第六章分子细胞遗传学相关实验 实验一 荧光原位杂交技术 一、实验目的 1熟悉荧光原位杂交技术的原理和方法， 2熟悉荧光原位杂交技术的应用。 二、实验原理 经对探针和靶DNA变性处理成单链后，用生物素标记的核苷酸探针与 间期核内或染色体上的靶DNA进行原位杂交，再用荧光标记的生物素亲和 蛋白和抗亲和蛋白的抗体作用，使探针杂交区信号放大发出荧光，可用荧光 显微镜检测，以确定DNA或基因或染色体是否有异常。目前，该技术已厂 泛用于动植物基因组结构研究、临床医学中基因、染色体异常的检测和研究 肿瘤遗传学的研究等方面。 三、器材与试剂 1.器材：荧光显微镜、烤箱、恒温培养箱、冰箱、水浴箱（两个）、Eppendorf 离心机、染缸（至少12个人加样枪(1~20μL,10100μ1,100-1000μ1）、避 光杂交盒、盖玻片、计时器、塑料盖玻片或塑料薄膜、镊子、钻石笔、浮漂。 2.试剂： (1)试剂盒成分 主要成分：探针5人份，探针位置Yq12 I:杂交液60μ1，：BlockingI1200L,Ⅲ：FITC-avidin1200μl V:BlockingⅡ600ul,V:Anti-avidin600μl,M:PW/antifade80μl 试剂盒中未包括的试剂：甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、土温20、Rubber Cement、乙醇。 (2)荧光原位杂交相关溶液的配制： 1.70%甲酰胺/2×SSC:35ml甲酰胺，5ml20×SSC,10m1水，混匀。 2.50%甲酰胺/2×SSC:100ml甲酰肢，20ml20×SSC,80ml水，混匀，分 装在4个染缸中。 3.洗脱液：90m120×SSC,加水至450ml,加土温20450μ1，混匀， 每次洗脱倒出150ml,分装在3个染缸中。 4.20×SSC:氯化钠175.3克，柠檬酸钠88.2克，定溶至1000ml蒸馏
1 第六章 分子细胞遗传学相关实验 实验一 荧光原位杂交技术 一、实验目的 1.熟悉荧光原位杂交技术的原理和方法。 2.熟悉荧光原位杂交技术的应用。 二、实验原理 经对探针和靶 DNA 变性处理成单链后，用生物素标记的核苷酸探针与 间期核内或染色体上的靶 DNA 进行原位杂交，再用荧光标记的生物素亲和 蛋白和抗亲和蛋白的抗体作用，使探针杂交区信号放大发出荧光，可用荧光 显微镜检测，以确定 DNA 或基因或染色体是否有异常。目前，该技术已广 泛用于动植物基因组结构研究、临床医学中基因、染色体异常的检测和研究、 肿瘤遗传学的研究等方面。 三、器材与试剂 1.器材：荧光显微镜、烤箱、恒温培养箱、冰箱、水浴箱（两个）、Eppendorf 离心机、染缸（至少 12 个）、加样枪（1~20μl,10~100μl,100~1000μl）、避 光杂交盒、盖玻片、计时器、塑料盖玻片或塑料薄膜、镊子、钻石笔、浮漂。 2.试剂： （1）试剂盒成分 主要成分：探针 5 人份，探针位置 Yq12 Ⅰ：杂交液 60μl ，Ⅱ：BlockingⅠ1200μl, Ⅲ：FITC-avidin 1200μl, Ⅳ：Blocking Ⅱ600μl, Ⅴ：Anti-avidin600μl ,Ⅵ：PI/antifade80μl 试剂盒中未包括的试剂：甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、土温 20、Rubber Cement、乙醇。 （2）荧光原位杂交相关溶液的配制： 1.70%甲酰胺/2×SSC:35ml 甲酰胺,5ml 20×SSC,10ml 水，混匀。 2.50%甲酰胺/2×SSC:100ml 甲酰胺,20ml 20×SSC,80ml 水，混匀，分 装在 4 个染缸中。 3.洗脱液：90ml20×SSC，加水至 450ml，加土温 20 450μl，混匀， 每次洗脱倒出 150ml，分装在 3 个染缸中。 4. 20×SSC：氯化钠 175.3 克，柠檬酸钠 88.2 克，定溶至 1000ml 蒸馏
水中(PH7.0),高压灭菌贮存。 5.1×SSC:7.5ml的20×SSC,加水至150ml混匀，分装在3个染缸 中。 6.2×SSC:10m120×SSC加水至100ml混匀，分二次用。 四、内容与方法 (一)划定杂交区在显微镜下观察整个标本，用钻石笔在标本背面 划定一个或几个细胞及染色体好的区域作为杂交区（整个风域不大于 22mm2)。 (二)烤片杂交标本于5560℃烤片2小时（预杂交的标本制片后在 室温放2周即转入-20℃保存，片龄超过1个月的标本烤一个小时即可) (三)变性液及杂交盒的预热将装有70%甲酰胺/2×SSC变性液的染 缸放入75℃水浴中预热，将杂交盒加入少量蒸馏水放入37℃恒温箱。 (四)探针变性重复序列探针：在探针中加入8μ1I液，混匀，稍 离心，插在浮漂上于75℃变性5分钟，立即0℃10分钟。 (五)玻片标本变性 1.将已烤片的标本置于68-70℃的70%甲酰胺2×SSC中变性1-2分钟。 2.立即按顺序将标本经70%、90%、100%冷乙醇系列脱水各5分钟，室 温干燥。 (六)原位杂交将DNA探针滴于己变性并脱水的玻片标本的杂交区 域上，盖上盖玻片，Rubber Cement封片，置于潮湿杂交盒中37C杂交过夜 (约15-17小时)。 (七)洗脱、免疫荧光检测与信号放大杂交次日，提前将配制的4 缸50%甲酰胺/2×SSC和3缸1×SSC放入水浴中预热(42-50℃)。 1.待缸内温度达到洗脱所需温度时将标本从37℃温箱中取出，用手按 住盖玻片去掉封片胶。 2.42-50℃，将玻片直接放入装有50%甲酰胺/2×SSC的染缸中，让盖 玻片自然滑脱，脱落后开始计时，每次5分钟，依次洗涤4次。 3.42-50℃，于1×sC中依次洗涤3次，每次5分钟。 4.肢片移至室温2×SSC平衡，(1分钟即可)。 5.将用过的3缸1×SSC倒掉，换成配好的洗脱液，放入水浴中预热 6.将玻片从2×SSC中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体。 7.加80-100u1Ⅱ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中37℃ 温有15分钟。 8.取出片子，去膜，直接在原片上加80-100μ1液于标本的杂交区域 上，盖上塑料薄膜，杂交盒中37℃继续温育40分钟。 9.取出标本，去掉塑料薄膜，42-50℃于洗脱液中洗涤3次，每次5分 钟。 2
2 水中（PH7.0），高压灭菌贮存。 5. 1×SSC：7.5ml 的 20×SSC，加水至 150ml 混匀，分装在 3 个染缸 中。 6. 2×SSC:10ml20×SSC 加水至 100ml 混匀，分二次用。 四、内容与方法 （一）划定杂交区 在显微镜下观察整个标本，用钻石笔在标本背面 划定一个或几个细胞及染色体好的区域作为杂交区（整个区域不大于 22mm2）。 （二）烤片 杂交标本于 55~60℃烤片 2 小时（预杂交的标本制片后在 室温放 2 周即转入-20℃保存，片龄超过 1 个月的标本烤一个小时即可）。 （三）变性液及杂交盒的预热 将装有 70%甲酰胺/2×SSC 变性液的染 缸放入 75℃水浴中预热，将杂交盒加入少量蒸馏水放入 37℃恒温箱。 （四）探针变性 重复序列探针：在探针中加入 8μlⅠ液，混匀，稍 离心，插在浮漂上于 75℃变性 5 分钟，立即 0℃10 分钟。 （五）玻片标本变性 1.将已烤片的标本置于68-70℃的70%甲酰胺/2×SSC中变性1-2分钟。 2.立即按顺序将标本经 70%、90%、100%冷乙醇系列脱水各 5 分钟，室 温干燥。 （六）原位杂交 将 DNA 探针滴于已变性并脱水的玻片标本的杂交区 域上，盖上盖玻片，Rubber Cement 封片，置于潮湿杂交盒中 37℃杂交过夜 （约 15-17 小时）。 （七）洗脱、免疫荧光检测与信号放大 杂交次日，提前将配制的 4 缸 50%甲酰胺/2×SSC 和 3 缸 1×SSC 放入水浴中预热（42-50℃）。 1.待缸内温度达到洗脱所需温度时将标本从 37℃温箱中取出，用手按 住盖玻片去掉封片胶。 2. 42-50℃，将玻片直接放入装有 50%甲酰胺/2×SSC 的染缸中，让盖 玻片自然滑脱，脱落后开始计时，每次 5 分钟，依次洗涤 4 次。 3. 42-50℃，于 1×SSC 中依次洗涤 3 次，每次 5 分钟。 4.玻片移至室温 2×SSC 平衡，（1 分钟即可）。 5.将用过的 3 缸 1×SSC 倒掉，换成配好的洗脱液，放入水浴中预热。 6.将玻片从 2×SSC 中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体。 7.加 80-100ulⅡ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃ 温育 15 分钟。 8.取出片子，去膜，直接在原片上加 80-100μlⅢ液于标本的杂交区域 上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃继续温育 40 分钟。 9.取出标本，去掉塑料薄膜，42-50℃于洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 分 钟
