维普资讯http:/www.cqvip.com 遗传HEREDITAS(Beijing)?25(1):107~112,2003 专论与综述 植物生物反应器生产药物蛋白的前景 肖乃仲1，白云峰1，刘锦秀2，王兴智1 (1.东北师范大学遗传与细胞研究所，长春130024：2.北京华大基因研究中心，北京101300) 摘要：转基因植物作为生物反应器生产重要的药用蛋白，如抗体、血液替代品和疫苗，为健康保健和科学研究提 供充足的生物药物，满足人们日益增长的需要。本文综述了这一领域的研究进展以及商业化前景。 关键词：转基因植物；生物反应器；生物药物：重组蛋白 中图分类号：Q819 文献标识码：A 文章编号：0253一9772(2003)01-0107-06 Plants as Bioreactor for the Production of Pharmaceutical Proteins XIAO Nai-Zhong',BAI Yun-Feng',LIU Jin-Xiu2,WANG Xing-Zhi (1.Institute of Genetics Cytology,Northeast Normal University,Changchun 130024,China 2.Beijing Genomics InstituteGenomics&Bioinformatics Center,Chinese Academy of Science,Beijing 101300,China) Abstract:Transgenic plant as bioreactor has been used to produce recombinant proteins for medicinal purposes,inclu- ding mammalian antibodies,blood substitutes and vaccines.As the demand for biopharmaceuticals is expected to in- crease,transgenic plants have the potential to provide virtually unlimited quantities of proteins for use as tools in both human health care and the bioscience.This paper reviews the recent developments in this field and the prospect of commercial applications. Key words:transgenic plants;bioreactor;biopharmaceuticals;recombinant proteins 植物作为药材的历史可以追述到古代中国和公元前 够利用植物生产足够多的早期诊断用抗体。而最具挑战性 1600年的古代埃及，那时人们就已经发现和使用数百种植 的成果是利用植物生产嵌合型抗肿瘤疫苗和多亚基蛋白复 物作为药物治病。直到今天，仍有四分之一的处方药是来源 合物，如分泌型lgA山。 于植物。现代生物技术更是极大地扩大了植物应用的范围。 转基因植物系统能够生产药物蛋白，包括抗体~]，血液替 1植物抗体 代品)，疫苗[]等。本文简要回顾了这一领域发展的历史及 在植物中表达编码抗体或抗体分子片段（如Fab片段和 其发展趋势。 单链可变区scFv)的基因，获得的产物称为植物抗体(planti-- 生物反应器(bioreactor)?[是指利用生物系统大规模生 bodies)1)。自从十几年前转基因烟草成功地表达免疫球蛋 产有重要商业价值的外源蛋白质，用于医疗保健和科学研 白的重链和轻链基因并组装成功能抗体以来，植物已经能够 究。最简单的例子是1982年首次成功地利用细菌生产重组 生产完整的gG和1gA分子-1]，分泌型IgG和lgA分子， 胰岛素，这一突破消除了大规模应用胰岛素的限制因素，使 单链可变区片段(scFv)),Fab片段[u6们和重链可变区以及 糖尿病患者能够使用既经济又安全有效的药物。1986至 双特异性抗体（通过具柔性的肽健接头连接到一起）们，膜 1990年间，人们建立了植物表达系统成功地表达了人类生 锚定抗体[]以及嵌合型的lgG和1gA分子1)等不同类型 长激素融合蛋白[门、干扰素[]和人血清白蛋白们，1989和 抗体。