中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期2005年3月 ·451· ·专论与综述· 生物技术在药用真菌资源开发与保护中的应用 周选围2，陈文强，邓百万，王智1，彭浩，林娟 (1.陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723001；2.上海交通大学植物生物技术研究中心， 上海200030；3.复旦大学遗传研究所，上海200433) 摘要：生物技术的飞速发展给中医药科学研究带来了革命性的变化，药用真菌是中药的重要组成部分。综述了我 国药用真菌资源的现状和开发利用概况；真菌生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等基本内容及 其在药用真菌资源开发、利用与保护中的应用。讨论了生物技术在传统药用真菌生产、地道药用真菌培育及选种鉴 定、利用基因工程和细胞培养技术高效表达和生产天然活性成分或转基因真菌以及利用基因工程手段提高真菌代 谢产物的含量、生物技术在药物筛选等方面的应用前景。 关键词：生物技术：药用真菌；开发利用 中图分类号：R282.1 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2005)03-0451-05 Application of biotechnology to exploitation and preservation of medicinal fungi ZHOU Xuan-weil2,CHEN Wen-qiang',DENG Bai-wan',WANG Zhi',PENG Hao',LIN Juan (1.Shaanxi Key Laboratory of Bio-Resources,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China; 2.Plant Biotechnology Research Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200030,China; 3.Genetic Institute of Fudan University,Shanghai 200433,China) Key words:biotechnology;medicinal fungi;exploitation and application 生物技术(biotechnology)又称生物工程 对象，已引起国内外医药工作者的高度重视。现已确定有药 (bioengineering),是指人们以现代生命科学为基础，结合先 用价值的真菌有298种，分布在41个科110属中，是药用低 进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的 等植物中种数最多的一类。药用真菌主要分布在子囊菌纲和 设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产 担子菌纲中，担子菌纲尤为突出，药用种数约占药用真菌的 品或达到某种目的的一系列技术。药用真菌(medicinal 90%。担子菌纲中70%的药用真菌又主要集中在6个较大 fungi)是指对人体有保健作用、对疾病有治疗、预防作用的 的科，即多孔菌科(27属74种)、口蘑科(18属45种)、红菇 一类真菌。它可分为两大类：一类是药食兼用型，如香菇、姬 科(2属33种)、牛肝菌科(5属16种)、马勃科(6属13种)和 松茸、木耳、猴头菌、金针菇、竹荪等；另一类是医药专用型， 蘑菇科(2属12种)。药用真菌分布较多的属有多孔菌属、羊 如灵芝、云芝、猪苓、麦角菌、冬虫夏草等)。随着人们生活水 肚菌属、红姑属、侧耳属等。灵芝属是研究最深入的一个属， 平的提高，对生活质量和健康长寿的褐望日趋强烈，单纯依 灵芝属真菌全世界有100余种，中国有93种。中国是世界上 靠化学药物难以满足人们的要求，加上20世纪由于抗生素 灵芝种数最多的国家，海南省是中国的“灵芝王国”，有54 类药物的滥用而导致细菌抗药性的提高和对人体产生的不 种，云南次之有30种2)，本属可药用的的真菌有7种。担子 良反应，使人们越来越普遍地认识到天然药物的重要性，崇 菌中常用药用真菌有茯苓Poria cocos(Schw.）Wolf、灵芝 尚天然药物便成为一种世界性潮流，包括药用真菌在内的天 Ganodderma lucidum(Leys.exFr.)Karst.、雷丸Polyporus 然药物的合理开发和利用，以及有效的保护便成了科技工作 ylittae Cooke et Mass、.马勃（头状马勃）Calvatia crani- 者关注的热点。 iformis(Schw.)Fr.、银耳Tremella fuciformis Berk.等，其 1我国药用真菌资源及生产概况 他还有猴头菌Hericium erinaceus(Bull.exFr.)Pers.、云 1.1我国药用真菌资源现状：在自然界中现存的真菌大约 芝Coriolus versicolor(L.exFr.）Qucl.、竹黄Shiraia bam- 有20~25万种，我国已报道的有8000多种，其中传统药及 busicola Henn.、侧耳Pleurotus ostreatus(Jacq,exFr.） 试验有药效的大型真菌和部分小型真菌多达400余种。目前 Quel.、木耳Auricularia auricula(L.ex Hook.)Underw.、 在筛选新药及寻找抗癌药物方面，大型真菌作为重要的研究 苦白蹄Laricifomes officinalis(Vill.exFr.)Kotlabaet 收稿日期：2004-05-18 基金项目：陕西省教育厅省级重点实验室科研与建设项目资助(04JS32) 作者简介：周选围(1962一)，男，陕西咸阳人，陕西理工学院生物系教授，主要从事微生物资源的保护、开发和利用
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 ·451· ·专论与综述 · 生物技术在药用真菌资源开发与保护中的应用 周选围1,2，陈文强‘ ，邓百万‘ ，王 智‘ ，彭 浩‘ ，林 娟3 (I.陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001;2.上海交通大学 植物生物技术研究中心 上海 200030; 3.复旦大学遗传研究所，上海 200433) 摘 要:生物技术的飞速发展给中医药科学研究带来了革命性的变化，药用真菌是中药的重要组成部分。综述了我 国药用真菌资源的现状和开发利用概况;真菌生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等基本内容及 其在药用真菌资源开发、利用与保护中的应用。讨论了生物技术在传统药用真菌生产、地道药用真菌培育及选种鉴 定、利用基因工程和细胞培养技术高效表达和生产天然活性成分或转基因真菌以及利用基因工程手段提高真菌代 谢产物的含量、生物技术在药物筛选等方面的应用前景。 关键词:生物技术;药用真菌;开发利用 中图分类号:R282. 1 文献标识码:A 文章编号:0253一2670(2005)03一0451一05 Application of biotechnology to exploitation and preservation of medicinal fungi ZHOU Xuan-weil'2，CHEN Wen-giang ' ，DENG Bai-wan ' ，WANG Zhi' ，PENG Hao ' ，LIN Juan ' (1. Shaanxi Key Laboratory of Bio-Resources，Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001，China; 2. Plant Biotechnology Research Center，Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China; 3. Genetic Institute of Fudan University, Shanghai 200433, China) Key words:biotechnology;medicinal fungi;exploitation and application 生 物 技 术 (biotechnology)又 称 生 物 工 程 (bioengineering)，是指人们以现代生命科学为基础，结合先 进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的 设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产 品或达到某种 目的的一系列技术。