《饲料工业》·2006年第27卷第16期 酶工程 真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 胡春霞宋会仪 纤维素是地球上最丰富的多糖物质，它广泛而大1纤维素酶的真菌来源及菌种选育 量地存在于谷物、豆类、麦类及其加工副产品等畜禽11真菌来源 饲料里，是多个葡萄糖残基以P1,4-糖苷键连接而 纤维素酶的真菌来源非常广泛，比较典型的有木 成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。在天然纤 霉属(Trichoder a sp.)、曲霉属(A spergillus sp.)和青 维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地 霉属(Pen icillium),另外还有血红栓菌、疣孢漆斑菌 包围纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用 QM460、变色多空霉、乳齿粑菌、腐皮镰孢、嗜热毛壳 一部分纤维素外，猪、鸡等单胃动物胃肠道内因缺乏纤菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等，其它真菌也产 维素酶而不能利用，大大限制了纤维素在饲料上的利纤维素酶。其中里氏木霉(T.reesei)和黑曲霉(A. 用们。纤维素酶cellu lase)是指能水解纤维素Bl,4-葡nger是公认的安全微生物，不产生毒素，而且产率 萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组起高、酶系全、活性高、较为稳定，是目前应用最广的纤 协同作用的复杂酶系，主要由细菌和真菌产生。细菌维素酶生产菌。 纤维素酶产量少、活性低、酶系单一（主要是Cx酶），1.2菌种选育 而且不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点：产生 优良菌株的选择是纤维素酶发酵生产的前提和 纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取：产酶效率关键之一。可以利用物理、化学诱变剂单独或复合处 高，产生纤维素酶的酶系结构较为合理，相互间能发理微生物孢子或细胞的方法来选育纤维素高产菌种， 生强烈的协同作用：可同时产生许多半纤维素酶、果如董志扬等（②000）用康宁木霉通过Y射线照射和亚 胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶，有利于硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素酶高产菌株 在畜禽胃肠道里发挥作用，所以目前饲用纤维素酶大T801,与出发菌株相比，其产酶能力提高1.77倍印：邱 多来源于真菌。 雁临等(2002)以绿色木霉N0为出发菌株，经紫 真菌纤维素酶主要包括3种组分：外切葡聚糖酶外线、亚硝基胍诱变处理，得到耐高温、高酶活菌株 C1酶，ex01,4-BD-glucanase,G3.2.1.91,来自真菌 110,其中内切葡聚糖酶的酶活提高了2.8倍：管斌等 的简称CBH)、内切葡聚糖酶Cx酶，edo-1,4-D-(2002)通过紫外线等对里氏木霉进行诱变处理，采用 glucnase,EC3.2.1.4,来自真菌的简称EG)和葡萄糖苷 低剂量、反复多次复合诱变处理方法，用2-脱氧葡 酶(B1,4-glucosidase,EC3.2.1.21,简称BG),也称纤维萄糖”作为降解产物阻遏物的高效筛选方法，选育得 二糖酶叫。真菌纤维素酶属于异构酶，3种组分都有多 到一株抗分解代谢阻遏物的突变株，使纤维素酶活力 种异构体。如CBH主要包括cbhl和cbh2两种异构 提高3倍)。 酶：EG主要有egl、eg2、eg3和egl5,其中egl为主 真菌纤维素酶系中常常会由于某种组分酶活性 要内切葡聚糖酶；BG有bgll和bg2两种异构酶。这3 较低而不能很好的发挥协同作用，针对这种缺陷，有 种组分的分工不同，C1和Cx酶主要溶解纤维素，BG 学者提出了可利用原生质体融合技术来打破物种间 酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄糖，当它们 细胞不能相互融合的障碍，获取具有全纤维素酶高产 的活性比例适当时，就能协同作用将纤维素彻底水解 菌株。