第四章分子遗传学相关实验 实验一 利用TSL从全血中直接制备人类染色体 DNA 一、实验目的 初步掌握人类基因组DNA的提取方法。 二、实验原理 在临床实践和医学遗传学研究过程中，为了进行遗传病患者的基因分析 和基因诊断，必须首先从人体组织中（常以外周血为材料）提取基因组DNA 分子。在细胞核中，DNA分子常与蛋白质结合在一起形成脱氧核糖核蛋白， 即基因组DNA是以核蛋白的形式存在于细胞核中，故从组织提取DNA必 须除去与DNA分子结合的蛋白质和其他物质，同时尽可能保持DNA分子 的完整性。 TLS法是近年来出现的一种提取DNA的较好方法。TLS(三乙醇胺月桂 基硫磺酸盐)是一种较强的表面活性剂，它能迅速地溶解细胞质膜和核膜 故TLS能在较短时间内溶解细胞并能使DNA与蛋白质分离而不必经过蛋白 酶的水解，TS法能简化DNA提取的程序，整个过程能在3小时内完成。 三、实验用品 1.器材：台式高速离心机、Eppendorf试管、真空泵、751分光光度计、 连续可调加样器、加样吸头、废液小烧杯、吸球、吸管、蜡膜、电泳仪、紫 外检测仪、移液管等 2.材料：人外周血 3.试剂：1%TLS、饱和酚液、氯仿、无水乙醇、3moM醋酸钠、70% 乙醇、TE液 4.试剂的配制： 1)1 mol/ITris-HC1液：称Tris碱12L91g,溶于800ml双蒸水中，用浓 HC1周至所需PH值(PH7.4、7.6、8.0的HC1分别是70ml、60ml、42ml), 在调PH值时，应使用溶液冷至室温后方可调，最后定容至1000ml分装后， 高压蒸汽灭菌，若呈黄色，应弃
1 第四章 分子遗传学相关实验 实验一 利用 TSL 从全血中直接制备人类染色体 DNA 一、 实验目的 初步掌握人类基因组 DNA 的提取方法。 二、 实验原理 在临床实践和医学遗传学研究过程中，为了进行遗传病患者的基因分析 和基因诊断，必须首先从人体组织中（常以外周血为材料）提取基因组 DNA 分子。在细胞核中，DNA 分子常与蛋白质结合在一起形成脱氧核糖核蛋白， 即基因组 DNA 是以核蛋白的形式存在于细胞核中，故从组织提取 DNA 必 须除去与 DNA 分子结合的蛋白质和其他物质，同时尽可能保持 DNA 分子 的完整性。 TLS 法是近年来出现的一种提取 DNA 的较好方法。TLS（三乙醇胺月桂 基硫磺酸盐）是一种较强的表面活性剂，它能迅速地溶解细胞质膜和核膜， 故TLS能在较短时间内溶解细胞并能使DNA与蛋白质分离而不必经过蛋白 酶的水解，TLS 法能简化 DNA 提取的程序，整个过程能在 3 小时内完成。 三、 实验用品 1．器材：台式高速离心机、Eppendorf 试管、真空泵、751 分光光度计、 连续可调加样器、加样吸头、废液小烧杯、吸球、吸管、蜡膜、电泳仪、紫 外检测仪、移液管等 2． 材料：人外周血 3． 试剂：1%TLS、饱和酚液、氯仿、无水乙醇、3mol/l 醋酸钠、70% 乙醇、TE 液 4． 试剂的配制： 1）1mol/lTris-HCl 液：称 Tris 碱 121.91g，溶于 800ml 双蒸水中，用浓 HCl 调至所需 PH 值（PH7.4、7.6、8.0 的 HCl 分别是 70ml、60ml、42ml）， 在调 PH 值时，应使用溶液冷至室温后方可调，最后定容至 1000ml 分装后， 高压蒸汽灭菌，若呈黄色，应弃
2)0.5 nol/EDTA液：称取冰乙二胺四乙酸二钠(EDTA-N2·2H20) 186.1g,溶于800ml双蒸水中，在磁力搅拌器上均匀，用NaOH调节的PH 至8.0（约需20gNa0H颗粒），然后等定容至1000ml分装后灭菌备用。 3)TE溶液：1 MTris-.LC11ml、0.5 M EDTA0.2ml,加水至100ml。 4)ACD:枸橼酸1.6g柠檬酸钠4.4g,单分子葡萄糖4.9g加水至200ml (然后高压灭菌)。 5)NaAC(3mol/L):NaAC·2HO10.8g,H020ml溶解后用冰乙酸调 至PH5.2,定溶至100ml,高压灭菌。 6)Tris-HC1饱和重蒸酚溶液(PH8.0):取50ml重蒸酚置于65℃会融 化后加入等体积的1 mol/LTris-HC1(PH8.0)缓冲液，充分混匀后置于4C冰 箱中静置6小时以上，待充分分层（酚在下，水在上），吸弃上层多余的水 相，冰箱保存备用。 7)加样缓冲液：溴酚蓝0.25g溶于70ml水中，加30ml甘油混匀，4℃ 保存。 8)溴乙锭(10mg/ml):称取100mg溴乙锭溶于10ml水中，4℃保存。 (每100ml1×TBE凝胶中加5ul,终浓度为0.5μgml)。 9)5×TBE电泳缓冲液：Tris54g,跚酸27.5g,0.5 M EDTA(PH8.0)20ml 加双蒸水至100ml。 10)1%琼脂糖凝胶：琼脂糖1g,5×TBE20ml加双蒸水至100ml, 加热溶解，温度降至55℃时，加溴乙锭。 