药用真菌(medicinal fungi)是指对人体有保健作用、对疾病有治疗、预防作用的 一类真菌。它可分为两大类:一类是药食兼用型，如香菇、姬 松茸、木耳、猴头菌、金针菇、竹荪等;另一类是医药专用型， 如灵芝、云芝、猪菩、麦角菌、冬虫夏草等[il。随着人们生活水 平的提高，对生活质量和健康长寿的渴望日趋强烈，单纯依 靠化学药物难以满足人们的要求，加上 20世纪由于抗生素 类药物的滥用而导致细菌抗药性的提高和对人体产生的不 良反应，使人们越来越普遍地认识到天然药物的重要性，崇 尚天然药物便成为一种世界性潮流，包括药用真菌在内的天 然药物的合理开发和利用，以及有效的保护便成了科技工作 者关注的热点。 1 我国药用真菌资源及生产概况 1.1 我国药用真菌资源现状:在自然界中现存的真菌大约 有 20-25万种，我国已报道的有 8 000多种，其中传统药及 试验有药效的大型真菌和部分小型真菌多达400余种。目前 在筛选新药及寻找抗癌药物方面，大型真菌作为重要的研究 对象，已引起国内外医药工作者的高度重视。现已确定有药 用价值的真菌有 298种，分布在 41个科 110属中，是药用低 等植物中种数最多的一类。药用真菌主要分布在子囊菌纲和 担子菌纲中，担子菌纲尤为突出，药用种数约占药用真菌的 9000。担子菌纲中70%的药用真菌又主要集中在 6个较大 的科，即多孔菌科(27属 74种)、口蘑科(18属 45种)、红菇 科(2属 33种)、牛肝菌科(5属 16种)、马勃科(6属 13种)和 蘑菇科(2属 12种)。药用真菌分布较多的属有多孔菌属、羊 肚菌属、红姑属、侧耳属等。灵芝属是研究最深人的一个属， 灵芝属真菌全世界有 100余种，中国有 93种。中国是世界上 灵芝种数最多的国家，海南省是中国的“灵芝王国” ，有 54 种，云南次之有 30种[21，本属可药用的的真菌有 7种。担子 菌中常用药用真菌有获荃 Poria cocas (Schw. ) Wolf、灵芝 Ganodderma lucidum (Leys. ex Fr.)Karst.、雷丸Polyporus mylittae Cooke et Mass、马勃(头状马勃)Calvatia craniiformis (Schw.)Fr.、银耳Tremella fuciformis Berk.等，其 他还有猴头菌Hericium erinaceus (Bull. ex Fr. ) Pers.、云 芝 Coriolus versicolor (L. ex Fr.)Quel.、竹黄 Shiraia bambusicola Henn.、侧 耳 Pleurotus ostreatus (Jacq. ex Fr.) Quel.、木耳 Auricularia auricula (L. ex Hook. ) Underw. , 苦 白蹄 Laricifomes officinalis (Vill. ex Fr. ) Kotlabaet 2004-05-18 陕西省教育厅省级重点实验室科研与建设项目资助(04JS32) 周选围(1962-)，男，陕西咸阳人，陕西理工学院生物系教授，主要从事微生物资源的保护、开发和利用
·452· 中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期2005年3月 Pouzar)、鸡纵Termitomyces albuminosus(Berk.）Heim、香 菌多糖（真菌细胞壁的主要成分之一），成为人们研究的热 菇Lentinus edodes(Berk.）Sing.、竹荪（短裙竹荪）Dic 点，如灵芝多糖中的(1→3)-BD-葡聚糖具有抗癌作用，这些 tyophora duplicata(Bosc.)Fischer等。 多糖成分极有可能成为一种新的抗癌药物：另据最新的研究 子囊菌纲中的药用真菌主要集中在麦角菌科(5属10 显示，灵芝酸(ganoderic acids,GAs)具有抗肿瘤和抗艾滋病 种)、肉座菌科(4属4种)、黑粉菌科(2属4种)。虫草属是较 病毒的作用s,6]。菌物界(Mycosystema)的真菌种类大约有 重要的属，中国共有58种。据报道，本属有药用价值并已利 150万种，被描述的约有20万种，其中真菌门(Eumycota)占 用或研究开发的有20种（包括无性型），主要有冬虫夏草 相当比例，若按估计的40万种计算，已开发人药的种类仅占 Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.、蛹虫草（北冬虫夏草）C. 0.01%~0.1%,因此利用药用真菌开发新药，服务于人类生 militris(L.exFr.)Link、蝉花C.sobolifera(Hill)Berk.et 活具有十分巨大的发展潜力。 Br.、大蝉草C.cicadae Shing等。中国台湾(22种)、广东(17 2药用真菌生物技术的研究内容 种)、云南(13种)等地虫草种类较多，资源较丰富。冬虫夏草 生物技术是一门既古老又现代的应用技术。第1代生物 主产于中国西南高海拔地区，过去完全靠采挖野生资源提供 技术是19世纪末到20世纪30年代以发酵产品为主干的工 药用，货源紧张。经多年研究试验，人工培育冬虫夏草已获成 业微生物技术体系；第2代（近代）生物技术是以20世纪40 功，并投人生产。属于子囊菌纲的药用真菌还有玉米黑粉菌、 年代抗菌素的提取，50年代氨基酸的发酵到60年代酶制剂 小麦散黑粉菌（麦奴）、谷子黑粉菌（粟奴）、麦角菌、稻曲菌、 工程为线索；第3代即现代生物技术是一个跨学科的应用技 高粱黑粉菌等。 术领域，它是以世界上第一家生物技术(genetech,遗传技 药用真菌在藻状菌纲和半知菌纲很少分布，只有粟白发 术)公司的诞生年(1976)为纪元。生物技术来自biotechnolo- (糠谷老)、白僵菌等有一定的药用价值。真菌的药用历史较 gy译语，随着科技水平的发展，生物技术的概念也随之不断 久，古代本草多有收载，但种类不多。目前，药用真菌已引起 变化；生物技术包括基因工程(genetic engineering)、细胞工 广泛注意，有些种类如蜜环菌Armillaria mellea(Vahl ex 程(cell engineering)、酶和蛋白质工程(enzyme and protein Fr.)Karst.、亮菌Armillariella tabescens(Scop.exFr.) engineering)、发酵工程(fermentation engineering)等技术。 Sing:等是近年才开始开发利用的。 2.1基因工程技术：基因工程是指在基因水平上，采用与工 1.2药用真菌的开发利用概况：药用真菌的开发利用，目前 程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按 主要体现在两个方面：一是把药用真菌开发成药品，直接用 设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并使之能 于疾病的治疗；二是把药用真菌开发成保健品，用于调节或 稳定地遗传给后代。基因工程技术包括：目的基因的克隆、转 改善机体功能。我国古代就有用真菌防病、治病的记载，但真 基因载体系统的构建、遗传转化、外源基因的检测以及品种 正将其进一步开发成产品应用于人类防病、治病却始于20 培育等技术。其核心技术是DNA的重组技术，也就是基因 世纪60~80年代，这一时期药用真菌的研究步人了一个明 克隆(gene cloning)技术。重组(recombination)就是重新组 显发展阶段，在此期间的开发主要是野生真菌如灵芝、银耳、 合，即利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体 猴头等的驯化培养和真菌有效成分的生产，开发了近10种 外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组 新药。20世纪80年代后期卫生部“新药审批办法”颁布后， DNA分子，然后将重组DNA分子导入受体细胞或受体生 用真菌为原料生产的新药都定为中药一类新药，有严格的研 物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一 究开发要求，故此后的10余年仅3种真菌被正式批准药用， 种生物的某种性状。如用植物来生产人的乳铁蛋白、抗凝血 它们分别是虫草的发酵产品“金水宝”与“宁心宝”等；槐耳菌 酶和白蛋白。 