他们还尝试对不同属种间的纤维素酶系的亲 成较小的寡糖或者低聚糖，从而有利于动物吸收剧。 和相容性或多态性进行研究，通过细胞融合，获得了 既能分解纤维素，又能分解木质素的稳定梭菌杂种菌 株。 胡春霞，浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养 学重点实验室，310029，杭州市秋涛北路164号浙江大学饲料 2真菌纤维素酶基因的克隆与表达 科学研究所。 近年来，随着现代生物技术的迅猛发展，越来越 宋会仪，单位及通讯地址同第一作者。 多的真菌纤维素酶基因得到克隆和表达。经过对比发 收稿日期：2006-05-13 现，不同真菌菌株的同一类型的纤维素酶基因有较高
纤维素是地球上最丰富的多糖物质, 它广泛而大 量地存在于谷物、豆类、麦类及其加工副产品等畜禽 饲料里, 是多个葡萄糖残基以 β- 1, 4- 糖苷键连接而 成的多聚物, 其基本重复单位为纤维二糖。在天然纤 维素中, 木质素和半纤维素形成牢固结合层, 紧密地 包围纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用 一部分纤维素外, 猪、鸡等单胃动物胃肠道内因缺乏纤 维素酶而不能利用, 大大限制了纤维素在饲料上的利 用[1] 。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素 β- 1, 4- 葡 萄糖苷键, 使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组起 协同作用的复杂酶系, 主要由细菌和真菌产生。细菌 纤维素酶产量少、活性低、酶系单一( 主要是 Cx 酶) , 而且不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点: 产生 纤维素酶为胞外酶, 便于酶的分离和提取; 产酶效率 高, 产生纤维素酶的酶系结构较为合理, 相互间能发 生强烈的协同作用; 可同时产生许多半纤维素酶、果 胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶, 有利于 在畜禽胃肠道里发挥作用, 所以目前饲用纤维素酶大 多来源于真菌。 真菌纤维素酶主要包括 3 种组分: 外切葡聚糖酶 (C1 酶, exo- 1, 4- β- D- glucanase, G3.2.1.91, 来自真菌 的简称 CBH)、内切葡聚糖酶 (Cx 酶, endo- 1, 4- Dglucnase, EC3.2.1.4, 来自真菌的简称 EG)和葡萄糖苷 酶(β- 1, 4- glucosidase, EC3.2.1.21, 简称 BG), 也称纤维 二糖酶[2] 。真菌纤维素酶属于异构酶, 3 种组分都有多 种异构体。如 CBH 主要包括 cbh1 和 cbh2 两种异构 酶; EG 主要有 egl1、egl2、egl3 和 egl5, 其中 egl1 为主 要内切葡聚糖酶; BG 有 bgl1 和 bgl2 两种异构酶。这 3 种组分的分工不同, C1 和 Cx 酶主要溶解纤维素, BG 酶主要将纤维二糖、纤维三糖转化为葡萄糖, 当它们 的活性比例适当时, 就能协同作用将纤维素彻底水解 成较小的寡糖或者低聚糖, 从而有利于动物吸收[3] 。 1 纤维素酶的真菌来源及菌种选育 1.1 真菌来源 纤维素酶的真菌来源非常广泛, 比较典型的有木 霉属( Trichoderma sp.) 、曲 霉 属( Aspergillus sp.) 和 青 霉属( Penicillium) , 另外还有血红栓菌、疣孢漆斑菌 QM460、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、嗜热毛壳 菌 QM9381 和嗜热子囊菌 QM9383 等, 其它真菌也产 纤维素酶。其中里氏木霉 ( T. reesei) 和黑曲霉( A. niger) 是公认的安全微生物, 不产生毒素, 而且产率 高、酶系全、活性高、较为稳定, 是目前应用最广的纤 维素酶生产菌。 1.2 菌种选育 优良菌株的选择是纤维素酶发酵生产的前提和 关键之一。