四、实验内容与步骤 1.取人外周血1ml加到含有0.1 mlACD的离心管中，加5倍体积蒸 馏水，在0℃下放置10分钟。 2.8000pm离心10分钟，弃上清，留管底白细胞沉淀物。 3.加300ul1%TLS,轻轻混匀，50℃或室温下放置20分钟。 4.加1ml饱和酚轻轻充分混匀，呈乳白色。 5.10000pm离心5-10分钟。 6,取上清（管中液体分三层：上清液中含有DNA,中层白色物质为 蛋白质，底层为酚)加入另一新管中，再加饱和酚（等体积）抽提12次， 万法同4、5。 7.取上清，加24：1（氯仿、异丙醇）1m两次，方法同4、5。 8.取上清加入到1.5 ml Eppendorf管中，再加80μl,3 mol/LNaAC (pH5.2)混匀。 9.加Iml冷无水乙醇缓慢混匀，可见DNA纤维沉淀成DNA小块， 12000rpm离心10分钟 10.弃上清，管口敞开，使乙醇挥发干净，或真空抽干去醇
2 2）0.5mol/lEDTA 液：称取冰乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O） 186.1g，溶于 800ml 双蒸水中，在磁力搅拌器上均匀，用 NaOH 调节的 PH 至 8.0（约需 20g NaOH 颗粒），然后等定容至 1000ml 分装后灭菌备用。 3)TE 溶液：.1MTris-LCl 1ml、0.5M EDTA 0.2ml，加水至 100ml。 4）ACD：枸橼酸 1.6g 柠檬酸钠 4.4g，单分子葡萄糖 4.9g 加水至 200ml （然后高压灭菌）。 5）NaAC（3mol/L）：NaAC·2H2O10.8g，H2O20ml 溶解后用冰乙酸调 至 PH5.2，定溶至 100ml，高压灭菌。 6）Tris-HCl 饱和重蒸酚溶液（PH8.0）：取 50ml 重蒸酚置于 65℃会融 化后加入等体积的 1mol/LTris-HCl（PH8.0）缓冲液，充分混匀后置于 4℃冰 箱中静置 6 小时以上，待充分分层（酚在下，水在上），吸弃上层多余的水 相，冰箱保存备用。 7）加样缓冲液：溴酚蓝 0.25g 溶于 70ml 水中，加 30ml 甘油混匀，4℃ 保存。 8）溴乙锭（10mg/ml）：称取 100mg 溴乙锭溶于 10ml 水中，4℃保存。 （每 100ml 1×TBE 凝胶中加 5μl，终浓度为 0.5μg/ml）。 9）5×TBE 电泳缓冲液：Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5M EDTA(PH8.0)20ml 加双蒸水至 100ml。 10）1%琼脂糖凝胶：琼脂糖 1g，5×TBE 20ml 加双蒸水至 100ml， 加热溶解，温度降至 55℃时，加溴乙锭。 四、 实验内容与步骤 1． 取人外周血 1ml 加到含有 0.1mlACD 的离心管中，加 5 倍体积蒸 馏水，在 0℃下放置 10 分钟。 2． 8000rpm 离心 10 分钟，弃上清，留管底白细胞沉淀物。 3． 加 300μl 1%TLS,轻轻混匀，50℃或室温下放置 20 分钟。 4． 加 1ml 饱和酚轻轻充分混匀，呈乳白色。 5． 10000rpm 离心 5-10 分钟。 6． 取上清（管中液体分三层：上清液中含有 DNA，中层白色物质为 蛋白质，底层为酚）加入另一新管中，再加饱和酚（等体积）抽提 1-2 次， 方法同 4、5。 7． 取上清，加 24：1（氯仿、异丙醇）1ml 两次，方法同 4、5。 8． 取上清加入到 1.5ml Eppendorf 管中，再加 80μl，3mol/L NaAC （pH5.2）混匀。 9． 加 1ml 冷无水乙醇缓慢混匀，可见 DNA 纤维沉淀成 DNA 小块， 12000rpm 离心 10 分钟 10．弃上清，管口敞开，使乙醇挥发干净，或真空抽干去醇
11.加40如lTE溶液，溶解DNA2-3天，可用于电泳，（亦可用蜡膜封 口，4℃保存)。 12.取2l的加样缓冲液于蜡膜上，再加入10uDNA溶液，混匀。 13.80V预电泳20分钟，然后将以上混合液注入凝胶板的样品孔内， 电泳约1小时。 14.在紫外灯下观察电泳结果。 五、作业与思考 1.本实验中的注意事项有哪些 2.实验原理的要点是什么？ (赵静)
3 11．加 40μl TE 溶液，溶解 DNA2-3 天，可用于电泳，（亦可用蜡膜封 口，4℃保存）。 12．取 2μl 的加样缓冲液于蜡膜上，再加入 10μlDNA 溶液，混匀。 13．80V 预电泳 20 分钟，然后将以上混合液注入凝胶板的样品孔内， 电泳约 1 小时。 14． 在紫外灯下观察电泳结果。 五、 作业与思考 1． 本实验中的注意事项有哪些？ 2． 实验原理的要点是什么？ （赵静）