Trametes robiniophila Murr,的固体发酵产品“槐耳菌质”及 基因工程在药用真菌中的应用，主要包括以下两个方 制剂“槐耳颗粒”，黑柄炭角菌Xylaria nigripes(Kl.)Sacc, 面：一是利用药用真菌作为新的基因工程的受体菌，即作为 的液体发酵产品“护龄神”等。另外已证实有药用价值并正在 生物反应器(bioreactor)来生产人们所期望的外源基因编码 开发待批准药用的品种有裂褶菌Schizophyllum commune 的产品。由于药用真菌还具有很强的外泌蛋白能力，利用药 Fr.、蛹虫草、金耳Tremella aurantia Schw.exFr.等。据统 用真菌作为新的受体菌将更为安全，更易被消费者接受；二 计，我国正式入药的药用真菌总数仅50种左右，常用的不到 是利用基因工程技术定向培育药用真菌的新品种，包括抗 30种，被收录于《中华人民共和国药典》的仅6种（若将有丰 虫、抗病、优质（富含蛋白质、必需氨基酸或延长寿命等）的新 富营养或保健价值的品种合计在内约有450种)3]。 品种，以及将编码纤维素或木质素降解酶基因导入药用真菌 近年来随着科技发展和研究手段的不断更新，在真菌中 体内，以提高真菌菌丝对栽培基质的利用率或开拓新的栽培 发现了许多具有药用价值的次生代谢产物，这为人类开发新 基质，最终提高药用真菌产量和质量。 型的医药、农药、保健食品、化妆品等提供了重要的新资 此外，随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性 源。在医药方面，随着微生物研究的深人以及分离和结构 的分子标记，如RFLP(restriction fragment length polymor- 鉴定技术不断发展，在真菌中发现了许多酶、抗生素或其他 phism )RAPD (random amplified polymorphism DNA ) 具有药物活性的产物。其中，具有免疫调节和抗癌活性的真 AFLP (amplified fragment length polymorphism),STS
·452· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 Pouzar151、鸡纵Termitomyces albuminosus (Berk.)Heim、香 菇 Lentinus edodes (Berk.)Sing.、竹荪(短裙竹荪)Dictyophora duplicata (Bosc.)Fischer等。 子囊菌纲中的药用真菌主要集中在麦角菌科(5属 10 种)、肉座菌科(4属4种)、黑粉菌科(2属 4种)。虫草属是较 重要的属，中国共有 58种。据报道，本属有药用价值并已利 用或研究开发的有 20种(包括无性型)，主要有冬虫夏草 Cor办ceps sinensis (Berk. ) Sacc.、蛹虫草(北冬虫夏草)C. militris (L. ex Fr.)Link、蝉花C. sobolifera (Hill) Berk. et Br.、大蝉草C. cicadae Shing等。中国台湾(22种)、广东(17 种)、云南(13种)等地虫草种类较多，资源较丰富。冬虫夏草 主产于中国西南高海拔地区，过去完全靠采挖野生资源提供 药用，货源紧张。经多年研究试验，人工培育冬虫夏草已获成 功，并投人生产。属于子囊菌纲的药用真菌还有玉米黑粉菌、 小麦散黑粉菌(麦奴)、谷子黑粉菌(粟奴)、麦角菌、稻曲菌、 高梁黑粉菌等。 药用真菌在藻状菌纲和半知菌纲很少分布，只有粟白发 (糠谷老)、白僵菌等有一定的药用价值。真菌的药用历史较 久，古代本草多有收载，但种类不多。目前，药用真菌已引起 广泛注意，有些种类如蜜环菌 Armillaria mellea (Vahl ex Fr.) Karst.、亮菌 Armillariella tabescens (Scop. ex Fr. ) Sing.等是近年才开始开发利用的。 1.2 药用真菌的开发利用概况:药用真菌的开发利用，目前 主要体现在两个方面:一是把药用真菌开发成药品，直接用 于疾病的治疗;二是把药用真菌开发成保健品，用于调节或 改善机体功能。我国古代就有用真菌防病、治病的记载，但真 正将其进一步开发成产品应用于人类防病、治病却始于 20 世纪 60-80年代，这一时期药用真菌的研究步人了一个明 显发展阶段，在此期间的开发主要是野生真菌如灵芝、银耳、 猴头等的驯化培养和真菌有效成分的生产，开发了近 10种 新药。20世纪 80年代后期卫生部“新药审批办法”颁布后， 用真菌为原料生产的新药都定为中药一类新药，有严格的研 究开发要求，故此后的 10余年仅 3种真菌被正式批准药用， 它们分别是虫草的发酵产品“金水宝”与“宁心宝”等;槐耳菌 Trametes robiniophila Murr·的固体发酵产品“槐耳菌质”及 制剂“槐耳颗粒” ，黑柄炭角菌Xylaria nigripes (KI. ) Sacc. 的液体发酵产品“护龄神”等。另外已证实有药用价值并正在 开发待批准药用的品种有裂褶菌Schizophyllum commune Fr.、蛹虫草、金耳Tremella aurantia Schw. ex Fr.等。据统 计，我国正式人药的药用真菌总数仅 50种左右，常用的不到 30种，被收录于《中华人民共和国药典》的仅 6种(若将有丰 富营养或保健价值的品种合计在内约有 450种户〕。 近年来随着科技发展和研究手段的不断更新，在真菌中 发现了许多具有药用价值的次生代谢产物，这为人类开发新 型的医药、农药、保健食品、化妆品等提供 了重要的新资 源[4]。在医药方面，随着微生物研究的深入以及分离和结构 鉴定技术不断发展，在真菌中发现了许多酶、抗生素或其他 具有药物活性的产物。其中，具有免疫调节和抗癌活性的真 菌多糖(真菌细胞壁的主要成分之一)，成为人们研究的热 点，如灵芝多糖中的(1-3 )-件D-葡聚糖具有抗癌作用，这些 多糖成分极有可能成为一种新的抗癌药物;另据最新的研究 显示，灵芝酸(ganoderic acids,GAs)具有抗肿瘤和抗艾滋病 病毒的作用[5.61。菌物界(Mycosystema)的真菌种类大约有 150万种，被描述的约有 20万种，其中真菌门(Eumycota)占 相当比例，若按估计的40万种计算，已开发人药的种类仅占 0.01%一。.1%，因此利用药用真菌开发新药，服务于人类生 活具有十分巨大的发展潜力。 2 药用真菌生物技术的研究内容 生物技术是一门既古老又现代的应用技术。第 1代生物 技术是 19世纪末到 20世纪 30年代以发酵产品为主干的工 业微生物技术体系;第 2代(近代)生物技术是以20世纪 40 年代抗菌素的提取，50年代氨基酸的发酵到 60年代酶制剂 工程为线索;第 3代即现代生物技术是一个跨学科的应用技 术领域，它是以世界上第一家生物技术(genetech，遗传技 术)公司的诞生年(1976)为纪元。生物技术来自biotechnology译语，随着科技水平的发展，生物技术的概念也随之不断 变化;生物技术包括基因工程(genetic engineering)、细胞2 程(cell engineering),酶和蛋白质工程(enzyme and protein engineering)、发酵工程(fermentation engineering)等技术。 2.1 基因工程技术:基因工程是指在基因水平上，采用与工 程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按 设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并使之能 稳定地遗传给后代。基因工程技术包括:目的基因的克隆、转 基因载体系统的构建、遗传转化、外源基因的检测以及品种 培育等技术。其核心技术是 DNA的重组技术，也就是基因 克隆(gene cloning)技术。重组(recombination)就是重新组 合，即利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体 外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组 DNA分子，然后将重组DNA分子导入受体细胞或受体生 物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一 种生物的某种性状。如用植物来生产人的乳铁蛋白、抗凝血 酶和白蛋白。 基因工程在药用真菌中的应用，主要包括以下两个方 面:一是利用药用真菌作为新的基因工程的受体菌，即作为 生物反应器(bioreactor)来生产人们所期望的外源基因编码 的产品。由于药用真菌还具有很强的外泌蛋白能力，利用药 用真菌作为新的受体菌将更为安全，更易被消费者接受;二 是利用基因工程技术定向培育药用真菌的新品种，包括抗 虫、抗病、优质(富含蛋白质、必需氨基酸或延长寿命等)的新 品种，以及将编码纤维素或木质素降解酶基因导人药用真菌 体内，以提高真菌菌丝对栽培基质的利用率或开拓新的栽培 基质，最终提高药用真菌产量和质量。 此外，随着分子生物学技术的发展，基于 DNA多态性 的分子标记，如RFLP (restriction fragment length polymorphism)、RAPD (random amplified polymorphism DNA)、 AFLP(amplified fragment length polymorphism)、STS