应用植物生产单克隆抗体具有极大的市场潜力，获得 1990年，功能抗体在植物中的表达更进一步证明植物具有 的价格低廉的单克隆抗体在人类及牲畜的疾病治疗中将发 生产复杂、有药效的哺乳动物蛋白的潜力1]。目前已经能 挥巨大的作用。 收稿日期：2002一03一04：修回日期：2002一09一06 蒸金项目：国家植物转基因中试及产业化基地资助(J99一B一001) 作者简介：肖乃仲(1975一)，男（汉），博士研究生，植物学专业 通讯作者：王兴智(1944一），男（汉），博士生导师，植物学专业。E-mail:xingzhi(@public..cc.jl.cn
遗 传 HEREDITAS(Beijing)25(1)：1O7～ 112，2003 专 论 与 综 述 植 物 生 物 反 应 器 生产 药 物 蛋 白的 前 景 肖乃 仲 ，白云 峰 ，刘 锦 秀。，王 兴智 (1．东 北师 范大学 遗传 与细胞 研究 所 ，长春 130024；2．北京 华大 基 因研 究 中心 ，北 京 101300) 摘 要 ：转 基 因植物 作 为生物 反 应器 生产 重要 的 药用 蛋 白 ，如抗 体 、血 液 替代 品 和 疫 苗 ，为健 康 保 健 和科 学研 究 提 供充 足 的生 物药 物 ，满 足人 们 日益增 长 的需要 。本文综 述 了这 一领 域 的研究 进 展 以及商 业化 前 景 。 关 键 词 ：转 基 因 植 物 ；生 物 反 应 器 ；生 物 药 物 ；重 组 蛋 白 中 图 分 类 号 ：Q819 文 献 标 识 码 ：A 文 章 编 号 ：0253- 9772(2003)01-0107- 06 Plantsas Bioreactor for the Production ofPharm aceuticalProteins XIAO Nai—Zhong ，BAIYun—Feng ，LIU Jin—Xiu ，W ANG Xing—Zhi (1．InstituteofGenetics& Cytology，NortheastNormalUniversity，Changchun130024，China； 2．BeijingGenomicsInstitute，Genomics& BioinformaticsCenter，ChineseAcademyof Science，Beijing 101300，China) Abstract：T ransgenic plantasbioreactorhasbeen used to producerecombinantproteinsform edicinalpurposes，inclu— ding mammalian antibodies，blood substitutesand vaccines．As thedemand forbiopharmaceuticalsisexpected to in— crease，transgenic plants have the potentialto provide virtually unlimited quantities ofproteinsfor use as toolsin both human health careand thebioscience．T hispaperreviewstherecentdevelopmentsin thisfield and theprospect ofcomm ercialapplications． Keywords：transgenicplants；bioreactor；biopharmaceuticals；recom binantproteins 植 物 作 为 药 材 的历 史 可 以追 述 到 古 代 中 国 和 公 元 前 1600年 的古 代 埃及 ，那 时 人 们 就 已经 发 现 和使 用 数 百 种 植 物 作为 药物 治病 。直 到今 天 ，仍 有 四分 之一 的处 方 药是 来源 于植物 。现 代 生物技 术 更是 极大 地扩 大 了植物 应 用 的范 围。 转 基 因植 物 系统 能 够 生 产 药物 蛋 白 ，包 括抗 体 _1 ]，血 液 替 代 品 ，疫苗 等 。本 文 简要 回顾 了这 一领 域发 展 的历 史 及 其 发 展 趋 势 。 