实验二 外周血基因组DNA的提取 一、实验目的 掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。 二、实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决 条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干 净，②尽可能保持DNA分子的完整。 三、实验用品 离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱。 四、实验内容与方法 (一)方法一 1.加900ul细胞裂解液与一个消毒的1.5ml离心管中。 2.抽取外周血（防凝），轻摇，使血液完全混匀，然后将300如l血液 转移到盛有细胞裂解液的离心管内，颠倒5-6次混匀。 3.室温放置10分钟（其间颠倒2~3次）以裂解红细胞，以13000-16000 pm室温下离心20秒。 4.尽可能地移弃上清液，约留10-20如l沉淀在管底。 注：如果一些红细胞或碎片摻杂在白细胞中，可以加等量细胞裂解 液重复3-4。 5.剧烈混匀（用振荡器震荡，或用移液器吹起），至白细胞重新悬起。 6.加入300u核裂解液，混匀5-6次以助分散DNA。溶液应很粘。如 细胞仍呈块状，37℃水浴至细胞块碎裂。如1小时后仍呈块状，加100u核 裂解液重复水浴。 7.可选。加1.5μIRNase液于核溶解产物中，混匀2-5次，将混匀物37℃ 水浴15分钟，然后冷至室温。 8.加100d蛋白沉淀液，刷烈摇晃10-20秒，小的蛋白质块应能看到。 9.13000-16000pm离心3分钟，室温，暗褐色的蛋白质沉淀应能看到。 10.上清液移到含300ul室温异丙醇的1.5ml离心管中。 11.轻轻颠倒离心管，可看到絮状沉淀。 12.13000-16000rpm离心1分钟，室温DNA成沉淀状。 13.轻轻倒出上清，加入300u室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管，离心 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥DNA10-15 分钟。 14.用最小的吸头抽吸去乙醇（一定要避免抽取DNA沉淀，因为此时 DNA沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥DNA
4 实验二 外周血基因组 DNA 的提取 一、 实验目的 掌握人外周血基因组 DNA 的抽提方法。 二、 实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的 DNA 是进行基因诊断的先决 条件。制备高质量 DNA 的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干 净，②尽可能保持 DNA 分子的完整。 三、实验用品 离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱。 四、实验内容与方法 （一）方法一 1．加 900μl 细胞裂解液与一个消毒的 1.5ml 离心管中。 2．抽取外周血（防凝），轻摇，使血液完全混匀，然后将 300μl 血液 转移到盛有细胞裂解液的离心管内，颠倒 5-6 次混匀。 3．室温放置 10 分钟（其间颠倒 2~3 次）以裂解红细胞，以 13000-16000 rpm 室温下离心 20 秒。 4．尽可能地移弃上清液，约留 10-20μl 沉淀在管底。 注：如果一些红细胞或碎片掺杂在白细胞中，可以加等量细胞裂解 液重复 3-4。 5．剧烈混匀（用振荡器震荡，或用移液器吹起），至白细胞重新悬起。 6．加入 300μl 核裂解液，混匀 5-6 次以助分散 DNA。溶液应很粘。如 细胞仍呈块状，37℃水浴至细胞块碎裂。如 1 小时后仍呈块状，加 100μl 核 裂解液重复水浴。 7．可选。加 1.5μlRNase 液于核溶解产物中，混匀 2-5 次，将混匀物 37℃ 水浴 15 分钟，然后冷至室温。 8．加 100μl 蛋白沉淀液，剧烈摇晃 10-20 秒，小的蛋白质块应能看到。 9．13000-16000 rpm 离心 3 分钟，室温，暗褐色的蛋白质沉淀应能看到。 10．上清液移到含 300μl 室温异丙醇的 1.5ml 离心管中。 11．轻轻颠倒离心管，可看到絮状沉淀。 12．13000-16000 rpm 离心 1 分钟，室温 DNA 成沉淀状。 13．轻轻倒出上清，加入 300μl 室温 70%乙醇，轻轻颠倒离心管，离心 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥 DNA 10-15 分钟。 14．用最小的吸头抽吸去乙醇（一定要避免抽取 DNA 沉淀，因为此时 DNA 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥 DNA