中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期2005年3月 ◆453· (sequence tagged sites)VNTR(variable number of tandem 先提出用发酵法来培养真菌菌丝体。1958年Szuecs第一个 repeat)、SCAR(sequence characterized amplified region)等， 用发酵缸来培养羊肚菌。从此药用真菌的生产跨人了大规模 在药用真菌的遗传育种、开发产品的鉴别中也逐步得到了应 工业化生产领域。国内较早报道的是1960年上海生理研究 用[~)。Terashima等1o应用AFLP技术对日本香菇的培养 所的陈美聿等人进行的香菇深层发酵研究。20世纪80年代 菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究，评估了日本香菇主 后，国内外纷纷开展了有关药用真菌液体发酵（主要是深层 要培养菌株之间的DNA片断多肽性的变化范围，评价了 发酵)应用研究。适合液体发酵的药用真菌目前有70余种。 AFLP标记作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了 除余知知)提到的60余种适合液体发酵的药用真菌外，还 它们之间的遗传相关性。6个AFLP引物在总共15株培养 有平菇、松乳菇、层卧孔菌、黑柄碳角菌、滑菇、构菌、玉草离 菌株中共检测出304个DNA片段，其中有179个DNA片 褶伞和金钱菌等。药用真菌的液体发酵，既可快速大量生产 段在？个或更多菌株间呈多态性。这些多态性DNA片段可 制备出多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、 以将所有的培养菌株区分开来。建立在AFLP数据基础上的 酶、核酸、氨基酸、蛋白质、维生素等多种生化物质：同时，还 群丛系统分析将它们分为了2个不同群组。同时，他们还在 可生产出菌龄整齐一致、生活力强、数量巨大的液体菌种，满 203个AFLP标记和2个结合型因子基础上建立了日本香 足扩大生产的需要。 菇的中密度遗传连锁图谱)。 药用真菌深层发酵生产工艺流程沿用了传统的发酵生 2.2原生质体技术：原生质体技术是利用原生质体诱变、杂 产工艺，即试管斜面菌种-→一级摇瓶种→二级种+三级种→ 交、转基因等创造变异新类型的生物技术。最早报道真菌原 发酵罐。有关培养基配方方面的研究包括碳源、氮源、碳氨 生质体分离的是荷兰的De Viies和Wessels,他们于1972年 比、pH值、无机盐、微量元素、维生素、生长因子、增黏剂等； 用从Trichoderma viride Pers.中制备的裂解酶分离了裂褶 有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌速 菌的原生质体，随后又分离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。 度、空气流量、糖含量、H值、纯度、活力、菌丝形状、发酵液 1980年后，随着商品脱壁酶的出现，从大型真菌中分离原生 中菌丝体个数和质量等。 质体的报道日益增多]。研究内容包括：原生质体的分离与 2.4酶工程技术：酶工程是利用酶的催化作用进行物质转 再生]、原生质体的融合、融合子的鉴定及遗传应用等。 化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术， 原生质体技术作为改良药用真菌菌种的一个途径，主要 也就是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定 应用在单核体杂交育种，远缘杂交育种、诱发突变型1幻、转 功能，借助工程学手段来提供产品的一项技术。药用真菌成 基因研究、克服品种退化等方面。随着分子生物学技术的不 分复杂，有药用成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、纤维等非必 断发展，药用真菌的原生质体技术在融合研究这一基础上与 须成分。这些成分一方面影响真菌细胞中药用成分的浸出， 分子生物学技术相结合得到了更广泛的发展。以脱去细胞壁 另一方面也影响中药液体制剂的澄清度。传统的提取方法 的裸露原生质体为材料，现已开展了外源基因的导入和转 (如煎煮、有机溶剂浸出和醇处理方法)提取温度高、提取率 化、DNA的分离和纯化、RFLP和PCR技术的应用、基因文 低、浪费乙醇、成本高、不安全：而选用恰当的酶，可通过酶反 库的构建等多项研究。 应较温和地将真菌组织分解，加速有效成分的释放提取，选 2.3发酵工程技术：发酵工程技术义称为微生物工程，是利 用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶 用现代工程技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物 等分解去除，也可促进某些极性低的脂溶性成分转化为糖苷 质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术。 类或易溶于水的成分而有利于提取。这是一项很有前途的新 药用真菌的发酵生产有固体发醇和液体发酵之分。固体 技术，完全适于工业化大生产。 发酵(solid fermentation)又称为“固体培养”，国外也曾有这 酶工程主要包括各类自然酶的生产开发技术，酶的分 种工艺，称为solid substrate fermentation(SSF),即固体基 离、纯化和鉴定技术，酶的固定化技术，酶分子改造技术，固 质发酵。国内目前固体发酵的基质多采用农副产品，工艺有 定化酶反应器的研制技术，酶的应用技术等。在药用真菌中， 两类：①去渣型工艺：用甘蔗渣、玉米芯、麦麸、米糠等作为基 能够通过工业化生产获得天然单一产物是人们追求的目标， 质，如猴头等多数药用真菌的发酵产品采用此工艺生产；② 但天然化合物结构复杂，常有多个不对称碳原子，合成难度 无渣型工艺：发酵后直接烘干的玉米粉作为基质，如亮菌、蜜 较大或合成条件苛刻；而酶工程为这类成分的获得提供了新 环菌等固体发酵的产品采用此工艺生产。在当前条件下，虽 的途径。酶工程技术在药用真菌的开发利用中如何发挥其作 然多种菌体发酵的制剂疗效并不亚于深层发酵，但有些部门 用，是今后值得研究的一个方向。 由于对它的理解不足而难以接受，严重影响了它的发展。尽 3生物技术在药用真菌研究和开发中的应用前景 管如此，药用真菌如猴头、云芝、蜜环菌等仍采取固体发酵的 目前生物技术在中药中的应用还十分有限，除了在细胞 生产方式。 工程和发酵工程方面有一定进展以外，基因工程刚刚起步， 液体发酵((liquid fermentation)也称液体深层发酵(Iiq- 而酶工程和蛋白质工程尚未涉及。因此，加强生物技术在中 uid submerged fermentation),是在抗生素发酵技术基础上 药基础和应用中的研究显得十分必要。药用真菌作为我国中 发展起来的，沿用了传统发酵生产工艺。1984年Humfeld首 药宝库中的一部分，生物技术在其开发利用中具有广阔的发