生 物 反 应 器 (bioreactor)_6是 指 利 用 生 物 系 统 大 规 模 生 产有 重要 商业 价 值 的外 源 蛋 白质 ，用 于 医 疗 保 健 和科 学 研 究 。最 简单 的例子 是 1982年首 次 成功 地利 用细 菌 生产 重 组 胰 岛 素 ，这 一突破 消 除 了大 规 模 应 用 胰 岛素 的 限制 因素 ，使 糖尿 病患 者 能 够 使 用 既 经 济 又 安 全 有 效 的 药 物 。1986至 1990年 间 ，人们 建立 了植 物 表 达 系统 成 功 地 表 达 了人 类 生 长激 素融 合 蛋 白[”、干 扰 素 。和 人 血 清 白 蛋 白 。]；1989和 1990年 ，功 能 抗 体 在 植 物 中 的 表 达 更 进 一 步 证 明 植 物 具 有 生产 复杂 、有药效 的哺乳 动物 蛋 白的潜 力Dd0]。 目前 已经 能 够 利用 植物 生 产足 够 多 的早 期 诊 断 用 抗 体 。而 最 具 挑 战 性 的成果 是利 用植 物 生产 嵌 合 型 抗 肿 瘤疫 苗和 多 亚 基 蛋 白复 合 物 ，如 分泌 型 IgAl1 。 1 植 物 抗 体 在 植物 中表达 编码 抗体 或抗 体 分子 片段 (如 Fab片段 和 单 链 可 变 区 scFv)的 基 因 ，获 得 的产 物 称 为 植 物 抗 体 (planti— bodies)[”]。 自从 十几 年前 转 基 因烟 草 成 功地 表 达免 疫 球 蛋 白的 重链 和轻 链基 因并 组装 成 功能抗 体 以来 ，植 物 已经 能 够 生 产 完 整 的 IgG 和 IgA 分 子 _1 “]，分 泌 型 IgG 和 IgA 分 子 ， 单 链 可 变 区 片 段 (scFv)E”]，Fab片 段 和 重 链 可 变 区 以 及 双特 异性抗 体 (通 过 具 柔 性 的肽 键 接 头 连 接 到 一 起 )_1 ，膜 锚 定 抗体 ” 以及 嵌 合 型 的 IgG 和 IgA 分 子 ” 等不 同类 型 抗 体 。应 用植 物生 产单 克 隆抗体 具 有极 大 的市场 潜 力 ，获 得 的价 格低 廉 的单 克隆 抗体 在人 类 及 牲 畜 的 疾病 治疗 中将 发 挥 巨大 的作用 。 收 稿 日期 ：2002— 03— 04；修 回 日期 ：2002—09— 06 基金 项 目：国家植 物转 基 因中试及 产业 化基地 资助 (J99一B一001) 作者 简介 ：肖乃 仲(1975一 )，男 (汉 )，博 士研究 生 ，植 物学 专业 i告讯作者 ：王兴智(1944一)，男(汉)，博士生导师，植物学专业。E—mail：xingzhi@public．cc．j1．ca 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯http:/www.cqvip.com 108 遗传HEREDITAS(Beijing)2003 25卷 到目前为止，已经成功地获得了4种具有潜在医疗价值 与注射疫苗相比，口服疫苗成本低、便于管理，是一种很 的植物抗体。其中转基因烟草生产针对腐蚀牙齿的致病原 有市场前景的大众免疫防护方式。口服疫苗还能够提高黏 Sreptpcpccus mutans抗体lgG一lgA已经进行了人体试验 膜免疫力，提高对通过黏膜表皮进人人体的传染性因子的抵 这种嵌合型抗体与小鼠骨髓瘤细胞产生的抗体对抑制S. 抗能力。目前对于口服疫苗的主要忧虑在于：蛋白质成分在 mutans具有同样的效果[。第二种是人抗疱疹病毒(anti 胃肠中的降解是否在引发免疫反应之前。为了防止降解，人 herpessimplex virus)的抗体，其有效性已经在小鼠模型中得 们利用重组微生物，脂质体以及转基因植物组织运送这些蛋 到证实]。无论在体外还是体内，这种抗体的活性与从细胞 白质，使这些蛋白质能够完整地到达肠部，引发免疫反应。 培养中产生的单克隆抗体没有差别。第三种是针对癌胚抗 最初人们利用易于转化的植物，如烟草、马铃薯和番茄 原(carcinoembryonic antigen,CEA)的抗体基因已经在水稻 等23一]来生产亚单位疫苗。而更适于生产口服疫苗的是那 和小麦中表达[]。CEA是一种细胞表面糖蛋白，是肿瘤相 些具有大量可溶性蛋白、耐储存的种子植物。谷物就非常适 关抗原的最明显特征之一。