10-15分钟) 15.加入100uDNA水化溶剂，65度1小时，其间不断敲击管子以助 均匀或者室温或4度过夜即可。 16.2-8度保存。 注：采血需用EDTA或肝素抗凝。 (二)方法二 以处理100ul全血为例。 1.按处理样品数准备1.5ml离心管，并各加入GenTLESolutionI500l。 2.把混合均匀的l00ul血液，加入到分装好GenTLE Solution I的离心管 中，立即振荡数秒钟*1。 1不管处理多少样品，血液加入到GenTLE Solutionl中，要立即 进行振荡混合，否则有可能降低收量。 3.室温放置10分钟以上，然后在室温2条件下12,000rpm以上离心5 分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳 朵朝上（图4-I)。此时几乎看不到DNA沉淀。 2若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于20℃以上离心。 4.用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带 小耳朵一侧)的内壁上，除去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧 的内壁，应插到离心管内侧的底部（图4-2），注意不要吸走沉淀物。 5.加入lml的GenTLE SolutionⅡ，此时GenTLE SolutionⅡ应沿着离心 管内侧的内壁加入到离心管中（图43）。 图4-1 图4-2 图4-3 6.轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温12,000rpm以上离心2分钟，用 移液枪小心地除去上清溶液（方法参见实验操作4.）。 3剧烈振荡将影响收量和纯度。 7.向离心管中加入GenTLE Solution III500ul,轻微振荡10秒钟充分混 合。 8.室温12,000pm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管 中。 9.加入等体积(500u)的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合
5 图 4-1 图 4-2 图 4-3 10-15 分钟） 15．加入 100μlDNA 水化溶剂，65 度 1 小时，其间不断敲击管子以助 均匀或者室温或 4 度过夜即可。 16．2-8 度保存。 注：采血需用 EDTA 或肝素抗凝。 （二）方法二 以处理 100μl 全血为例。 1.按处理样品数准备 1.5ml 离心管，并各加入 GenTLESolutionI 500μl。 2.把混合均匀的 100μl 血液，加入到分装好 GenTLE Solution I 的离心管 中，立即振荡数秒钟*1。 *1 不管处理多少样品，血液加入到 GenTLE SolutionI 中，要立即 进行振荡混合, 否则有可能降低收量。 3.室温放置 10 分钟以上，然后在室温*2 条件下 12,000 rpm 以上离心 5 分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳 朵朝上（图 4-1)。此时几乎看不到 DNA 沉淀。 *2 若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于 20℃以上离心。 4.用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带 小耳朵一侧）的内壁上，除去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧 的内壁，应插到离心管内侧的底部（图 4-2)，注意不要吸走沉淀物。 5.加入 1 ml 的 GenTLE Solution II。此时 GenTLE Solution II 应沿着离心 管内侧的内壁加入到离心管中（图 4-3)。 6.轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温 12,000 rpm 以上离心 2 分钟，用 移液枪小心地除去上清溶液（方法参见实验操作 4.)。 *3 剧烈振荡将影响收量和纯度。 7.向离心管中加入 GenTLE Solution III 500μl，轻微振荡 10 秒钟充分混 合。 8.室温 12,000rpm 以上离心 5 分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管 中。 9.加入等体积（500μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合
