA。 8．95℃水浴 5 分钟后，立即置冰浴中 3~5 分钟。 9．取 10±l 上样于预先制备的 10%的中性聚丙烯酰胺胶。 10．室温下 100V 电泳 15 小时，电泳缓冲液为 1×Tris/甘氨酸（50mM Tris,380mM 甘氨酸，pH8.3）（或 1TBE）。 11．将凝胶（连同支架玻板）浸于含 0.5±g/ml 溴乙锭的水中，室温染 色 30~45 分钟。 12．于紫外透射仪上观察样本与正常对照之间有无泳动速率的改变， 照相保存结果。 五、实验注意事项 1．由于聚丙烯酰胺对溴乙锭有灭活作用，所以溴乙锭染色要求 DNA 的上样量要较大，才能有效检测，这就要求 PCR 扩增效率要高