人们应用针对CEA的抗体进行 合，其胚乳部分富含可溶性蛋白，能够与种子的其余部分分 体内肿瘤成像以及癌症治疗。第四种是利用植物病毒载体 开，提高了抗原的浓度，降低了服用剂量。不同的谷物有不 侵染烟草瞬时表达淋巴瘤特异的疫苗[)。 同的使用方式。许多植物组织可以直接生吃，而有的必须经 据估算，在250平方米的温室中利用苜指生产IgG的成 过加工才可以食用。深加工能够浓缩抗原、提高适口性和储 本约为500~600美元/g,与之相比从杂交瘤中提取抗体的 存的稳定性，但是必须保证抗原不被任何加工过程中的热和 成本为5000美元/g21。植物抗体的表达量对成本的影响 压力所破坏。例如，用表达热不稳定的Lt一B毒素的B亚单 很大，据报道，gA的最高产率为500ug/g叶片[2)，最终成 位的玉米为原料，经过加工成为一份“煮熟的”玉米羹一针 本将低于50美元/g。这明显低于用细胞培养的成本(1000 对产肠毒素菌株的候选疫苗，一份可口的“玉米糞”中能够储 美元/g)和转基因动物体系的成本(100美元/g)。在生产纯 存1毫克剂量的未被降解的Lt一B。植物组织表达的动物 化的植物抗体的过程中，提纯所需的费用最大。然而，在水 疫苗蛋白不需要任何加工处理，通过喂养牲畜就能够达到免 稻、小麦种子中表达的植物抗体则无须纯化，直接口服就能 疫动物的作用。 够达到实际治疗的效果。 研究表明，一些植物表达的候选疫苗【0一3]在临床试验 抗体的某些特性（例如，与单核细胞Fc受体结合）依赖 中已经能够成功地激发实验动物产生黏膜免疫应答和血清 于糖基化作用。在IgG的CH?区存在一个保守的N一糖基 免疫应答，使动物对致病原产生了抵抗力。对比实验表明： 化位点。从人和鼠的Guys13(一种IgG1分子)的N联聚糖 与将裸露的抗原直接喂给小鼠相比，生物包装的L一B(即 结构的研究中发现]：植物抗体的N联聚糖在结构上存在 植物组织表达的口服型疫苗)能够提高黏膜免疫的应答。这 更多的多态性，其中高甘瑶糖型占40%，而其余60%植物抗 可能是因为受到保护的抗原没有在肠道中降解。 体的低聚糖具有B一(1,2)木糖和a一(1,3)岩藻糖联接到 植物组织表达疫苗的量必须达到较高的水平，这样才能 Mang GlcNAc:轴。这些植物典型的N联聚糖在动物中并没 实现口服免疫的效果。目前已经运用导肽、多聚腺苷酸信号 有发现。而唾液酸（占小鼠单克隆抗体的糖含量的10%）在 以及优化密码子等[3“)策略来提高疫苗在植物中的含量。 植物抗体中同样缺乏。体外研究表明，这些不同的聚糖结构 还可以将转化的品系与遗传背景好的品系进行杂交育种以 对抗原结合或亲和性并没有影响，估计在体内也没有显著的 提高表达量。这一途径已经成功地改进了谷物蛋白质的含 影响[]。苜指产生的1gG分子与杂交瘤分泌的抗体一样在 量。同样重要的是转基因植物组织中的疫苗必须以天然状 Balb/c小鼠体内存在血清半衰期2]。60个病人在口服抗 态存在才能具有生物学功能。许多实验通过检测蛋白质的 S.mnutans的IgA抗体的研究结果表明，没有出现过敏反应 分子质量，酶或受体结合的能力以及是否形成高度有序的复 或产生抗小鼠抗体的抗体(HAMA)),这有助于消除对植 合物（该复合物能够真实反映出微生物或病毒的立体结构） 物抗体作为人类药物可能存在免疫原性和致敏性等问题的 已经得出肯定的结论[3353]。 忧虑。而且人类食物中普遍存在植物糖蛋白，因此对多数人 植物表达外源蛋白的稳定性以及亚单位结构的装配依 而言，植物抗体的应用不会存在危险。 赖于细胞内环境及其在细胞中的定位。对于亚单位疫苗而 言，定位于细胞表面、内质网或高尔基体较为理想。人们还 2口服疫苗 将疫苗基因与植物病毒表面蛋白基因融合构成瞬时表达系 转基因植物生产口服疫苗的前景非常诱人。在植物组 统，也得到了较高的表达水平。还有一个相关的策略是用来 织内合成某种致病原的关键免疫原性蛋白，然后作为可口服 抵抗自身免疫疾病：利用转基因植物表达自身抗原作为口服 的亚单位疫苗给人和性畜服用，人或动物的体内就会产生相 疫苗，服用较大剂量的自身免疫原产生免疫耐受，进而达到 应的抗体，具有抵抗该致病原的能力。目前已经利用多种细 抑制自身免疫疾病的发生。这一策略已经在治疗糖尿病的 菌和病毒来源的蛋白作为食物添加剂，作为口服疫苗[的~) 小鼠模型中获得了成功]