10.4℃、12,000rpm离心5分钟，小心除去上清溶液*4。 *4 Gen'TLE SolutionIⅢ中含有影响酶反应的物质，所以一定要除净 上清溶液，但应注意不要吸走沉淀物。 11.加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4C、12,000rpm离心5分钟，小心 地除去上清溶液（方法参见*4）。 12.干燥沉淀*5。 *5请简单干燥，因为沉淀过于干燥时DNA很难溶解。 13.根据下一步实验需要，用10-50ul适当的缓冲液（例如TE Buffer 等)溶解沉淀。 五、作业与思考 3.离心机使用时应注意哪些问题？ 2.本实验的主要步骤有哪些？ (赵静
6 10.4℃、12,000 rpm 离心 5 分钟，小心除去上清溶液*4。 *4 GenTLE SolutionIII 中含有影响酶反应的物质，所以一定要除净 上清溶液，但应注意不要吸走沉淀物。 11.加入 1 ml 的 70%乙醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm 离心 5 分钟，小心 地除去上清溶液 (方法参见*4)。 12.干燥沉淀*5。 *5 请简单干燥，因为沉淀过于干燥时 DNA 很难溶解。 13.根据下一步实验需要，用 10~ 50μl 适当的缓冲液（例如 TE Buffer 等）溶解沉淀。 五、作业与思考 3． 离心机使用时应注意哪些问题？ 2. 本实验的主要步骤有哪些？ （赵静）
实验三基因突变分析(PCR-SSCP) 一、实验目的 1.了解检测PCR-SSCP的基本原理和实验过程。 二、实验用品 垂直板电泳仪、普通电泳仪、紫外透射仪、Eppendorf离心机、离心管、 Tip、微量移液器等。 三、实验原理 DCR.SSCp为CR特术结合单链DNA非变性聚丙搭酷胺凝胶由泳而形 的、检测点突变的、快速而敏感的 一种方法。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 下，单链DNA片段的迁移率主要取决于DNA的空间构象。由于DNA的构 象由组成DNA的碱基顺序所决定，一个碱基的变异足以使其空间构象发生 改变，碱基的异常可通过电泳时DNA区带的迁移速率的差异表现出来。这 种检测碱基变异的方法称为单链构象多态性(single-strand comformation polymorph i sm,SsCp)。 四、实验内容与方法 1.制备10%的中性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为29： 1).其中含5%的甘油，0.375mol/LTri-HC(pH8.8)(或含10%甘油，1×TBE) 凝胶大小为140×150×1m 2.PCR扩增获得待测目 DNA片段 3.上述产物经氯仿抽提去油后，加2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻 颠倒混匀，置冰浴中30分钟。 4.12,000rpm离心15分钟，小心弃去上清液。 5.加70%的乙醇至离心管的1/2处 12,000pm离心2分钟 空抽干（或开盖使残留的液体挥发干） 7.加20l变性上样缓冲液(95%甲酰胶，0.02%溴酚蓝，0.02%二甲基 蓝，1XTBE)重新溶解沉淀的DNA。 8.95℃水浴5分钟后，立即置冰浴中35分钟。 9.取10±1上样于预先制备的10%的中性聚丙烯酰胺胶。 10.室温下100V电泳15小时，电泳缓冲液为1×Tms甘氨酸(50mM Tris,380mM甘 氨酸 pH8.3)( 11.将凝胶（连同支架玻板）浸于含0.5士gml溴乙锭的水中，室温染 色30-45分钟。 12.于紫外透射仪上观察样本与正常对照之间有无泳动速率的改变， 照相保存结果。 五、实验注意事项 1.由于聚丙烯酰胺对溴乙锭有灭活作用，所以溴乙锭染色要求DNA 的上样量要较大， 才能有效检测，这就要求PCR 广增效率要高。 >
