实验五E-玫瑰花环试验 动物的T淋巴细胞具有结合红细胞的性质，其分子基础是T细胞表面存在CD2分子，也 就是红细胞受体，多数动物的T细胞是绵羊红细胞受体，而豚鼠、马的T细胞是家兔红细胞 受体，因此红细胞能粘附到T细胞周围形成一朵玫瑰花样的花环，故取名为-玫瑰花环 (erythrocyte rosettes),即红细胞玫瑰花环，该试验称为E-玫瑰花环试验(erythrocyte rosettes assay)。凡能与红细胞形成E-玫瑰花环的淋巴细胞简称为B-花环形成细胞。该试验可用于 计数或分离E-花环形成细胞以及测定机体的细胞免疫状态 [目的要求] 1.掌握E-玫瑰花环试验的原理及操作方法。 2.熟悉淋巴细胞的分离方法。 材料与试剂] 1.试管，离心管，毛细管，吸管，注射器，载玻片，血球计数板，豚鼠，家兔等。 2.淋巴细胞分层液，无钙、镁的Hak's液，肝素液，小牛血清。 3.0.8%戊二溶液：25%戊二醛溶液0.32ml,Hank's液9.68ml,用前配制 4.Giemsa-Weight染色液：I液：Weight粉0.lg加甲醇60ml,研磨混匀：Ⅱ液：Giemsa 粉0.5g溶于纯甘油33ml中，置60℃温箱，最后加甲醇33ml即可：使用时，分别将1液 和Ⅱ液用pH6.4的PBS稀释1倍。 [实验内容及操作方法] (一)豚鼠淋巴细胞的制备 1.方法1 取豚鼠肝素抗凝血3ml,沿离心管壁轻轻地加入到3ml的淋巴细胞分层液的上面，使 二层液体的界面不相混合：于水平转子离心机中，2000r/min离心20min,离心后分为四层， 上层为血浆，此层与分层液液面交界处有一云雾状层，即为淋巴细胞层，云雾状层之下为淋 巴细胞分层液，底层主要为红细胞，用毛细管轻轻地把淋巴细胞层吸入另一试管中：用5倍 Hank's液反复洗涤淋巴细胞2次，每次2000r/min离心10min:若第一次离心后，沉淀的 淋巴细胞中有少量红细胞，可加蒸馏水1ml左右，振摇1mi,使红细胞破裂，然后立即加 Hank's液4ml左右，混匀，2000r/min离心10min,弃上清液，继续用Hank's液洗涤一次： 14