1O8 遗 传 HEREDITAS (Beijing)2003 25卷 到 目前 为止 ，已经成 功 地获 得 了 4种 具 有潜 在 医疗 价值 的植 物抗 体 。其 中转 基 因烟 草生 产 针 对 腐蚀 牙 齿 的致 病 原 Sreptpcpccusmutans抗 体 IgG—IgA 已经 进行 了人 体 试 验 。 这种 嵌合 型 抗 体 与 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 产 生 的抗 体 对 抑 制 s． mutans具 有 同 样 的 效 果 [1 。 第 二 种 是 人 抗 疱 疹 病 毒 (anti— herpessimplexvirus)的抗 体 ，其 有效性 已 经在 小 鼠模 型 中得 到证 实 l2]。无 论在 体 外还 是体 内，这 种抗 体 的活性 与 从 细胞 培 养 中产 生 的单 克隆 抗 体 没 有 差 别 。第 三种 是 针 对 癌 胚 抗 原 (carcinoembryonicantigen，CEA)的 抗 体 基 因 已 经 在 水 稻 和 小 麦 中 表 达 l2 。 CEA 是 一 种 细 胞 表 面 糖 蛋 白 ，是 肿 瘤 相 关 抗 原 的最 明显特 征 之一 。人 们应 用针 对 CEA 的抗 体进 行 体 内 肿 瘤 成 像 以及 癌 症 治 疗 。 第 四 种 是 利 用 植 物 病 毒 载 体 侵 染 烟草 瞬时 表达 淋 巴瘤 特异 的疫 苗 [2 。 据 估算 ，在 250平 方 米 的温室 中利 用 苜蓿 生产 IgG 的成 本 约 为 500 600美元 ／g，与 之 相 比从 杂交 瘤 中 提取 抗 体 的 成 本 为 5000美 元／gE 。植 物 抗 体 的 表 达 量 对 成 本 的影 响 很 大 ，据 报道 ，IgA 的 最 高 产 率 为 500#g／g叶 片l2 ，最 终 成 本 将 低 于 5O美 元 ／g。 这 明 显 低 于 用 细 胞 培 养 的 成 本 (1000 美 元／g)和转 基 因动物 体 系 的成 本 (100美 元／g)。在生 产 纯 化 的植 物抗 体 的过 程 中 ，提 纯所 需 的 费用 最 大 。然 而 ，在 水 稻 、小麦 种子 中 表达 的植 物 抗 体 则 无 须 纯 化 ，直 接 口服 就 能 够 达 到实 际治疗 的效果 。 抗 体 的某些 特 性 (例 如 ，与 单核 细胞 Fc受 体 结 合 )依 赖 于 糖基 化作 用 。在 IgG 的 CH 区存 在一 个 保守 的 N一糖 基 化 位 点 。从 人 和 鼠 的 Guy'sl3(一 种 IgG1分 子 )的 N 联 聚 糖 结 构 的研究 中发现 ：植 物 抗 体 的 N 联 聚糖 在 结 构 上 存 在 更 多 的多态 性 ，其 中高 甘 露糖 型 占 4O％，而其 余 6O％植 物 抗 体 的低 聚糖 具 有 8一 (1，2)木 糖 和 a一(1，3)岩 藻糖 联 接 到 M an。GIcNAcz轴 。 这 些 植 物 典 型 的 N 联 聚 糖 在 动 物 中 并 没 有发 现 。而 唾液 酸 (占小 鼠单 克隆 抗 体 的 糖 含 量 的 1O％)在 植 物 抗 体 中同样 缺乏 。体 外研 究 表 明 ，这 些 不 同的 聚糖 结构 对抗 原 结合 或亲 和性 并 没有 影 响 ，估 计 在体 内也 没有 显 著 的 影 响_l 。苜蓿 产 生 的 IgG分 子 与杂 交 瘤分 泌 的抗 体 一 样 在 Balb／e小 鼠体 内存 在 血 清 半 衰 期 ]。60个 病 人 在 口服 抗 S．mutans的 IgA抗 体 的 研 究 结 果 表 明 ，没 有 出 现 过 敏 反 应 或 产 生抗 小 鼠抗 体 的抗 体 (HAMA)[1 ，这 有 助 于 消 除对 植 物抗 体作 为人 类 药物 可 能 存 在 免疫 原 性 和 致 敏 性 等 问题 的 忧虑 。而且人 类食 物 中普 遍存 在植 物 糖蛋 白，因此对 多 数人 而 言 ，植 物 抗体 的应 用不 会存 在 危 险 。 2 口服 疫 苗 转 基 因植 物生 产 口服 疫 苗 的前 景 非 常 诱 人 。在 植 物 组 织 内合 成某 种 致病 原 的关键 免 疫原 性 蛋 白 ，然 后作 为 可 口服 的亚单 位疫 苗 给人 和牲 畜服 用 ，人 或动 物 的体 内就 会产 生 相 应 的抗 体 ，具 有抵 抗该 致 病原 的能 力 。 