可以利用物理、化学诱变剂单独或复合处 理微生物孢子或细胞的方法来选育纤维素高产菌种, 如董志扬等( 2000) 用康宁木霉通过 γ射线照射和亚 硝基胍交替处理, 诱变出一株纤维素酶高产菌 株 T801, 与出发菌株相比, 其产酶能力提高 1.77 倍[4] ; 邱 雁 临 等 ( 2002) 以 绿 色 木 霉 NO 为 出 发 菌 株 , 经 紫 外线、亚硝基胍诱变处理, 得到耐高温、高酶活菌株 110, 其中内切葡聚糖酶的酶活提高了 2.8 倍[5] ; 管斌等 ( 2002) 通过紫外线等对里氏木霉进行诱变处理, 采用 低剂量、反复多次复合诱变处理方法, 用 “2- 脱氧葡 萄糖”作为降解产物阻遏物的高效筛选方法, 选育得 到一株抗分解代谢阻遏物的突变株, 使纤维素酶活力 提高 3 倍[6] 。 真菌纤维素酶系中常常会由于某种组分酶活性 较低而不能很好的发挥协同作用, 针对这种缺陷, 有 学者提出了可利用原生质体融合技术来打破物种间 细胞不能相互融合的障碍, 获取具有全纤维素酶高产 菌株[7] 。他们还尝试对不同属种间的纤维素酶系的亲 和相容性或多态性进行研究, 通过细胞融合, 获得了 既能分解纤维素, 又能分解木质素的稳定梭菌杂种菌 株。 2 真菌纤维素酶基因的克隆与表达 近年来, 随着现代生物技术的迅猛发展, 越来越 多的真菌纤维素酶基因得到克隆和表达。经过对比发 现, 不同真菌菌株的同一类型的纤维素酶基因有较高 真 菌 纤 维 素 酶 及 其 在 饲 料 中 的 应 用 胡春霞 宋会仪 胡春霞, 浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养 学重点实验室, 310029, 杭州市秋涛北路 164 号浙江大学饲料 科学研究所。 宋会仪, 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期: 2006- 05- 13 《饲料工业》·2006 年第 27 卷第 16 期 酶 工 程 15
酶工程 胡春霞等：真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 的同源性，但同一菌种不同类型的纤维素酶基因间的3真菌纤维素酶的生产 同源性相对较低刷。已知里氏木霉有8个纤维素酶基 生产真菌纤维素酶有固体发酵问和液体发酵两 因得到克隆，包括编码纤维二糖水解酶的cbhl、cbh2 种方法。和固体发酵法相比，液体发酵有发酵动力消 和编码内切葡聚糖酶的egll、eg2、egl3、eg4和egl5, 耗大、设备要求高等缺点，但具有原料利用率高、生产 以及编码B葡萄糖苷酶的bg4。测序比对发现，cbhl 条件易控制、产量高、劳动强度小、产品质量稳定、不 与egl同源性为52%：cbh2与eg3整体同源性很小， 易污染、可大规模生产等优点，是发酵生产纤维素酶 而且它们与cbhl和egl两个基因基本上不存在整体 的必然趋势间。 同源性：而里氏木霉cbh1与绿色木霉cbhl基因的同 目前，真菌纤维素酶的生产多采用液体深层发酵 源性达95%，里氏木霉eg3与裂褶菌egll基因的同 法，在此基础上又出现了流加培养法、分批发酵法、连 源性也较高。由此可以看出，不同类型的纤维系酶基 续发酵法、二次发酵法及细胞循环法等。由于不同真 因的进化是各自独立的，在进化之初可能只存在一个 菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补现象，纤 纤维素酶基因，它编码糖酵解酶的前体，但由于进化 维素酶各组分之间生化性质的复杂性和酶学作用的 选择的压力，这一基因发生了突变进化，通过这种歧 交迭及异构酶的存在，纤维素酶系均衡性的研究引起 异进化，形成了一个复杂的真菌纤维素酶基因家族网。 了人们的注意。因此，通过微生物混合发酵生产出优 这种进化是纤维素酶对天然纤维素复杂结构的适应。 质高效的混合纤维素酶系显得尤为重要)，如应用最 通过构建基因工程菌来提高纤维素酶产量和质广泛的里氏木霉常常存在B葡萄糖苷酶活力较低的 量已成为推动纤维素酶广泛应用于饲料业生产中的 不足，导致纤维二糖积累，降低酶解效率。为改善纤维 重要手段。几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在 素酶系各组分的相对含量，从而充分发挥它们之间的 大肠杆菌中得到表达。但是这一原核表达系统的表 协同作用，曹健等(2003)在优化里氏木霉培养条件 达水平很低，产生的酶多数不能分泌到胞外，因而难 提高酶活的同时，添加一定比例的黑曲霉进行混合培 以提取。为了得到胞外分泌产物，一些纤维素酶基因养，利用黑曲霉产生的葡萄糖苷酶明显改善了里 己在枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、乳酸发酵短氏木霉纤维素酶系的协同作用效果，在最适培养条件 杆菌和变青链霉素等中得到了有效表达。