7 实验三 基因突变分析(PCR-SSCP) 一、实验目的 1．了解检测 PCR-SSCP 的基本原理和实验过程。 二、实验用品 垂直板电泳仪、普通电泳仪、紫外透射仪、Eppendorf 离心机、离心管、 Tip、微量移液器等。 三、实验原理 PCR-SSCP为PCR技术结合单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳而成 的、检测点突变的、快速而敏感的一种方法。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 下，单链 DNA 片段的迁移率主要取决于 DNA 的空间构象。由于 DNA 的构 象由组成 DNA 的碱基顺序所决定，一个碱基的变异足以使其空间构象发生 改变，碱基的异常可通过电泳时 DNA 区带的迁移速率的差异表现出来。这 种检测碱基变异的方法称为单链构象多态性（single-strand comformation polymorphism,SSCP)。 四、实验内容与方法 1．制备 10%的中性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为 29： 1）。其中含 5%的甘油，0．375 mol/L Tri-HCl(pH8.8)(或含 10%甘油，1×TBE）。 凝胶大小为 140×150 ×1mm3。 2．PCR 扩增获得待测目的 DNA 片段。 3．上述产物经氯仿抽提去油后，加 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻 颠倒混匀，置冰浴中 30 分钟。 4．12,000rpm 离心 15 分钟，小心弃去上清液。 5．加 70%的乙醇至离心管的 1/2 处，12,000 rpm 离心 2 分钟。 6．真空抽干（或开盖使残留的液体挥发干）。 7．加 20μl 变性上样缓冲液（95%甲酰胺，0.02%溴酚蓝，0.02%二甲基 蓝，1×TBE)重新溶解沉淀的 DNA。 8．95℃水浴 5 分钟后，立即置冰浴中 3~5 分钟。 9．取 10±l 上样于预先制备的 10%的中性聚丙烯酰胺胶。 10．室温下 100V 电泳 15 小时，电泳缓冲液为 1×Tris/甘氨酸（50mM Tris,380mM 甘氨酸，pH8.3）（或 1TBE）。 11．将凝胶（连同支架玻板）浸于含 0.5±g/ml 溴乙锭的水中，室温染 色 30~45 分钟。 12．于紫外透射仪上观察样本与正常对照之间有无泳动速率的改变， 照相保存结果。 五、实验注意事项 1．由于聚丙烯酰胺对溴乙锭有灭活作用，所以溴乙锭染色要求 DNA 的上样量要较大，才能有效检测，这就要求 PCR 扩增效率要高
2.要求扩增特异性要高，无非特异性片段产生，避免假阳性。 3.上样时，样本与正常对照相间排列，以便于分辩。 4.PCR最好纯化以去除盐及其它成分，使单链DNA更易形成稳定的 构象以提高分辨率。 六、作业与思考 1.PCR原理是什么？ 2.PCR.SSCP原理是什么？ 3.PCR-SSCP方法的优缺点有哪些？ (赵静)
8 2．要求扩增特异性要高，无非特异性片段产生，避免假阳性。 3．上样时，样本与正常对照相间排列，以便于分辩。 4．PCR 最好纯化以去除盐及其它成分，使单链 DNA 更易形成稳定的 构象以提高分辨率。 六、作业与思考 1．PCR 原理是什么？ 2．PCR-SSCP 原理是什么？ 3．PCR-SSCP 方法的优缺点有哪些？ （赵静）
实验四质粒DNA的提取 一、目的要求 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的方法。 二、实验原理 质粒是独立于染色体外能进行自主复制的双链环状的DNA,大小在 1~200kb之间。质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（抗氨苄青霉素、抗四 环素等)，因而被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性。 从宿主中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能。分 离质粒DNA有三个步骤：1.培养细菌使质粒扩增。2.收集和裂解细菌。 3.分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法有很多，目 前常用的有碱裂解法，煮沸法，SDS法和羟基磷灰石层析法等。 本次实验用的是碱裂解法。其优点是得率高，适合于大多数的菌株，所 得的产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。碱变性提取质粒DNA是 依据染色体DNA与质粒的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH介 于12.0-12.5这个狭窄的范围内（变性液），线性的染色体DNA的氢键断裂， 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下质粒DNA的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，仍然缠绕在一起 不分开：当以pH48的乙酸钾高盐缓冲液（中和液）恢复pH至中性时，共 价闭合的环状质粒DNA的两条互补链恢复原来的构型，即双链结构，而保 存在溶液中。