目前 已经利 用多 种 细 菌 和病 毒来 源 的蛋 白作 为食 物 添加 剂 ，作 为 口服疫 苗 。 与注射 疫苗 相 比，口服疫 苗成 本低 、便 于 管理 ，是 一 种 很 有 市场 前景 的大 众 免 疫 防护 方 式 。 口服 疫 苗 还 能够 提 高 黏 膜 免疫 力 ，提 高对 通过 黏 膜表 皮进 入人 体 的传 染 性 因子 的抵 抗 能力 。 目前对 于 口服 疫苗 的 主要忧 虑在 于 ：蛋 白质 成 分在 胃肠 中的 降解是 否 在 引发免 疫反 应 之前 。为 了防 止 降解 ，人 们 利用 重组 微生 物 ，脂 质体 以及 转基 因植 物组 织 运送 这 些蛋 白质 ，使 这些 蛋 白质 能 够完 整地 到达 肠 部 ，引 发免疫 反应 。 最 初人 们利 用 易于 转 化 的植 物 ，如 烟 草 、马铃 薯 和番 茄 等 来生 产 亚单 位 疫苗 。而 更适 于生 产 口服 疫苗 的 是那 些 具有 大量 可溶 性 蛋 白 、耐储 存 的种 子植 物 。谷 物就 非 常适 合 ，其 胚乳 部分 富含 可 溶 性 蛋 白，能 够 与 种 子 的 其余 部 分 分 开 ，提 高 了抗原 的浓 度 ，降 低 了服 用 剂 量 。不 同 的谷 物 有 不 同 的使用 方式 。许 多 植物 组织 可 以直接 生 吃 ，而有 的 必须 经 过加 工才 可 以食 用 。深加 工能 够浓 缩抗 原 、提 高适 口性 和储 存 的稳定 性 ，但 是必 须保 证抗 原 不被 任何 加工 过 程中 的热 和 压 力 所 破 坏 。 例 如 ，用 表 达 热 不 稳 定 的 Lt— B毒 素 的 B 亚 单 位 的 玉 米 为 原 料 ，经 过 加 工 成 为 一 份 “煮 熟 的 ”玉 米 羹 — — 针 对产 肠 毒素 菌株 的候 选疫 苗 ，一 份可 口的“玉米 羹”中 能够 储 存 1毫 克 剂 量 的未 被 降 解 的 Lt—B。植 物 组 织 表达 的动 物 疫苗 蛋 白不需 要 任何 加工 处理 ，通过 喂养 牲畜 就能够 达 到免 疫 动 物 的 作 用 。 研究 表 明 ，一些 植 物 表 达 的候 选 疫 苗 [3 35]在 临 床 试 验 中 已经能 够成 功地 激 发 实 验 动物 产 生 黏 膜 免疫 应 答 和 血 清 免疫 应答 ，使 动 物对 致 病 原 产生 了抵 抗 力 。对 比实 验 表 明 ： 与 将 裸 露 的 抗 原 直 接 喂 给 小 鼠 相 比 ，生 物 包 装 的 Lt— B(即 植 物 组织 表 达的 口服 型疫 苗 )能 够提 高黏 膜免 疫 的应 答 。这 可能 是 因为受 到保 护 的抗 原没 有在 肠道 中降解 。 植 物组 织 表达 疫苗 的 量必 须达 到较 高 的水平 ，这 样 才 能 实 现 口服 免疫 的效 果 。 目前 已经 运 用导 肽 、多 聚腺苷 酸 信 号 以及优 化 密码 子等 [3 。 策 略来提 高疫 苗在 植物 中的含 量 。 还 可 以将 转 化 的品 系 与遗 传 背 景 好 的 品 系进 行 杂交 育 种 以 提 高 表达 量 。这 一 途径 已经 成 功 地 改进 了谷 物 蛋 白质 的含 量 。同样 重 要 的是转 基 因植 物组 织 中 的疫 苗 必 须 以 天 然状 态 存在 才能 具有 生 物 学功 能 。许 多实 验 通 过 检 测蛋 白 质 的 分子 质 量 、酶或 受体 结 合 的能力 以及 是 否形成 高 度有 序 的复 合物 (该 复合物 能够 真 实 反 映 出 微 生物 或 病 毒 的 立 体结 构 ) 已 经 得 出 肯 定 的 结 论 [3“ 。 。 植 物 表 达 外 源 蛋 白 的 稳 定 性 以 及 亚 单 位 结 构 的 装 配 依 赖 于细胞 内环境 及 其 在细 胞 中的 定 位 。对 于 亚单 位 疫 苗 而 言 ，定 位 于细胞 表 面 、内质 网 或 高尔 基 体 较 为 理 想 。人 们 还 将疫 苗基 因与植 物病 毒 表 面 蛋 白基 因融 合 构 成 瞬时 表 达 系 统 ，也得 到 了较 高 的表达水 平 。还有 一个 相关 的策 略是 用 来 抵抗 自身 免疫 疾病 ：利用 转基 因植 物 表达 自身 抗原 作 为 口服 疫苗 ，服 用较 大 剂量 的 自身免 疫 原 产 生 免 疫耐 受 ，进 而 达 到 抑制 自身 免疫 疾病 的发 生 。