但由于纤 下，粗酶液的B葡萄糖苷酶活和滤纸酶(PA)酶活分 维素酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白酶水解 别达到127.6U血1和84.8U加1B葡萄糖苷酶的产量 和糖基化等问题，其分泌机制尚不清楚，无法达到纤 是对照组的2.9倍，FPA酶活提高了近2.3倍。涂璇等9 维素酶生产要求。所以现在大多采用真核表达系统 (2004)研究了2种曲霉UF2和UA8)二元混菌体系和 来表达纤维素酶基因。真菌纤维素酶基因在酵母中 两种曲霉与1种酵母菌组成的三元混菌体系混合发 的表达是纤维素酶用于工业生产的一个重要途径。 酵对纤维素酶系3种酶组分活性的影响。结果表明：2 这是因为，酵母可以克服在原核表达系统中无法进 种霉菌按一定比例接种进行混合发酵时3种纤维素 行特定翻译后修饰的缺陷，不产生毒素，是一种较为酶组分的活性较单菌发酵大幅度提高，滤纸酶PA)、 理想的真核表达系统：用其表达纤维素酶基因，其产 微晶纤维素酶AVD和羧甲基纤维素酶CMC)活性分 物高度糖基化，表达水平高，而且产物直接分泌至胞别较UA8单菌发酵提高2.2%~51.1%、20.7%332.6% 外。如Godbole等](1999)将T.reesei cbhl在 和29.4%29.6%：向由两种霉菌组成的二元混菌发 Pichia pastoris中成功地转化并表达。肖志壮等☒] 酵体系中接入酵母菌可显著降低3种纤维素酶组分 ②OO1)利用PCR法从瑞氏木霉cDNA文库中扩增出 的活性；3菌混合发酵能使纤维素酶3组分的产酶高 内切葡聚糖酶1eg山)全长基因并克隆到酿酒酵母非 峰出现时间较双菌混合发酵滞后约24h,但3菌与双 整合型表达载体pA J401上，表达出具有活性的egl 菌混合发酵3种纤维素酶组分的酶活峰值无明显差 酶蛋白。近年来，以A spergillus ory2ae为表达系统的 异：双菌混合发酵有利于缩短纤维素酶生产发酵周 研究也渐渐增多。Takashim a等ú999)将T.reesei 期，为利用多菌混合发酵提高纤维素酶活性研究和技 bg2基因在A.oyae中表达成功，酶活检测显示了 术开发提供参考。 EG酶活性。 4在饲料上的应用 但是，目前利用酵母表达外源纤维素酶基因的水 真菌纤维素酶作为饲料添加剂在动物体内的主 平有限，故如何建立有效的纤维素酶基因真菌表达体 要营养作用有：降解植物细胞壁，释放胞内养分：激活 系，提高酵母表达纤维素酶的产量有待进一步研究。 内源酶的分泌，补充内源酶的不足：消除抗营养因子， 6
的同源性, 但同一菌种不同类型的纤维素酶基因间的 同源性相对较低[8] 。已知里氏木霉有 8 个纤维素酶基 因得到克隆, 包括编码纤维二糖水解酶的 cbh1、cbh2 和编码内切葡聚糖酶的 egl1、egl2、egl3、egl4 和 egl5[9] , 以及编码 β- 葡萄糖苷酶的 bgl4。测序比对发现, cbh1 与 egl1 同源性为 52%; cbh2 与 egl3 整体同源性很小, 而且它们与 cbh1 和 egl1 两个基因基本上不存在整体 同源性; 而里氏木霉 cbh1 与绿色木霉 cbh1 基因的同 源性达 95%, 里氏木霉 egl3 与裂褶菌 egl1 基因的同 源性也较高。由此可以看出, 不同类型的纤维系酶基 因的进化是各自独立的, 在进化之初可能只存在一个 纤维素酶基因, 它编码糖酵解酶的前体, 但由于进化 选择的压力, 这一基因发生了突变进化, 通过这种歧 异进化, 形成了一个复杂的真菌纤维素酶基因家族[10] 。 这种进化是纤维素酶对天然纤维素复杂结构的适应。 通过构建基因工程菌来提高纤维素酶产量和质 量已成为推动纤维素酶广泛应用于饲料业生产中的 重要手段。几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在 大肠杆菌中得到表达。但是这一原核表达系统的表 达水平很低, 产生的酶多数不能分泌到胞外, 因而难 以提取。为了得到胞外分泌产物, 一些纤维素酶基因 已在枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、乳酸发酵短 杆菌和变青链霉素等中得到了有效表达。但由于纤 维素酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白酶水解 和糖基化等问题, 其分泌机制尚不清楚, 无法达到纤 维素酶生产要求。所以现在大多采用真核表达系统 来表达纤维素酶基因。