而染色体不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，大部分 的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质一一SDS复合物等细胞碎 片缠绕在一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清液中。可以通过酚 氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三、 实验用品 (一)仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机 (二)试剂 1.LB液体培养基 2.溶液I: 50mmol/L 葡萄糖 25mmo1/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HC1(pH8.0) 10mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) 3.溶液Ⅱ 0.4mo1/LNa0H,2%SDS,用时等体积混合，现用现配 4.溶液Ⅲ
9 实验四 质粒 DNA 的提取 一、 目的要求 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的方法。 二、 实验原理 质粒是独立于染色体外能进行自主复制的双链环状的 DNA，大小在 1~200kb 之间。质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（抗氨苄青霉素、抗四 环素等），因而被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性。 从宿主中提取质粒 DNA，是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。分 离质粒 DNA 有三个步骤：1. 培养细菌使质粒扩增。2. 收集和裂解细菌。 3. 分离和纯化质粒 DNA。从大肠杆菌中分离质粒 DNA 的方法有很多，目 前常用的有碱裂解法，煮沸法，SDS 法和羟基磷灰石层析法等。 本次实验用的是碱裂解法。其优点是得率高，适合于大多数的菌株，所 得的产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。碱变性提取质粒 DNA 是 依据染色体 DNA 与质粒的变性与复性的差异而达到分离的目的。在 pH 介 于 12.0~12.5 这个狭窄的范围内（变性液），线性的染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下质粒 DNA 的大部分氢键也 断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，仍然缠绕在一起 不分开；当以 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液（中和液）恢复 pH 至中性时，共 价闭合的环状质粒 DNA 的两条互补链恢复原来的构型，即双链结构，而保 存在溶液中。而染色体不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，大部分 的染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质——SDS 复合物等细胞碎 片缠绕在一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA 留在上清液中。可以通过酚、 氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。 三、 实验用品 （一） 仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机。 （二） 试剂 1. LB 液体培养基 2. 溶液Ⅰ： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris） Tris-HCl(pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）(pH8.0) 3. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH,2% SDS,用时等体积混合，现用现配。 4. 溶液Ⅲ