10.将玻片从洗脱液中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体。 11.加80-100μ1Ⅳ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃温育15分钟。 12.将3缸用过的洗脱液倒掉，换成为用过的洗脱液，放入水浴中预 执。 13.加80-100μ1V液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃继续温育40分钟。 14.取出标本，去掉塑料薄膜，置于42-50℃洗脱液中洗涤3次，每次 5分钟。 15。将玻片从洗脱液中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体 16.加80-100μ1Ⅱ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃温育15分钟。 17.将3缸用过的洗脱液倒掉，换成未用过的洗脱液，放入水浴中预 热。 18.加80-100μ1Ⅲ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃继续温育40分钟。 19.取出标本，去掉塑料薄膜，置于42-50℃洗脱液中洗涤3次，每次 5分钟。再于室温2×SSC中平衡一下。 20.玻片从中取出，竖直立在纸上晾干，加12-15μ1M液复染，盖上盖 玻片，荧光显微镜下观察结果。 (八)结果判定低倍镜下用看P(红色)的激发块找到红色的染色体 及细胞，换成油镜，用微调调清楚，再更换看FTC(绿色)的激发块观察 绿色信号（不看时随时关上荧光，以防止信号淬灭，看完后请放-20℃避光 保存片子)。 注意事项： 1本方法适用于外周血标本，如羊水或其他标本应做好杂交前预处理 2.片子变性时间由制片后时间长短而定，制片时间越长变性时间越长。 3变性及洗脱时应量取染缸内液体的温度。洗脱过程中片子勿干，以免 增加背景。 4试剂每次使用前应充分混匀，应尽量减少反复冻融次数，一经起用可 放在4℃，FITC-avidin应避光保存。 5加盖玻片时应避免产生气泡（如产生气泡，有气泡的区域将不应视为 杂交区)。 五、作业与思考 1.荧光原位杂交技术的原理是什么？ 2熟悉荧光原位杂交技术的主要步骤有哪些？ (刘京昇)
3 10.将玻片从洗脱液中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体。 11. 加 80-100μlⅣ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃温育 15 分钟。 12. 将 3 缸用过的洗脱液倒掉，换成为用过的洗脱液，放入水浴中预 热。 13. 加 80-100μlⅤ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃继续温育 40 分钟。 14. 取出标本，去掉塑料薄膜，置于 42-50℃洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。 15. 将玻片从洗脱液中取出，竖直立在纸上几下，以去掉多余的液体。 16. 加 80-100μlⅡ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃温育 15 分钟。 17. 将 3 缸用过的洗脱液倒掉，换成未用过的洗脱液，放入水浴中预 热。 18.加 80-100μlⅢ液于标本的杂交区域上，盖上塑料薄膜，杂交盒中 37℃继续温育 40 分钟。 19. 取出标本，去掉塑料薄膜，置于 42-50℃洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。再于室温 2×SSC 中平衡一下。 20.玻片从中取出，竖直立在纸上晾干，加 12-15μlⅥ液复染，盖上盖 玻片，荧光显微镜下观察结果。 （八）结果判定 低倍镜下用看 PI（红色）的激发块找到红色的染色体 及细胞，换成油镜，用微调调清楚，再更换看 FITC（绿色）的激发块观察 绿色信号（不看时随时关上荧光，以防止信号淬灭，看完后请放-20℃避光 保存片子）。 注意事项： 1.本方法适用于外周血标本，如羊水或其他标本应做好杂交前预处理。 2.片子变性时间由制片后时间长短而定，制片时间越长变性时间越长。 3.变性及洗脱时应量取染缸内液体的温度。洗脱过程中片子勿干，以免 增加背景。 4.试剂每次使用前应充分混匀，应尽量减少反复冻融次数，一经起用可 放在 4℃，FITC-avidin 应避光保存。 5.加盖玻片时应避免产生气泡（如产生气泡，有气泡的区域将不应视为 杂交区）。 五、作业与思考 1. 荧光原位杂交技术的原理是什么？ 2.熟悉荧光原位杂交技术的主要步骤有哪些？ （刘京昇）