第3期 王方华等草鱼病喜性出血病研究进展 于CRN在体外译的研究结果表明:草鱼出血病穿透功能 RNA的一条进有m8N4的性质,可在体外进行翻译 其梨泽产物为1条多欣链,与病李的结多欣是-致的, 5草鱼出血病的防治研究进 限.织5精1单鱼出止病的疫黄防沿究 在好子上有美2这体外计物可1幸鱼出上锦是种病李性航危害大来 构多的成热间产轨,在宿主组内配程中地当年草死率般3.%,最高可6 要进-步的修饰加工 8%。疫预防是该病最有效的防治方法之一。因此疫 43病毒基因组结构研究 苗对该的防治意义重大。对于草鱼出血病毒疫 草值(P9由制大经织天话造、减幸活度、重单位疫苗 1个A片段组议,不同的斜解车到图的总第酸,在的吗天安足多 美不大(50,各片段分量有新法的请,大量(常是必须)风可 ,数分量大小、1个可32较大片段呢同或全身的反应,苗不能进(MH0类抗 u1.B等段(.0)8小片段薏,不能有数:0并所获得的免 S..s.S.清等”0R8￥图是至的,须发前减喜较由子在 究,首次发现该麻喜基因外存在损生于优的致航性,0漫过召国复联性的潜在,活段 喜基型到付,+从中送出2条数性产还可造成染,全生产过程来的在有物 进行了序列分折,0定了其性质,其只是基质图在成本生产技术上要求高分外,上述2 图钱,爆基想核是经切、重话并错包最种淡值的士要点是需要冷*保存,这既增加成本又影 人前单衣克而成,英台身属性快定其至基配组中引了响支态,影在发中家相使,重 众多预没有的信息,使之成为新究淡度单位值封备度,本高美来技术量高 制,装过程以及调控信息的有和工具 因此也没有得到推广应用。而众所周知,理想的疫苗应具 44病毒蛋白功能研究 备的特有:安全,廉价,热稳定性好、含有多种具有保 等”)病毒基因所编码的蛋白功能进行了详细的#用的原,最好是次口服即可生数。目萌常规疫 描述:()病毒核衣克18,分别由基因段没有一个能完全满足上进标准因此基因疫苗应运而士。 3和编码,为孩心克的要成分,它们在病毒的转录基因疫苗与传统疫苗相比有-2明显优点,主要表现在以 与复制及病毒核衣克形成中起着重要的作用。W至蛋白序下几个方面:()基天苗接种后,抗原蛋白在宿主细胞 列具有核酸结合位点,)外还买有解款酶和BM三酸内表达,1加工处理过程与原的自然染类似,抗原呈递 酶AP活话性,其主要参病转过中基国组〔链的过程也相同,而可以导机体产生细和体液,度:(2) 解散化的能量供应,但项的发离不开7的抗原基因在体内存在时间比较长,不断新表达抗原蛋白,持 帮助,其在病V棱克构象形成中具有+分重要的功能。5给免安系统提供刺,因而能够激机体产生较强被 月外统还发观1%有55结合第+(2)薛钉持久的答;(3)可以将包含不同抗原基因的质粒混 状物突起,W蛋白五体蛋白为订呼场减2基图进行联接:(4)质粒载体没有免我变原性,可以反复 片没编吗,已实蛋与外克蛋白W和以及使用。总之基因疫首以其抗原性生蛋、保护时间长、效造 内衣壳和12有很强的该合作用与相联系:序列及方、输方便而越来越受到人们的重。成为 结持分析表明:W蛋白具有乌酸转移和2种甲基化种全新的变成 活,与mEN5未端的甲基化有关,(3)微量核组就草鱼出血病的致病呼肠孩病毒来说,现在我们已经 升W和网4,分别出基国片段1M节段所编玛、得到了其病毒时全部基因片段,并建立了相应的基因文库 W为RN合,谈蛋白位于内克层5次欢对称轴道孔2基因表达计的图库等>计N单个多务进 溺处,参新生MN的起始合成1N蛋白的用可行了系性究,并出1免疫原性强的多饭 为病毒复制中的-种调节蛋白,在病毒转录复过程中段,这明单个多知抗原能刘(机体中和抗体的产生 物同W共同定NP衡活性,、(4)航外衣克结构蛋而我们已经知道了编吗这个多的基因序列,因此完全可 日M、N编码的病蛋白和团构成请外衣克组以通过将这段芹列号载体结合制成基因安苗来免疫革鱼 W和蛋白果有介导病喜进人寄主胞质的别外,逦可将不同地区发现的喜抹中免原性强的多默 功能,此外Ⅳ逐可走行构象的变,其作用是保证漠穿联制成联合免疫,以提商草色对不同毒求的抗性。相 透,病薛粒子V果有同7蛋白通过构象变化行使膜这将是含有意并且实用价值的研究内容。可为度苗第 3期 王方华等:草鱼病毒性出血病研究进展 于GCRV在体外翻译的研究结果表明:草鱼出血病病毒 dsRNA的一条链具有 mRNA的性质，可在体外进行翻译， 其翻译产物为 11条多肤链，与病毒的结构多肤是一致的， 只是片段 S2, S3, S5编码的多肤与病毒衣壳中的结构多肤 在分子量上有所差异{281。推测这些体外翻译产物可能为结 构多肤的非成熟中间产物，在宿主细胞内装配过程中还需 要进一步的修饰加工。 4.3 病毒基因组结构研究 草鱼呼肠孤病毒 (Grass carp reovirus GCRV)基因组由 11个dsRN A片段组成〔11,291，不同的毒株间病毒基因组的总 分子量差异不大 (约15x1护Da)，而各片段分子量有所差 异，按分子量大小，11个片段可分为 3组，即较大片段 (L1 , 12, L3 )、中等片段 (Ml, M2, M3)和较小片段 (S1,S2,S3,S4,S5)。