真菌纤维素酶基因在酵母中 的表达是纤维素酶用于工业生产的一个重要途径。 这是因为, 酵母可以克服在原核表达系统中无法进 行特定翻译后修饰的缺陷, 不产生毒素, 是一种较为 理想的真核表达系统; 用其表达纤维素酶基因, 其产 物高度糖基化, 表达水平高, 而且产物直接分泌至胞 外 。 如 Godbole 等 [11] ( 1999) 将 T. reesei cbh1 在 Pichia pastoris 中 成 功 地 转 化 并 表 达 。 肖 志 壮 等[12] (2001) 利用 PCR 法从瑞氏木霉 cDNA 文库中扩增出 内切葡聚糖酶 1(egl1)全长基因并克隆到酿酒酵母非 整合型表达载体 pAJ401 上, 表达出具有活性的 egl1 酶蛋白。近年来, 以 Aspergillus oryzae 为表达系统的 研究也渐渐增多。Takashima 等[13] (1999)将 T. reesei bgl2 基因在 A. oryzae 中表达成功, 酶活检测显示了 EG 酶活性。 但是, 目前利用酵母表达外源纤维素酶基因的水 平有限, 故如何建立有效的纤维素酶基因真菌表达体 系, 提高酵母表达纤维素酶的产量有待进一步研究[14] 。 3 真菌纤维素酶的生产 生产真菌纤维素酶有固体发酵[15] 和液体发酵两 种方法。和固体发酵法相比, 液体发酵有发酵动力消 耗大、设备要求高等缺点, 但具有原料利用率高、生产 条件易控制、产量高、劳动强度小、产品质量稳定、不 易污染、可大规模生产等优点, 是发酵生产纤维素酶 的必然趋势[16] 。 目前, 真菌纤维素酶的生产多采用液体深层发酵 法, 在此基础上又出现了流加培养法、分批发酵法、连 续发酵法、二次发酵法及细胞循环法等。由于不同真 菌的纤维素酶系在各组分均衡性方面有互补现象, 纤 维素酶各组分之间生化性质的复杂性和酶学作用的 交迭及异构酶的存在, 纤维素酶系均衡性的研究引起 了人们的注意。因此, 通过微生物混合发酵生产出优 质高效的混合纤维素酶系显得尤为重要[17] , 如应用最 广泛的里氏木霉常常存在 β- 葡萄糖苷酶活力较低的 不足, 导致纤维二糖积累, 降低酶解效率。为改善纤维 素酶系各组分的相对含量, 从而充分发挥它们之间的 协同作用, 曹健等[18] ( 2003) 在优化里氏木霉培养条件 提高酶活的同时, 添加一定比例的黑曲霉进行混合培 养, 利用黑曲霉产生的 β- 葡萄糖苷酶明显改善了里 氏木霉纤维素酶系的协同作用效果, 在最适培养条件 下, 粗酶液的 β- 葡萄糖苷酶活和滤纸酶( FPA) 酶活分 别达到 127.6U/ml 和 84.8U/ml, β- 葡萄糖苷酶的产量 是对照组的 2.9 倍, FPA 酶活提高了近 2.3 倍。涂璇等[19] ( 2004) 研究了 2 种曲霉(UF2 和 UA8)二元混菌体系和 两种曲霉与 1 种酵母菌组成的三元混菌体系混合发 酵对纤维素酶系 3 种酶组分活性的影响。结果表明: 2 种霉菌按一定比例接种进行混合发酵时 3 种纤维素 酶组分的活性较单菌发酵大幅度提高, 滤纸酶(FPA)、 微晶纤维素酶(AVI)和羧甲基纤维素酶(CMC)活性分 别较 UA8 单菌发酵提高 2.2%～51.1%、20.7%～332.6% 和 29.4%～29.6% ; 向由两种霉菌组成的二元混菌发 酵体系中接入酵母菌可显著降低 3 种纤维素酶组分 的活性; 3 菌混合发酵能使纤维素酶 3 组分的产酶高 峰出现时间较双菌混合发酵滞后约 24h, 但 3 菌与双 菌混合发酵 3 种纤维素酶组分的酶活峰值无明显差 异; 双菌混合发酵有利于缩短纤维素酶生产发酵周 期, 为利用多菌混合发酵提高纤维素酶活性研究和技 术开发提供参考。 4 在饲料上的应用 真菌纤维素酶作为饲料添加剂在动物体内的主 要营养作用有: 降解植物细胞壁, 释放胞内养分; 激活 内源酶的分泌, 补充内源酶的不足; 消除抗营养因子, 酶 工 程 胡春霞等: 真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 16
