《饲料工业》·2006年第27卷第16期 酶工程 真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 胡春霞宋会仪 纤维素是地球上最丰富的多糖物质，它广泛而大1纤维素酶的真菌来源及菌种选育 量地存在于谷物、豆类、麦类及其加工副产品等畜禽11真菌来源 饲料里，是多个葡萄糖残基以P1,4-糖苷键连接而 纤维素酶的真菌来源非常广泛，比较典型的有木 成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。在天然纤 霉属(Trichoder a sp.)、曲霉属(A spergillus sp.)和青 维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地 霉属(Pen icillium),另外还有血红栓菌、疣孢漆斑菌 包围纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用 QM460、变色多空霉、乳齿粑菌、腐皮镰孢、嗜热毛壳 一部分纤维素外，猪、鸡等单胃动物胃肠道内因缺乏纤菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等，其它真菌也产 维素酶而不能利用，大大限制了纤维素在饲料上的利纤维素酶。其中里氏木霉(T.reesei)和黑曲霉(A. 用们。纤维素酶cellu lase)是指能水解纤维素Bl,4-葡nger是公认的安全微生物，不产生毒素，而且产率 萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组起高、酶系全、活性高、较为稳定，是目前应用最广的纤 协同作用的复杂酶系，主要由细菌和真菌产生。细菌维素酶生产菌。 纤维素酶产量少、活性低、酶系单一（主要是Cx酶），1.2菌种选育 而且不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点：产生 优良菌株的选择是纤维素酶发酵生产的前提和 纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取：产酶效率关键之一。可以利用物理、化学诱变剂单独或复合处 高，产生纤维素酶的酶系结构较为合理，相互间能发理微生物孢子或细胞的方法来选育纤维素高产菌种， 生强烈的协同作用：可同时产生许多半纤维素酶、果如董志扬等（②000）用康宁木霉通过Y射线照射和亚 胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶，有利于硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素酶高产菌株 在畜禽胃肠道里发挥作用，所以目前饲用纤维素酶大T801,与出发菌株相比，其产酶能力提高1.77倍印：邱 多来源于真菌。 雁临等(2002)以绿色木霉N0为出发菌株，经紫 真菌纤维素酶主要包括3种组分：外切葡聚糖酶外线、亚硝基胍诱变处理，得到耐高温、高酶活菌株 C1酶，ex01,4-BD-glucanase,G3.2.1.91,来自真菌 110,其中内切葡聚糖酶的酶活提高了2.8倍：管斌等 的简称CBH)、内切葡聚糖酶Cx酶，edo-1,4-D-(2002)通过紫外线等对里氏木霉进行诱变处理，采用 glucnase,EC3.2.1.4,来自真菌的简称EG)和葡萄糖苷 低剂量、反复多次复合诱变处理方法，用2-脱氧葡 酶(B1,4-glucosidase,EC3.2.1.21,简称BG),也称纤维萄糖”作为降解产物阻遏物的高效筛选方法，选育得 二糖酶叫。真菌纤维素酶属于异构酶，3种组分都有多 到一株抗分解代谢阻遏物的突变株，使纤维素酶活力 种异构体。如CBH主要包括cbhl和cbh2两种异构 提高3倍)。 酶：EG主要有egl、eg2、eg3和egl5,其中egl为主 真菌纤维素酶系中常常会由于某种组分酶活性 要内切葡聚糖酶；BG有bgll和bg2两种异构酶。这3 较低而不能很好的发挥协同作用，针对这种缺陷，有 种组分的分工不同，C1和Cx酶主要溶解纤维素，BG 学者提出了可利用原生质体融合技术来打破物种间 酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄糖，当它们 细胞不能相互融合的障碍，获取具有全纤维素酶高产 的活性比例适当时，就能协同作用将纤维素彻底水解 菌株。他们还尝试对不同属种间的纤维素酶系的亲 成较小的寡糖或者低聚糖，从而有利于动物吸收剧。 和相容性或多态性进行研究，通过细胞融合，获得了 既能分解纤维素，又能分解木质素的稳定梭菌杂种菌 株。 胡春霞，浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养 学重点实验室，310029，杭州市秋涛北路164号浙江大学饲料 2真菌纤维素酶基因的克隆与表达 科学研究所。 近年来，随着现代生物技术的迅猛发展，越来越 宋会仪，单位及通讯地址同第一作者。 多的真菌纤维素酶基因得到克隆和表达。经过对比发 收稿日期：2006-05-13 现，不同真菌菌株的同一类型的纤维素酶基因有较高纤维素是地球上最丰富的多糖物质, 它广泛而大 量地存在于谷物、豆类、麦类及其加工副产品等畜禽 饲料里, 是多个葡萄糖残基以 β- 1, 4- 糖苷键连接而 成的多聚物, 其基本重复单位为纤维二糖。