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 ·453· (sequence tagged sites), VNTR (variable number of tandem repeat), SCAR (sequence characterized amplified region)等， 在药用真菌的遗传育种、开发产品的鉴别中也逐步得到了应 用〔'-'I. Terashima等[to」应用AFLP技术对日本香菇的培养 菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究，评估了日本香菇主 要培养菌株之间的 DNA片断多肤性的变化范围，评价了 AFLP标记作为遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了 它们之间的遗传相关性。6个 AFLP引物在总共 15株培养 菌株中共检测出 304个 DNA片段，其中有 179个 DNA片 段在 2个或更多菌株间呈多态性。这些多态性 DNA片段可 以将所有的培养菌株区分开来。建立在AFLP数据基础上的 群丛系统分析将它们分为了2个不同群组。同时，他们还在 203个 AFLP标记和 2个结合型因子基础上建立了日本香 菇的中密度遗传连锁图谱[117 2. 2 原生质体技术:原生质体技术是利用原生质体诱变、杂 交、转基因等创造变异新类型的生物技术。最早报道真菌原 生质体分离的是荷兰的De Viies和Wessels，他们于1972年 用从 Trichoderma viride Pers.中制备的裂解酶分离了裂褶 菌的原生质体，随后又分离了双抱蘑菇和草菇的原生质体。 198。年后，随着商品脱壁酶的出现，从大型真菌中分离原生 质体的报道日益增多[127。研究内容包括:原生质体的分离与 再生[13]、原生质体的融合、融合子的鉴定及遗传应用等。 原生质体技术作为改良药用真菌菌种的一个途径，主要 应用在单核体杂交育种，远缘杂交育种、诱发突变型[14]、转 基因研究、克服品种退化等方面。随着分子生物学技术的不 断发展，药用真菌的原生质体技术在融合研究这一基础上与 分子生物学技术相结合得到了更广泛的发展。以脱去细胞壁 的裸露原生质体为材料，现已开展了外源基因的导人和转 化、DNA的分离和纯化、RFLP和PCR技术的应用、基因文 库的构建等多项研究。 2.3 发酵工程技术:发酵工程技术又称为微生物工程，是利 用现代工程技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物 质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术。 药用真菌的发酵生产有固体发醇和液体发酵之分。固体 发酵(solid fermentation)又称为“固体培养” ，国外也曾有这 种工艺，称为 solid substrate fermentation (SSF)，即固体基 质发酵。国内目前固体发酵的基质多采用农副产品，工艺有 两类:①去渣型工艺:用甘蔗渣、玉米芯、麦鼓、米糠等作为基 质，如猴头等多数药用真菌的发酵产品采用此工艺生产;② 无渣型工艺:发酵后直接烘干的玉米粉作为基质，如亮菌、蜜 环菌等固体发酵的产品采用此工艺生产。在当前条件下，虽 然多种菌体发酵的制剂疗效并不亚于深层发酵，但有些部门 由于对它的理解不足而难以接受，严重影响了它的发展。尽 管如此，药用真菌如猴头、云芝、蜜环菌等仍采取固体发酵的 生产方式。 液体发酵(liquid fermentation)也称液体深层发酵(liquid submerged fermentation)，是在抗生素发酵技术基础上 发展起来的，沿用了传统发酵生产工艺。1984年Humfeld首 先提出用发酵法来培养真菌菌丝体。1958年Szuecs第一个 用发酵缸来培养羊肚菌。从此药用真菌的生产跨人了大规模 工业化生产领域。国内较早报道的是 1960年上海生理研究 所的陈美幸等人进行的香菇深层发酵研究。20世纪80年代 后，国内外纷纷开展了有关药用真菌液体发酵(主要是深层 发酵)应用研究。适合液体发酵的药用真菌目前有 70余种。 除余知知[Clb」提到的 60余种适合液体发酵的药用真菌外，还 有平菇、松乳菇、层卧孔菌、黑柄碳角菌、滑菇、构菌、玉覃离 褶伞和金钱菌等。药用真菌的液体发酵，既可快速大量生产 制备出多糖、多肤、生物碱、菇类化合物、街醇、昔类、酚类、 酶、核酸、氨基酸、蛋白质、维生素等多种生化物质;同时，还 可生产出菌龄整齐一致、生活力强、数量巨大的液体菌种，满 足扩大生产的需要。 药用真菌深层发酵生产工艺流程沿用了传统的发酵生 产工艺，即试管斜面菌种~一级摇瓶种~二级种~三级种~ 发酵罐。有关培养基配方方面的研究包括碳源、氮源、碳氮 比、pH值、无机盐、微量元素、维生素、生长因子、增勃剂等; 有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌速 度、空气流量、糖含量、pH值、纯度、活力、菌丝形状、发酵液 中菌丝体个数和质量等。 2.4 酶工程技术:酶工程是利用酶的催化作用进行物质转 化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术， 也就是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定 功能，借助工程学手段来提供产品的一项技术。药用真菌成 分复杂，有药用成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、纤维等非必 须成分。这些成分一方面影响真菌细胞中药用成分的浸出， 另一方面也影响中药液体制剂的澄清度。传统的提取方法 (如煎煮、有机溶剂浸出和醇处理方法)提取温度高、提取率 低、浪费乙醇、成本高、不安全;而选用恰当的酶，可通过酶反 应较温和地将真菌组织分解，加速有效成分的释放提取，选 用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶 等分解去除，也可促进某些极性低的脂溶性成分转化为糖昔 类或易溶于水的成分而有利于提取。这是一项很有前途的新 技术，完全适于工业化大生产。 酶工程主要包括各类 自然酶的生产开发技术，酶的分 离、纯化和鉴定技术，酶的固定化技术，酶分子改造技术，固 定化酶反应器的研制技术，酶的应用技术等。在药用真菌中， 能够通过工业化生产获得天然单一产物是人们追求的目标， 但天然化合物结构复杂，常有多个不对称碳原子，合成难度 较大或合成条件苛刻;而酶工程为这类成分的获得提供了新 的途径。酶工程技术在药用真菌的开发利用中如何发挥其作 用，是今后值得研究的一个方向。 3 生物技术在药用真菌研究和开发中的应用前景 目前生物技术在中药中的应用还十分有限，除了在细胞 工程和发酵工程方面有一定进展以外，基因工程刚刚起步， 而酶工程和蛋白质工程尚未涉及。因此，加强生物技术在中 药基础和应用中的研究显得十分必要。药用真菌作为我国中 药宝库中的一部分，生物技术在其开发利用中具有广阔的发
·454· 中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期2005年3月 展前景。 药用成分含量增加，从而定向调控药用真菌的品质。焦点在 3.1传统药用真菌的生产：与传统的生产方式相比，应用生 于次生代谢途径中关键的酶和基因的定位、分离及克隆。 物技术进行传统药材生产和品质改进有明显的优点。生物技 3.5药用筛选：应用细胞培养技术，从细胞水平筛选药用成 术在药用真菌生产中的应用主要体现在防病虫害、优化品 分，进而在基因水平上确定其作用机制。中药主要通过调节 质、减少农药和重金属污染等方面。通过转基因技术，使药用 机体的整体机能，即通过对多靶点基因的表达调控而起作 真菌获得自身的抗虫、抗病毒能力，减少栽培过程中农药的 用，单味药和复方药都可通过其对相关药效基因表达的影响 使用，保证中药的天然、安全，从而促进出口和应用。目前野 (即药物基因组学)，在分子水平上建立中药活性检测系统。 生珍贵药用真菌因过度开采已出现濒临灭绝的危机，采用生 利用高通量的基因芯片技术，可以快速、准确进行高效药物 物工程技术对其进行研究开发，通过细胞工程、染色体工程、 的筛选。同时可对药物作用的靶基因进行鉴别，进一步检测 细胞融合等技术，可以培养出天然药用成分含量高的新的药 该药物是否会致畸或造成其他危险，加快特效复方药研制。 用真菌。同时建立适宜于低温液氮冷冻保存技术，对物种进 也可以利用DNA芯片分析用药前后整个机体的不同组织、 行保存，供进一步的研究。 器官基因表达差异。再用mRNA构建cDNA表达文库，然后 3.2地道药用真菌培育选种鉴定：主要利用DNA分子标 用得到的肽库制作肽芯片，即可以从众多的药物成分中筛选 记技术进行生药鉴定，选育地道药用真菌。药用真菌中作为 到起作用的部分物质。 药用的部位称为基原，它的真伪鉴别是中药质量研究、品质 4结语 评价以及药材学、炮制学、化学、药效学研究，乃至临床应用 随着科学技术的飞速发展、各种先进技术的产生与建 中必不可少的前提条件。传统的药用真菌鉴别主要依据的是 立，为药用真菌的研究开辟了更加广阔的领域，特别是在生 药材外观性状，而近代生药学主要从生物分类学（基原鉴 物技术领域，分子生物学已成为现代生命科学的共同语言， 别)、细胞组织学（显微鉴别）、化学（理化鉴别）角度建立了相 它不断地与其他学科进行广泛而深人的横向联系与交叉融 对客观的质量鉴别标准。DNA是最稳定的遗传信息，生物个 合)，为中医药（包括药用真菌）的发展与创新提供了强大 体不同组织器官的部位以至细胞都具备相同的遗传信息，利 的推动作用。