邱涛等〔30〕通过对GCRV873基因 组研究，首次发现该病毒基因组外存在缺损性干扰颗粒的 病毒亚基因组分，并从中筛选出2条缺损性干扰颗粒cDNA 进行了序列分析，确定了其性质，因为其基因组只是亚基 因片段，为原基因组核酸片段经剪切、重排并被错误包裹 人病毒衣壳而形成，其自身属性决定其亚基因组中携带了 众多正常病毒颗粒所没有的信息，使之成为研究该病毒复 制、装配过程以及调控信息的有利工具。 4.4 病毒蛋白功能研究 方勤等f”一对病毒基因所编码的蛋白功能进行了详细的 描述:(1)病毒核衣壳组分VP3和VP6，分别由基因片段 L3和S2编码，为核心衣壳的主要成分，它们在病毒的转录 与复制及病毒核衣壳形成中起着重要的作用。V P3蛋白序 列具有核昔酸结合位点，另外还具有解旋酶和RNA三磷酸 酶/ATP酶活性，其主要参与病毒转录过程中基因组负链的 解旋与帽化的能量供应，但VP3功能的发挥离不开VP6的 帮助，其在病毒VP3核壳构象形成中具有十分重要的功能。 另外研究还发现 VP6有弱的dsRNA结合能力。(2)病毒钉 状物突起 VP1, VP1蛋白五聚体蛋白为呼肠孤病毒 L2基因 片段编码，已证实VPl蛋白与外衣壳蛋白VP7和VP5以及 内衣壳VP3和V P2有很强的亲合作用与相互联系。序列及 结构分析表明:VPl蛋白具有鸟昔酸转移酶和2种甲基化 酶活性，与mRNA 5‘末端的甲基化有关。(3)微量核心组 分 VP2和 VP4，分别由基因片段 L1和 M1节段所编码。 VP2为RNA聚合酶，该蛋白位于内壳层5次对称轴通道孔 洞处，参与新生 mRNA的起始合成。VP4蛋白的作用可能 为病毒复制中的一种调节蛋白，在病毒转录与复制过程中 协同VP3共同决定NTP酶活性。 (4)病毒外衣壳结构蛋 白，Mi、S4编码的病毒蛋白VP5和VP7构成病毒外衣壳组 分，VP5和VIY7蛋白具有介导病毒粒子进人寄主细胞质的 功能，此外 VP5还可进行构象的改变，其作用是保证膜穿 透。病毒粒子VP7具有协同VP5蛋白通过构象变化行使膜 穿透功能。 5 草鱼出血病的防治研究进展 5.1 草鱼出血病的疫苗防治研究 草鱼出血病是一种病毒性鱼病，危害很大，感染此病 后，当年草鱼死亡率一般为30%一50%，最高可达60%- 80%。而免疫预防是该病最有效的防治方法之一。因此疫 苗研制对该病的防治意义重大。对于草鱼出血病毒疫苗的 研制大致经历了组织灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗 等阶段，但都存在一定的缺陷[323。组织灭活疫苗须含足够 的病毒才能引起免疫应答，而大剂量 (常是必须的)又可 引起局部或全身的反应。该疫苗不能进人 MHCI类抗原呈 递途径，因此不能有效的诱导 CTL反应，并且所获得的免 疫性一般是短暂的，须激发注射。而减毒活疫苗由于存在 致病性、刺激性过强和回复致病性的潜在危险，而且活疫 苗生产还可能造成污染，含有生产过程带来的潜在有毒物 质，因此在成本和生产技术上要求比较高。另外，上述2 种疫苗的主要缺点是需要冷冻保存，这样既增加成本又影 响有效寿命，尤其是影响其在发展中国家的推广使用。亚 单位疫苗由于制备过程复杂，成本高，要求技术含量高， 因此也没有得到推广应用。而众所周知，理想的疫苗应具 备的特征有:安全、廉价、热稳定性好、含有多种具有保 护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前常规疫 苗没有一个能完全满足上述标准。因此基因疫苗应运而生。 基因疫苗与传统疫苗相比有一些明显优点，主要表现在以 下几个方面:(1)基因疫苗接种后，抗原蛋白在宿主细胞 内表达，加工处理过程与病原的自然感染类似，抗原呈递 过程也相同，因而可以诱导机体产生细胞和体液免疫;(2) 抗原基因在体内存在时间比较长，不断表达抗原蛋白，持 续给免疫系统提供刺激，因而能够刺激机体产生较强和较 持久的免疫应答;(3)可以将包含不同抗原基因的质粒混 合进行联合免疫;(4)质粒载体没有免疫原性，可以反复 使用。总之，基因疫苗以其抗原性强、保护时间长、改造 方便、制备和运输方便而越来越受到人们的重视。成为一 种全新的免疫方式[”;。 就草鱼出血病的致病呼肠孤病毒来说，现在我们已经 得到了其病毒的全部基因片段，并建立了相应的基因文库 及基因表达多肤的图谱。王炜等[34〕曾对GCRV单个多肤进 行了免疫原性研究，并筛选出VP6为免疫原性强的多肤片 段，这说明单个多肤作为抗原能刺激机体中和抗体的产生。 而我们已经知道了编码这个多肤的基因序列，因此完全可 以通过将这段序列与载体结合制成基因疫苗来免疫草鱼。 另外，还可将不同地区发现的毒株中免疫原性强的多肤片 段制成联合免疫疫苗，以提高草鱼对不同毒株的抗性。相 信这将是非常有意义并且实用价值的研究内容。可为疫苗