在天然纤 维素中, 木质素和半纤维素形成牢固结合层, 紧密地 包围纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用 一部分纤维素外, 猪、鸡等单胃动物胃肠道内因缺乏纤 维素酶而不能利用, 大大限制了纤维素在饲料上的利 用[1] 。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素 β- 1, 4- 葡 萄糖苷键, 使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组起 协同作用的复杂酶系, 主要由细菌和真菌产生。细菌 纤维素酶产量少、活性低、酶系单一( 主要是 Cx 酶) , 而且不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点: 产生 纤维素酶为胞外酶, 便于酶的分离和提取; 产酶效率 高, 产生纤维素酶的酶系结构较为合理, 相互间能发 生强烈的协同作用; 可同时产生许多半纤维素酶、果 胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶, 有利于 在畜禽胃肠道里发挥作用, 所以目前饲用纤维素酶大 多来源于真菌。 真菌纤维素酶主要包括 3 种组分: 外切葡聚糖酶 (C1 酶, exo- 1, 4- β- D- glucanase, G3.2.1.91, 来自真菌 的简称 CBH)、内切葡聚糖酶 (Cx 酶, endo- 1, 4- D￾glucnase, EC3.2.1.4, 来自真菌的简称 EG)和葡萄糖苷 酶(β- 1, 4- glucosidase, EC3.2.1.21, 简称 BG), 也称纤维 二糖酶[2] 。真菌纤维素酶属于异构酶, 3 种组分都有多 种异构体。如 CBH 主要包括 cbh1 和 cbh2 两种异构 酶; EG 主要有 egl1、egl2、egl3 和 egl5, 其中 egl1 为主 要内切葡聚糖酶; BG 有 bgl1 和 bgl2 两种异构酶。这 3 种组分的分工不同, C1 和 Cx 酶主要溶解纤维素, BG 酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄糖, 当它们 的活性比例适当时, 就能协同作用将纤维素彻底水解 成较小的寡糖或者低聚糖, 从而有利于动物吸收[3] 。 1 纤维素酶的真菌来源及菌种选育 1.1 真菌来源 纤维素酶的真菌来源非常广泛, 比较典型的有木 霉属( Trichoderma sp.) 、曲 霉 属( Aspergillus sp.) 和 青 霉属( Penicillium) , 另外还有血红栓菌、疣孢漆斑菌 QM460、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、嗜热毛壳 菌 QM9381 和嗜热子囊菌 QM9383 等, 其它真菌也产 纤维素酶。其中里氏木霉 ( T. reesei) 和黑曲霉( A. niger) 是公认的安全微生物, 不产生毒素, 而且产率 高、酶系全、活性高、较为稳定, 是目前应用最广的纤 维素酶生产菌。 1.2 菌种选育 优良菌株的选择是纤维素酶发酵生产的前提和 关键之一。可以利用物理、化学诱变剂单独或复合处 理微生物孢子或细胞的方法来选育纤维素高产菌种, 如董志扬等( 2000) 用康宁木霉通过 γ射线照射和亚 硝基胍交替处理, 诱变出一株纤维素酶高产菌 株 T801, 与出发菌株相比, 其产酶能力提高 1.77 倍[4] ; 邱 雁 临 等 ( 2002) 以 绿 色 木 霉 NO 为 出 发 菌 株 , 经 紫 外线、亚硝基胍诱变处理, 得到耐高温、高酶活菌株 110, 其中内切葡聚糖酶的酶活提高了 2.8 倍[5] ; 管斌等 ( 2002) 通过紫外线等对里氏木霉进行诱变处理, 采用 低剂量、反复多次复合诱变处理方法, 用 “2- 脱氧葡 萄糖”作为降解产物阻遏物的高效筛选方法, 选育得 到一株抗分解代谢阻遏物的突变株, 使纤维素酶活力 提高 3 倍[6] 。 真菌纤维素酶系中常常会由于某种组分酶活性 较低而不能很好的发挥协同作用, 针对这种缺陷, 有 学者提出了可利用原生质体融合技术来打破物种间 细胞不能相互融合的障碍, 获取具有全纤维素酶高产 菌株[7] 。他们还尝试对不同属种间的纤维素酶系的亲 和相容性或多态性进行研究, 通过细胞融合, 获得了 既能分解纤维素, 又能分解木质素的稳定梭菌杂种菌 株。 2 真菌纤维素酶基因的克隆与表达 近年来, 随着现代生物技术的迅猛发展, 越来越 多的真菌纤维素酶基因得到克隆和表达。经过对比发 现, 不同真菌菌株的同一类型的纤维素酶基因有较高 真 菌 纤 维 素 酶 及 其 在 饲 料 中 的 应 用 胡春霞 宋会仪 胡春霞, 浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养 学重点实验室, 310029, 杭州市秋涛北路 164 号浙江大学饲料 科学研究所。 宋会仪, 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期: 2006- 05- 13 《饲料工业》·2006 年第 27 卷第 16 期 酶 工 程 15