将人类基因组学、生物信息学等前沿交叉学科 用基因与药物成分相关性的原理，可以更好的保护、利用及 的一些先进研究方法和手段如DNA分子标记技术、生物芯 寻找新的生药资源。通常采用RAPD技术及RFLP技术鉴 片技术等应用到中医药研究领域中，也将是中药现代化发展 定不同物种，并通过建立DNA指纹图谱，确立地道药材的 的新方向1副]，对药用真菌的开发利用与保护也是一个有益 分子指征（特异的DNA片段），并以其制备特异探针来检测 的启迪。 相应的药材，为中药质量标准化奠定了基础。 References: 3.3利用基因工程和细胞培养技术高效表达和生产天然活 [1]Zhang K C.The situation and feature of research and deve- lopment of pharmaceutical fungi [J.J Food Sci Biotechnol 性成分或转基因真菌：利用转基因技术，将特异基因导入快 (食品与生物技术)，2002,21(1)：99-103. 速生长繁殖的药用真菌中，生产外源基因编码的药用多肽和 [2] Zhou X W,Lin J.Resources of wild Ganaderma spp.in China and their development and utilization [J].Acta Edul 蛋白，是优化种质、解决药用真菌资源短缺问题的一个重要 Fungi(食用菌学报)，1999,6(1)：58-64. 途径16]。对于药用成分明确但含量极低或生长周期较长的 L3] Zhuang Y.Review of medicinal fungi from China [J.Edib Fungi China(中国食用菌)，2001,20(2)：3-5， 药材，可以选取适宜的真菌表达系统，通过转基因技术高效 [4 Lorenzen K,Anke T.Basidiomycetes as a source for new 表达外源基因，从而获得高效表达的药用成分，创造新的药 bioactive natural products [J].Curr Organ Chem,1998,2: 329-364. 用真菌资源。 [5] Wu T S,Shi L S,Kuo S C.Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes []]J Nat Prod,2001,64:1121-1122. 3,4提高代谢产物的含量，获取更多的有效成分：具有中国 [6] Tang Y J,Zhong J J.Role of oxygen supply on submerged 特色的生物技术医药工业中应用最广泛的就是中草药及其 fermentation of Ganoderma lucidum for production of Gano- derma polysaccharide and ganoderic acid [J].Enzyme Microb 药用成分的发酵生产。利用发酵技术人工生产人们所需的药 Technol,2003,32:478-484. 用成分是目前较受欢迎的方法，因此建立具有能够生产药用 [7]Ma F Y,Luo X C.Application of molecular markers in genetic and breeing of edible mushroom [J].Mycosystema 成分较高的细胞系，采用适宜的发酵基质以及选用高效方法 (菌物系统)，2002,21(1)：147-151. 对药用成分进行分离、纯化是该领域的技术关键和研究核心 [8] Hu L Xu Y.Application of AFLP to fungi research [J]. Biotechnology(生物技术)，2003,13(4)：43. 问题。真菌的药用成分绝大部分为次生代谢产物，通过组织 [9] Jiang Q P,Ji H,Zhu ZH,et al.The technique of RAPD and 培养技术和发酵技术，可生产高效表达的天然药用成分。在 its application in the studies of edible and medicinal fungi LJ].J Hebei Acad Sci(河北科学院学报)，2003,20(1)：59- 药用真菌发酵过程中通过添加适合的诱导剂及前体物，促进 64. [10] Terashima K,Matsumoto T,Hasebe K,et al.Genetic 和扩大代谢产物的产量。发酵技术在真菌类药物生产中应用 diversity and strain-typing in cultivated strains of Lentinula 尤为广泛。此外，基因工程产物的扩大生产也主要是通过这 edodes(the shii-take mushroom)in Japan by AFLP analysis LJ.Mycol Res,2002,106(1):34-39、 一技术，生产多肽及蛋白类药物成分。目前的难点和重点在 [11]Terashima K,Katsumoto T,Hasebe K,et al.A genetic 于如何更好的分离、纯化下游产物中的药用成分。反义技术 linkage map of Lentinula edodes (shiitake)based on AFLP makes[J].ycol Res,2002,106(8):911-917. 可以控制某一代谢途径关键酶基因，抑制或激活酶活性，使 [12] Liu ZT,Luo X C.The Biotechnology and Application of
·454 · 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 展前景。 3.1 传统药用真菌的生产:与传统的生产方式相比，应用生 物技术进行传统药材生产和品质改进有明显的优点。生物技 术在药用真菌生产中的应用主要体现在防病虫害、优化品 质、减少农药和重金属污染等方面。通过转基因技术，使药用 真菌获得自身的抗虫、抗病毒能力，减少栽培过程中农药的 使用，保证中药的天然、安全，从而促进出口和应用。目前野 生珍贵药用真菌因过度开采已出现濒临灭绝的危机，采用生 物工程技术对其进行研究开发，通过细胞工程、染色体工程、 细胞融合等技术，可以培养出天然药用成分含量高的新的药 用真菌。同时建立适宜于低温液氮冷冻保存技术，对物种进 行保存，供进一步的研究。 3. 2 地道药用真菌培育选种鉴定:主要利用 DNA分子标 记技术进行生药鉴定，选育地道药用真菌。药用真菌中作为 药用的部位称为基原，它的真伪鉴别是中药质量研究、品质 评价以及药材学、炮制学、化学、药效学研究，乃至临床应用 中必不可少的前提条件。传统的药用真菌鉴别主要依据的是 药材外观性状，而近代生药学主要从生物分类学(基原鉴 别)、细胞组织学(显微鉴别)、化学(理化鉴别)角度建立了相 对客观的质量鉴别标准。DNA是最稳定的遗传信息，生物个 体不同组织器官的部位以至细胞都具备相同的遗传信息，利 用基因与药物成分相关性的原理，可以更好的保护、利用及 寻找新的生药资源。通常采用 RAPD技术及 RFLP技术鉴 定不同物种，并通过建立 DNA指纹图谱，确立地道药材的 分子指征(特异的DNA片段)，并以其制备特异探针来检测 相应的药材，为中药质量标准化奠定了基础。 3.3 利用基因工程和细胞培养技术高效表达和生产天然活 性成分或转基因真菌:利用转基因技术，将特异基因导人快 速生长繁殖的药用真菌中，生产外源基因编码的药用多肤和 蛋白，是优化种质、解决药用真菌资源短缺问题的一个重要 途径[16]。对于药用成分明确但含量极低或生长周期较长的 药材，可以选取适宜的真菌表达系统，通过转基因技术高效 表达外源基因，从而获得高效表达的药用成分，创造新的药 用真菌资源。 3.4 提高代谢产物的含量，获取更多的有效成分:具有中国 特色的生物技术医药工业中应用最广泛的就是中草药及其 药用成分的发酵生产。利用发酵技术人工生产人们所需的药 用成分是 目前较受欢迎的方法，因此建立具有能够生产药用 成分较高的细胞系，采用适宜的发酵基质以及选用高效方法 对药用成分进行分离、纯化是该领域的技术关键和研究核心 问题。真菌的药用成分绝大部分为次生代谢产物，通过组织 培养技术和发酵技术，可生产高效表达的天然药用成分。在 药用真菌发酵过程中通过添加适合的诱导剂及前体物，促进 和扩大代谢产物的产量。发酵技术在真菌类药物生产中应用 尤为广泛。此外，基因工程产物的扩大生产也主要是通过这 一技术，生产多肤及蛋白类药物成分。目前的难点和重点在 于如何更好的分离、纯化下游产物中的药用成分。反义技术 可以控制某一代谢途径关键酶基因，抑制或激活酶活性，使 药用成分含量增加，从而定向调控药用真菌的品质。焦点在 于次生代谢途径中关键的酶和基因的定位、分离及克隆。 