胡春霞等：真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 酶工程 降低饲料粘性，提高酶的催化效率：改善胃中菌群结 条件研究们核农学报，2001,11)：2631 构及比例，同时增加单细胞蛋白含量：维持小肠绒毛 5邱雁临，孙宪迅，蔡俊，等纤维素酶耐高温高产菌株的选育①中 国酿造，20042)：1519 形态完整、促进营养物质的吸收：能与半纤维素酶、果 6管斌，孙艳玲，等.纤维素酶高产菌株的选育中国酿造，2002 胶酶、阝葡聚糖酶等其它酶协同作用，因此，使用复合 (40:1821 酶制剂要比单独使用纤维素酶的效果好四。近年来国 7周正红，方普康.黑曲霉原生质体电融合研究们生物工程学报， 1993,93):241246 内外大量的饲养试验、消化代谢试验都已证明，在 8胡利勇，钟卫鸿纤维素酶基因克隆及其功能性氨基酸研究进展 畜禽饲料中添加纤维素酶能明显提高动物对粗纤维、 [生物技术，20034)：4344 粗蛋白等营养物质的利用率，促进生长发育和改善生 9汪天虹，吴醉，邹玉霞，瑞氏木霉分子生物学研究进展们菌物系 统，2000,190)：147152 产性能。 10胡寅，莫建初.国内外纤维素酶研究概况们城市害虫防治，2003 另外，纤维素酶在草食性家畜胃肠疾病的治疗方 （2:1924 面也有一定应用。纤维素酶降解纤维素的功能一方面 11 Godbole S,D ecker SR,N ieves R A,et al Clning and expression of 直接降低了它们的致病因素：另一方面，使可溶性物 Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in pichia pastoris B iotechnology Progress,1999,156)828833 质含量增加，促进有益微生物的活动。焦平林等 12背壮志，王婷，汪天虹，等.瑞氏木霉内切葡聚糖酶川基因的克隆 (1996)给32头患白痢黄的犊牛每天服纤维素酶50g, 及在酿酒酵母中的表达皿微生物学报，2001,414)：391396 13 Takashin a S,Nakam ura A,H idaka M,et alM olecular cning and 并结合使用抗菌类药物，32头黄犊牛全部治愈，治愈 expression of the novel fungal beta-glcosidase genes fiom Hum i 率100%：对17头患前胃迟缓的黄牛每天内服纤维素 cola grisea and Trichodem a reesei l Joumal of Biochem istry. 酶40g,治愈16头，治愈率94.12%：对19头患瘤胃积 1999.1254):28~736 食的黄牛，使用纤维素酶进行治疗，治愈16头，治愈 14董秀芹.秸杆固态发酵酒精高产菌株的选育D]中国农业大学硕 士论文，2001.5153 率84.21%，总治愈率92.78%，表现出了理想的治疗效 15邱雁临.纤维素酶的研究和应用前景[粮食与饲料工业，2001 果的。陈侠甫等(1988)在多年研究的基础上认为，纤 8):3031 维素酶对马急慢性消化不良、便秘，牛前胃迟缓、瘤胃 16刘春芬，贺稚非，蒲海燕，等.纤维素酶及应用现状①粮食与油 脂，20040)：1517 膨胀、瘤胃积食等疾病具有明显疗效四。 17吴石金，罗锡平，夏一峰，等.里氏木霉产纤维素酶系各组分分泌 5总结 特性1浙江林学院学报，2003,202)：146150 我国是一个饲料资源十分紧张的国家，人畜争粮 18曹健，郭德宪，曾实，等.一株里氏木霉产纤维素酶的条件及酶系 的优化[郑州工程学院学报，2003,241)：1019 的矛盾比较突出，要保持我国饲料工业和畜牧业的持 19涂璇，薛泉宏，司美茹，等.多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响 续发展，必须解决好饲料资源紧张的问题。纤维素是 工业微生物，2004,34)：3034 自然界十分丰富的资源，如能加以充分利用，必将产 20方俊.纤维素酶在奶牛饲料中的研究与应用[们饲料博览，2003 (8:3436 生巨大的经济效益。目前所选育的菌株虽然具有一定 21焦平林，苏辉纤维素酶制剂对肉牛及奶牛生产性能的影响们中 的产酶能力，但应用于生产还很不理想，仍然需要寻 国畜牧杂志，1997,33)：43 找新的产纤维素酶菌株或进一步选育高产菌株。高产 22尹清强.纤维素酶对绵羊增重效果的观察[几内蒙古畜牧业，1991 6):12 真菌的基因克隆表达仍是一个重要的研究方向。此 23陈侠甫，裴相元.纤维素酶曲添加剂对鹿茸产量及饲料消化率的 外，纤维素酶系的协同降解机制还需要进一步深入研 影响[1兽医大学学报，19904)：382386 究，以便更好地发挥各组分的作用，使纤维素充分水 24 Graham H.Fadel J G.Newm an C W,et al Effect of pelleting and gucanase supplem entation on the ileal and fecal digestibility of a 解。