这 一 策 略 已经 在 治 疗 糖 尿 病 的 小 鼠模 型 中 获 得 了 成 功 [3 。 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯http:/www.cqvip.com 1期 肖乃仲等：植物生物反应器生产药物蛋白的前景 109 换能够显著提高该基因在植物体内的表达水平[42]；(4)使用 31 植物药物和人类蛋白质 组织特异启动子和病毒序列能够提高基因转录和翻译的水 如果转基因植物生产的药物蛋白需要纯化，那么只有当 平)]，(5)在拟南芥中生产豆类arcelin,同时表达种子储存 它占全部可溶性蛋白质(total soluble protein,TSP)的l%以 蛋白清蛋白(albumin)2S的反义基因，结果使得arcelin的表 上才具有商业化的潜力。植物来源的重组乙型肝炎表面抗 达量达到种子总蛋白的24%4)，利用相似的策略有助于显 原(hepatitis-B surface antigen)在人体试验中仅仅诱导产生 著提高目标蛋白的表达水平。 了较低水平的血清抗体，这可能是因为转基因莴苣表达的重 4新的表达策略 组乙型肝炎表面抗原含量低(1~5ng/g鲜重)9)。虽然马 铃薯表达的诺沃克病毒衣壳蛋白(Norwalk virus capsid pro 从持续大量获得药用蛋白的需要出发，利用转基因技术 tein)能够激发免疫反应，但是由于其产率过低，占TSP的O. 获得稳定的可遗传的转化株系是首选策略。但是新策略仍 37%,不能进行大规模的应用4]。 然值得不断探讨。瞬时表达策略的特点：(I)由于瞬时表达 虽然许多非人源的基因（植酸酶phytase、葡聚糖酶glu 所需的时间较短，在大规模转化获得稳定的转化植株之前能 canase)通过核基因组得到了高效表达，但令人遗憾的是，编 够用来检验基因产物是否具有预期的生物学功能5]；(2)美 码人源蛋白质的基因在植物中的表达量很低：人血清白蛋白 国公司Large Scale Biology Corporation利用烟草花叶病毒 (human serum albumin)占植物TSP的0.020%；人蛋白C 载体快速大量生产乙型肝炎表面抗原，seFvs等重组蛋 (human protein C)占O.Ool%;红细胞生成素(erythropoie- 白211]，(3)目前主要的瞬时表达系统是农杆菌真空渗透法 tin,EPO)占0.0o3%;人干扰素(human interferon-)不到 (agroinfiltration)和重组病毒载体法(viral vectors):其中农 0.00l%(鲜重)。人工合成的人表皮生长因子(human epi- 杆菌真空渗透法能够在一周之内产生毫克级的一种或多种 derma!growth factor)基因在转基因烟草中表达量仅达到 重组蛋白，如scFvs、CEA等，可以在临床试验之前对目标 TSP的0.001%1421。 蛋白的功能进行检测。将目的基因克隆到一种植物病毒的 为了进一步提高人源蛋白在植物细胞内的表达水平，人 基因组中，在一强启动子控制下能够迅速侵染大量植株，重 们采用的策略：(1)希望在叶绿体内合成复杂的需要翻译后 组植物病毒载体具有广泛的宿主范围。常用RNA病毒载 修饰的或亚基装配的真核蛋白质，如sIgA:在高等植物叶绿 体，例如已经利用重组TMV载体在植物体内瞬时表达了大 体中表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。整合到 量的scFv[s2]。此种技术的局限在于一般只能表达30kDa以 烟草叶绿体基因组中的外源基因拷贝数能够达到每个细胞 下的蛋白质。人们期望利用基因枪法和农杆菌法对重组病 10000个拷贝，相应的重组蛋白占全部可溶性蛋白的比例也 毒载体进行技术改进]。 提高到47%4]。叶绿体转化是使用两个旁翼序列，通过同 目前虽然多数植物抗体是在烟草中表达的，但是马铃 源重组将外源DNA插入叶绿体功能基因之间，实现靶基因 薯、大豆、苜蓿、水稻以及小麦作为生产植物抗体的系统也都 的精确定位，消除了位置效应(position effect)。而且在叶绿 取得了成功。利用烟草、背蓿、大豆生产植物抗体的最大优 体转化体系中没有观察到在核转化中常见的基因沉歌现象。 