3. 5 药用筛选:应用细胞培养技术，从细胞水平筛选药用成 分，进而在基因水平上确定其作用机制。中药主要通过调节 机体的整体机能，即通过对多靶点基因的表达调控而起作 用，单味药和复方药都可通过其对相关药效基因表达的影响 (即药物基因组学)，在分子水平上建立中药活性检测系统。 利用高通量的基因芯片技术，可以快速、准确进行高效药物 的筛选。同时可对药物作用的靶基因进行鉴别，进一步检测 该药物是否会致畸或造成其他危险，加快特效复方药研制。 也可以利用DNA芯片分析用药前后整个机体的不同组织、 器官基因表达差异。再用rnRNA构建cDNA表达文库，然后 用得到的肤库制作肤芯片，即可以从众多的药物成分中筛选 到起作用的部分物质。 4 结语 随着科学技术的飞速发展、各种先进技术的产生与建 立，为药用真菌的研究开辟了更加广阔的领域，特别是在生 物技术领域，分子生物学已成为现代生命科学的共同语言， 它不断地与其他学科进行广泛而深人的横向联系与交叉融 合[17]，为中医药(包括药用真菌)的发展与创新提供了强大 的推动作用。将人类基因组学、生物信息学等前沿交叉学科 的一些先进研究方法和手段如DNA分子标记技术、生物芯 片技术等应用到中医药研究领域中，也将是中药现代化发展 的新方向[18]，对药用真菌的开发利用与保护也是一个有益 的启迪。 References: 仁1] Zhang K C. The situation and feature of research and deve- lopment of pharmaceutical fungi [J习.J Food Sci Biotechnol (食品与生物技术)，2002, 21(1): 99-103. [2] Zhou X W, Lin J. Resources of wild Ganaderma spp. in China and their development and utilization仁J]. Acta Edul Fungi(食用菌学报)，1999, 6(1): 58-64. [3] Zhuang Y. Review of medicinal fungi from China [J]. Edib Fungi China(中国食用菌)，2001, 20(2): 3-5. [4] Lorenzen K, Anke T. Basidiomycetes as a source for new bioactive natural products [J]. Curr Organ Chem, 1998, 2: 329-364. 仁5] Wu T S, Shi L S, Kuo S C. Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes仁J]. J Nat Prod, 2001，64: 1121一1122. [6] Tang Y J, Zhong J J. Role of oxygen supply on submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Gano- derma polysaccharide and ganoderic acid [J]. Enzyme Microb Technol, 2003, 32:478-484. [7] Ma F Y, Luo X C. Application of molecular markers in genetic and breeing of edible mushroom [J]. Mycosystema (菌物系统)，2002, 21(1): 147-151. [8] Hu L Xu Y. Application of AFLP to fungi research [J]. Biotechnology(生物技术)，2003, 13(4): 43. [9] Jiang Q P, Ji H, Zhu Z H, et al. The technique of RAPD and its application in the studies of edible and medicinal fungi [J]. J Hebei Acad Sci(河北科学院学报)，2003, 200): 59- 64. [10] Terashima K, Matsumoto T, Hasebe K, et al. Genetic diversity and strain-typing in cultivated strains of Lentinula edodes (the shii-take mushroom) in Japan by AFLP analysis [J].邺 col Res, 2002, 1060):34-39 [I1] Terashima K, Katsumoto T, Hasebe K, et al. A genetic linkage map of Lentinula edodes (shiitake) based on AFLP makes [J]. Mycol Res, 2002, 106(8):911-917. [12] Liu Z T, Lou X C. The Biotechnology and Application of
中草药Chinese Traditional and Herbal Drugs第36卷第3期20o5年3月 ·455· Mushroom(食用辈菌生物技术及应用)[M].Beijing: [16]Xu TF,Zhang H M,Zhang L,et al.Application of biotech- Tsinghua University Press,2002. nology to improvement of character,preservation and identi- [13]Cui Z Q,Luo X C.Protoplast isolation and regeneration of fication of traditional Chinese medicine [J].Chin Pharm J Morchella[J].Aycosystema(菌物系统)，2003,22(3)：498- (中国药学杂志)，2003,38(3)：166-170. 501. [17]Yu Q Y.Study and development of modernization for tradi 14]Li G,Yang F,Li RX,et al.A study on the breeding of new tional Chinese medicine []J Shenyang Med Coll Ganoderma varieties by UV induced mutagenesis J].Acta 学院学报)，2003,5(2)：134-135. Microbiol Sin(微生物学报)，2001,41(2)：229-233. [18]Jin W,Ma Y S,Cheng H P.Bio-chip and its application in [15]Yu ZZ.Mushrooms and biotechnology [Acta Edul pharmaceutical science [J].Chin Tradit Herb Drugs F4ngi(食用菌学报)，1998,5(3)：52-58. 药)，2001,32(11)：1054-aii. 微型包囊技术在中药制剂中的应用及研究进展 张韻慧，许建辰，肖莉，李宁 (天津大学药学院，天津300072) 摘要：论述了微型包囊技术在中药制剂领域的应用；讨论了各种囊材、制备工艺及其特点，并探讨了常规及特殊 的应用规律，介绍了质量控制的常见方法。详细综述了近年来中药现代化研究领域微型包囊的研究进展和应用现 状，展望了微型包囊技术在中药制剂现代化中的应用前景。 关键词：中药制剂，微型包囊技术；纳米微粒 中图分类号：R283.3 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2005)03-0455-04 Application and development of microencapsulation technique in Chinese materia medica preparations ZHANG Yun-hui,XU Jian-chen,XIAO Li,LI Ning (College of Pharmacy,Tianjin University,Tianjin 300072,China) Key words:Chinese materia medica preparation;microencapsulation technique;nanoparticle 微型包囊技术是利用天然的或合成、半合成的高分子材 动脉血管内，微球随血流阻滞在癌体周围的毛细血管中，甚 料（囊材）将固体、液体或气体（囊心物）制备成微型囊或微型 至可使小动脉暂时栓塞，既可切断肿瘤的营养供给，也可使 球的过程，简称微囊化。