因此，今后应加强这些方面的研究以使其在实际 barley -based diet n the pig [lJoumal of Anim al Science. 生产中得到更广泛的应用。 1989,67:12931298 25徐奇友，秦江帆.纤维素酶在蛋鸡日粮的应用研究饲料工业， 参考文献 1998.190):3233 1任大明，刻昭社.浅谈饲用纤维素酵的生产与应用们饲料工业， 26焦平林，张秀乾.纤维素酶治疗黄牛胃肠疾病试验报告☐畜牧兽 1995,1d3):1`3 医杂志.199615：2526 2 Fogarty M,Catherine Kelly T.M icrobial enzym es and biotechnobgy 27陈侠甫，阁维公.应用木聚糖纤维素酶治疗马、牛胃肠病①中国 end edition)M ID eparm ent of Industrial M icrobiobgy.University 兽医杂志，19882：3233 Dublin.R epublic of Ireland,1990.14 3张继泉，王瑞明绿色木霉生产纤维素酶的进展们山东食品发酵 20040:12^25 4董志扬，祝令香，于巍，等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶 (编辑：孙崎峰，s9D452@126.c0m)
降低饲料粘性, 提高酶的催化效率; 改善胃中菌群结 构及比例, 同时增加单细胞蛋白含量; 维持小肠绒毛 形态完整、促进营养物质的吸收; 能与半纤维素酶、果 胶酶、β- 葡聚糖酶等其它酶协同作用, 因此, 使用复合 酶制剂要比单独使用纤维素酶的效果好[20] 。近年来国 内外大量的饲养试验、消化代谢试验[21- 25] 都已证明, 在 畜禽饲料中添加纤维素酶能明显提高动物对粗纤维、 粗蛋白等营养物质的利用率, 促进生长发育和改善生 产性能。 另外, 纤维素酶在草食性家畜胃肠疾病的治疗方 面也有一定应用。纤维素酶降解纤维素的功能一方面 直接降低了它们的致病因素; 另一方面, 使可溶性物 质含量增加, 促进有益微生物的活动。焦平林等 ( 1996) 给 32 头患白痢黄的犊牛每天服纤维素酶 50g, 并结合使用抗菌类药物, 32 头黄犊牛全部治愈, 治愈 率 100%; 对 17 头患前胃迟缓的黄牛每天内服纤维素 酶 40g, 治愈 16 头, 治愈率 94.12%; 对 19 头患瘤胃积 食的黄牛, 使用纤维素酶进行治疗, 治愈 16 头, 治愈 率 84.21%, 总治愈率 92.78%, 表现出了理想的治疗效 果[26] 。陈侠甫等( 1988) 在多年研究的基础上认为, 纤 维素酶对马急慢性消化不良、便秘, 牛前胃迟缓、瘤胃 膨胀、瘤胃积食等疾病具有明显疗效[27] 。 5 总结 我国是一个饲料资源十分紧张的国家, 人畜争粮 的矛盾比较突出, 要保持我国饲料工业和畜牧业的持 续发展, 必须解决好饲料资源紧张的问题。纤维素是 自然界十分丰富的资源, 如能加以充分利用, 必将产 生巨大的经济效益。目前所选育的菌株虽然具有一定 的产酶能力, 但应用于生产还很不理想, 仍然需要寻 找新的产纤维素酶菌株或进一步选育高产菌株。高产 真菌的基因克隆表达仍是一个重要的研究方向。此 外, 纤维素酶系的协同降解机制还需要进一步深入研 究, 以便更好地发挥各组分的作用, 使纤维素充分水 解。因此, 今后应加强这些方面的研究以使其在实际 生产中得到更广泛的应用。 参考文献 1 任大明, 刘昭壮.浅谈饲用纤维素酶的生产与应用[J].饲料工业, 1995, 16( 3) : 1~3 2 Fogarty M, Catherine Kelly T. Microbial enzymes and biotechnology (2nd edition) [M].Department of Industrial Microbiology, University Dublin. Republic of Ireland, 1990.1~4 3 张继泉, 王瑞明.绿色木霉生产纤维素酶的进展[J].山东食品发酵, 2001( 4) : 12~25 4 董志扬, 祝令香, 于巍, 等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶 条件研究[J].