5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 5.TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCI (pH8.0) 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 6.无水乙醇、异戊醇 7.70%乙醇 8.RNA酶 9.酚、氯仿、异戊醇等 四、实验内容与方法 1.用灭菌牙签或接种环挑取转化有质粒的单菌落于加有2mL相应抗 生素的LB液体培养基的试管中，37℃，150rpm振荡培养过夜。 2.取1.5ml的培养物转入到离心管中，4,000rpm离心2分钟收集菌 体。 3.吸去培养液，尽可能的去除培养液（否则容易降低质粒DNA的收量）。 4.加入100μL的溶液1，蜗旋振荡悬浮沉淀的菌体，室温放置10分 钟。 5.加入200μL的溶液Ⅱ（新鲜配置），盖紧离心管盖，上下颠倒混匀， 冰上放置5分钟，至菌液变清。 6.加入150μL溶液Ⅲ，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，冰上放置10 分钟。 7.12,000pm离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。 8.向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，反复混 匀后，12,000pm离心5分钟，将上清转移到新的离心管中。 9.向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀， 12,000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管中。 10.向上清液中加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀后室 温放置5~10分钟，12,000pm离心5分钟。倒去上清液，把离心管倒扣在 吸水纸上，吸干液体。 11.用1mL的70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，5,000rpm离心5分钟。 一般再重复一次。 12.将沉淀干燥（否则电泳点样时容易上飘，也不要太干燥，否则DNA 不容易溶解)。溶解于20μLTE(含有20μgmL的RNase)中，使DNA完 全溶解后，-20℃保存。 五、作业与思考
10 5mol/L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 5. TE 缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 6. 无水乙醇、异戊醇 7. 70%乙醇 8. RNA 酶 9. 酚、氯仿、异戊醇等 四、 实验内容与方法 1. 用灭菌牙签或接种环挑取转化有质粒的单菌落于加有 2mL 相应抗 生素的 LB 液体培养基的试管中，37℃，150rpm 振荡培养过夜。 2. 取 1.5mL 的培养物转入到离心管中，4,000rpm 离心 2 分钟收集菌 体。 3. 吸去培养液，尽可能的去除培养液（否则容易降低质粒DNA的收量）。 4. 加入 100μL 的溶液Ⅰ，蜗旋振荡悬浮沉淀的菌体，室温放置 10 分 钟。 5. 加入 200μL 的溶液Ⅱ（新鲜配置），盖紧离心管盖，上下颠倒混匀， 冰上放置 5 分钟，至菌液变清。 6. 加入 150μL 溶液Ⅲ，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀，冰上放置 10 分钟。 7. 12,000rpm 离心 10 分钟，将上清液转移至新的离心管中。 8. 向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），反复混 匀后，12,000rpm 离心 5 分钟，将上清转移到新的离心管中。 9. 向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀， 12,000rpm 离心 5 分钟，将上清转移到新的离心管中。 10. 向上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，混匀后室 温放置 5~10 分钟，12,000rpm 离心 5 分钟。倒去上清液，把离心管倒扣在 吸水纸上，吸干液体。 11. 用 1mL 的 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，5,000rpm 离心 5 分钟。 一般再重复一次。 12. 将沉淀干燥（否则电泳点样时容易上飘，也不要太干燥，否则 DNA 不容易溶解）。溶解于 20μLTE（含有 20μg/mL 的 RNase）中，使 DNA 完 全溶解后，-20 ℃保存。 五、 作业与思考