微囊、微球、毫微囊、毫微球及纳米微 载药的微球滞留在病变部位，提高局部浓度，延长作用时间。 粒皆属于此范畴，一般统称为微粒。药物微囊化后可制成散 这方面的应用报道较多，近年来仅作为肝动脉栓塞剂的微球 剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂等不同剂型，被认为是药物 就有白芨微球[2幻、斑蝥素微囊3)、莪术油微球幻、羟基喜树碱 达到缓、控释及提高靶向性的有效手段。目前已有多种西药 微球[s们、华蟾酥精微球们和去氢骆驼蓬碱微球等。 采用此技术，在中药制剂领域也已普遍得到重视并取得了一 1.1.3磁导向制剂：将磁性微粒包人微球中，利用体外磁场 定的成果。本文结合近年该领域应用实例进行综述，以期对 效应，引导药物在体内定向移动和定位浓集，此类微球在靶 这一领域的深入研究有所启迪。 位给药方面提供了一个全新的开发途径。刘晓华等8采用疗 1中药微囊化的应用 效较好的中药复方浸膏与5-氟尿嘧啶复合，在体外磁场的 1.1靶向制剂 定向引导下，浓集在靶区组织上，定位释放药物，提高靶区药 1.1.1普通注射剂：这类微球经iv或p后，由于粒径的不 物浓度数十倍之多，从而提高了疗效。张仲海等将毒性较 同而产生被动靶向。粒径为0.1~0.2m的微粒，可被巨噬 大的中药有效单体一秋水仙碱，用人血清蛋白包埋制成磁 细胞吞噬而达肝脾等器官；粒径为712um的微粒可被肺 性微球，用于乳腺癌的治疗，经证明此微球对于定位治疗乳 机械摄取，主要浓集于肺。曾凡彬等]制备的盐酸川芎嗪明 腺癌有较好疗效。 胶微球平均粒径为12um,与溶液对照组相比肺内的分布提 另外靶向制剂中还有对微粒表面进行修饰从而达到主 高近6倍。 动靶向的方式。由于制备工艺的限制，目前此类制剂在中药 1.1.2动脉栓塞剂：注射大于12m的微球于癌变部位的 微囊化中的应用还比较少。总之，应用微囊化技术制成的靶 收稿日期：2004-05-24 作者简介：张韻慧(1945一)，女，数授，博士生导师，先后主持和完成多项省、部级科研项目，获得省、部级科技进步奖4项，研究方向为药 剂学、药物的缓控释体系、药物纳米技术、药物现代分析技术。 Tel:(022)27401186
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 36卷第 3期 2005年 3月 ·455. [13] 仁14] [15] Mushroom 食用草菌生物技术及应用)[M]. Beijing: Tsinghua University Press, 2002. Cui Z Q, Luo X C. Protoplast isolation and regeneration of Morchella [J]. Mycosystema(菌物系统)，2003, 22(3): 498- 501. Li G, Yang F, Li R X, et al. A study on the breeding of new Ganoderma varieties by UV induced mutagenesis [J]. Acta Microbiol Sin(微生物学报)，2001, 41(2): 229-233. Yu Z Z. Mushrooms and biotechnology [J]. Acta Edul Fungi(食用菌学报)，1998, 5(3): 52-58. 仁16] [17] [18] Xu T F, Zhang H M, Zhang L, et al. Application of biotechnology to improvement of character, preservation and identification of traditional Chinese medicine [J]. Chin Pharm J (中国药学杂志)，2003, 380): 166-170. Yu Q Y. Study and development of modernization for traditional Chinese medicine [J]. J Shenyang Med Coll(沈阳医 学院学报)，2003, 5(2): 134-135. Jin W, Ma Y S, Cheng H P. Bio-chip and its application in pharmaceutical science [J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草 药)，2001，32(11):1054-aii. 微型包囊技术在中药制剂中的应用及研究进展 张411慧，许建辰，肖 (天津大学药学院，天津 莉，李 宁 300072) 摘 要:论述了微型包囊技术在中药制剂领域的应用;讨论了各种囊材、制备工艺及其特点，并探讨了常规及特殊 的应用规律，介绍了质量控制的常见方法。详细综述了近年来中药现代化研究领域微型包囊的研究进展和应用现 状，展望了微型包囊技术在中药制剂现代化中的应用前景。 关键词:中药制剂;微型包囊技术;纳米微粒 中图分类号:R283-3 文献标识码:A 文章编号:0253一2670(2005)03一0455一04 Application and development of microencapsulation technique in Chinese materia medica preparations M ANG Yun-hul，XU ban-chen，XIAO Li，LI Ning (College of Pharmacy, Tianjin University, Tianjin 300072, China) Key words:Chinese materia medica preparation;microencapsulation technique;nanoparticle 微型包囊技术是利用天然的或合成、半合成的高分子材 料(囊材)将固体、液体或气体(囊心物)制备成微型囊或微型 球的过程，简称微囊化。微囊、微球、毫微囊、毫微球及纳米微 粒皆属于此范畴，一般统称为微粒。药物微囊化后可制成散 剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂等不同剂型，被认为是药物 达到缓、控释及提高靶向性的有效手段。目前已有多种西药 采用此技术，在中药制剂领域也已普遍得到重视并取得了一 定的成果。本文结合近年该领域应用实例进行综述，以期对 这一领域的深人研究有所启迪。 1 中药微囊化的应用 L1 靶向制剂 1.1.1 普通注射剂:这类微球经 iv或 ip后，由于粒径的不 同而产生被动靶向。粒径为0. 1-0. 2 Km的微粒，可被巨噬 细胞吞噬而达肝脾等器官;粒径为7^-12 pm的微粒可被肺 机械摄取，主要浓集于肺。曾凡彬等[17制备的盐酸川芍嗓明 胶微球平均粒径为 12 pm，与溶液对照组相比肺内的分布提 高近 6倍。 1.1.2 动脉栓塞剂:注射大于 12 um的微球于癌变部位的 动脉血管内，微球随血流阻滞在癌体周围的毛细血管中，甚 至可使小动脉暂时栓塞，既可切断肿瘤的营养供给，也可使 载药的微球滞留在病变部位，提高局部浓度，延长作用时间。 这方面的应用报道较多，近年来仅作为肝动脉栓塞剂的微球 就有白岌微球[2]、斑鳌素微囊[3]羲术油微球[4]经基喜树碱 微球[6]、华蟾酥精微球[6]和去氢骆驼蓬碱微球[7]等。 1.1.3 磁导向制剂:将磁性微粒包入微球中，利用体外磁场 效应，引导药物在体内定向移动和定位浓集，此类微球在靶 位给药方面提供了一个全新的开发途径。刘晓华等[8]采用疗 效较好的中药复方浸膏与 5-氟尿嚓陡复合，在体外磁场的 定向引导下，浓集在靶区组织上，定位释放药物，提高靶区药 物浓度数十倍之多，从而提高了疗效。张仲海等[9]将毒性较 大的中药有效单体— 秋水仙碱，用人血清蛋白包埋制成磁 性微球，用于乳腺癌的治疗，经证明此微球对于定位治疗乳 腺癌有较好疗效。 另外靶向制剂中还有对微粒表面进行修饰从而达到主 动靶向的方式。由于制备工艺的限制，目前此类制剂在中药 微囊化中的应用还比较少。总之，应用微囊化技术制成的靶 收稿日期:2004-05-24 作者简介:张胡慧(1945-)，女，教授，博士生导师，先后主持和完成多项省、部级科研项目，获得省、部级科技进步奖4项，研究方向为药 剂学、药物的缓控释体系、药物纳米技术、药物现代分析技术。 Tel: (022)27401186