核农学报, 2001, 15( 1) : 26~31 5 邱雁临, 孙宪迅, 蔡俊, 等.纤维素酶耐高温高产菌株的选育[J].中 国酿造, 2004(2): 15~19 6 管斌, 孙艳玲, 等.纤维素酶高产菌株的选育[J].中国酿造, 2002 ( 4) : 18~21 7 周正红, 方善康.黑曲霉原生质体电融合研究[J].生物工程学报, 1993, 9(3): 241~246 8 胡利勇, 钟卫鸿.纤维素酶基因克隆及其功能性氨基酸研究进展 [J].生物技术, 2003(4): 43~44 9 汪天虹, 吴静, 邹玉霞.瑞氏木霉分子生物学研究进展[J].菌物系 统, 2000, 19(1): 147~152 10 胡寅, 莫建初.国内外纤维素酶研究概况[J].城市害虫防治, 2003 ( 2) : 19~24 11 Godbole S,Decker SR,Nieves R A, et al. Cloning and expression of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Ⅰ in pichia pastoris [J]. Biotechnology Progress,1999,15(5):828~833 12 肖壮志, 王婷, 汪天虹, 等.瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ基因的克隆 及在酿酒酵母中的表达[J].微生物学报, 2001, 41(4): 391~396 13 Takashima S, Nakamura A, Hidaka M, et al.Molecular cloning and expression of the novel fungal beta- glucosidase genes from Humicola grisea and Trichoderma reesei [J]. Journal of Biochemistry, 1999, 125(4): 28~736 14 董秀芹.秸秆固态发酵酒精高产菌株的选育[D].中国农业大学硕 士论文, 2001.51~53 15 邱雁临.纤维素酶的研究和应用前景[J].粮食与饲料工业, 2001 (8): 30~31 16 刘春芬, 贺稚非, 蒲海燕, 等.纤维素酶及应用现状[J].粮食与油 脂, 2004(1): 15~17 17 吴石金, 罗锡平, 夏一峰, 等.里氏木霉产纤维素酶系各组分分泌 特性[J].浙江林学院学报, 2003, 20( 2) : 146~150 18 曹健, 郭德宪, 曾实, 等.一株里氏木霉产纤维素酶的条件及酶系 的优化[J].郑州工程学院学报, 2003, 24( 1) : 10~19 19 涂璇, 薛泉宏, 司美茹, 等.多元混菌发酵对纤维素酶活性的影响 [J]. 工业微生物, 2004, 34( 1) : 30~34 20 方俊. 纤维素酶在奶牛饲料中的研究与应用[J].饲料博览, 2003 ( 8) : 34~36 21 焦平林, 苏辉.纤维素酶制剂对肉牛及奶牛生产性能的影响[J].中 国畜牧杂志, 1997, 33(2): 43 22 尹清强.纤维素酶对绵羊增重效果的观察[J].内蒙古畜牧业, 1991 (6): 12 23 陈侠甫,裴相元.纤维素酶曲添加剂对鹿茸产量及饲料消化率的 影响[J].兽医大学学报, 1990(4): 382~386 24 Graham H, Fadel J G, Newman C W, et al. Effect of pelleting and glucanase supplementation on the ileal and fecal digestibility of a barley - based diet in the pig [J].Journal of Animal Science, 1989, 67: 1 293~1 298 25 徐奇友, 秦江帆.纤维素酶在蛋鸡日粮的应用研究[J].饲料工业, 1998, 19(1): 32~33 26 焦平林, 张秀乾.纤维素酶治疗黄牛胃肠疾病试验报告[J].畜牧兽 医杂志, 1996( 15) : 25~26 27 陈侠甫, 阎维公.应用木聚糖纤维素酶治疗马、牛胃肠病[J].中国 兽医杂志, 1988( 2) : 32~33 ( 编辑: 孙崎峰, sqf0452@126.com) 胡春霞等: 真菌纤维素酶及其在饲料中的应用 酶 工 程 17