点就是产量高。烟草作为宿主植物的好处还有易于转化：能 叶绿体遗传工程是一种对环境友好的策略，对环境的影响能 获得大量的种子（每株烟草的种子可达到十万粒）：可以实现 够达到最小“5]。更重要的是，叶绿体能够使真核蛋白质 对这种有害植物的无害使用。作为宿主，种子或块茎还具有 正确折叠并形成二硫健。叶绿体中存在分子伴侣(chapero 易储存的优点。在室温条件下经过6个月储存的水稻种子 ni)能够在原核和真核蛋白质的折叠和装配中行使功能。 中sFv的含量并没有明显地减少[]。在冷冻条件下储存 而且，质体硫氧还蛋白(plastid thioredoxin system)或蛋白质 18个月的马铃薯块茎中仍含有50%的功能抗体s]。烟草 二硫键异构酶(protein disulfide isomerase)通过二硫键的氧 和苜蓿的干叶片中所含有的scFv或IgG抗体经过5一7天 化还原循环能够激活叶绿体蛋白。利用这个体系已经将完 只有少量损失2。 整的人类生长澈素(somatotropin)的表达量提高到7%们。 在摇瓶或发酵罐中悬浮培养植物细胞，如烟草(Nicoti 表达的外源蛋白质正确折叠和装配能够减少因为体外加工 ana tabacum)Petite Havana SR一15)，BY一2s4],豌豆，小 而需要的昂贵成本。例如，大肠杆菌生产人胰岛素必须经过 麦和水稻的悬浮细胞，经基因枪、农杆菌、电穿孔或病毒载体 体外加工过程以形成二硫键并去除甲硫氨酸，这些加工过程 的转化，2一3天后能够瞬时表达外源蛋白。烟草悬浮细胞 所需的费用占全部成本的60%；(2)蛋白质靶向定位：重组 系表达scFv一Bryodin融合蛋白的量达到了30mg/Ls]。利 抗体不在细胞质中而是靶向定位在离质体(apoplast)的表达 用内质网定位肽和优化培养条件能够明显提高目标蛋白的 策略明显提高了重组抗体的产量；靶向定位在内质网的重组 表达水平。 蛋白的表达水平提高了10~100倍[4]，(3)植物中遗传密码 根分泌(rhizosecretion)是指转基因植物将目标蛋白从 子的使用频率与动物不同，对外源基因的-一些密码子进行替 植物根系释放到液体培养基中。毛状根(hairy roots)系统体
1期 肖乃 仲等 ：植物 生 物反应 器 生 产药物 蛋 白的前 景 1O9 3 植 物药 物 和 人 类 蛋 白质 如 果 转 基 因 植 物 生 产 的 药 物 蛋 白需 要 纯 化 ，那 么 只 有 当 它 占 全 部 可 溶 性 蛋 白 质 (totalsolubleprotein，TSP)的 1 以 上才 具有 商业 化 的潜 力 。植 物 来 源 的 重 组 乙 型 肝 炎表 面抗 原 (hepatitis—Bsurfaceantigen)在 人体 试 验 中仅 仅 诱 导 产 生 了较低 水平 的血清 抗体 ，这 可能是 因为转 基 因莴苣 表达 的重 组 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 含 量 低 (1～ 5ng／g 鲜 重 )l3 。 虽 然 马 铃 薯表 达 的诺 沃 克病毒 衣 壳蛋 白(Norwalkviruscapsidpro tein)能够 激发 免疫 反应 ，但是 由于其 产率 过低 ，占 TSP的 0． 37 ，不 能 进 行 大 规 模 的 应 用 。 虽 然 许 多 非 人 源 的 基 因 (植 酸 酶 phytase、葡 聚 糖 酶 glu canase)通过 核 基 因组得 到 了 高 效表 达 ，但 令 人 遗憾 的是 ，编 码人 源 蛋 白质 的基 因在植 物 中 的表达 量 很低 ：人 血 清 白蛋 白 (human serum albumin)占 植 物 TSP 的 0．020 ；人 蛋 白 C (humanproteinc)占 0．001 ；红 细胞 生 成 素 (erythropoie— tin，EP0)占 0．003 ；人 干 扰 素 B(humaninterferon- B)不 到 0．001 (鲜 重 )。人 工 合 成 的 人 表 皮 生 长 因 子 (humanepi dermalgrowthfactor)基 因 在 转 基 因 烟 草 中 表 达 量 仅 达 到 TSP的 0．001％ [41,42]。 为 了 进 一 步 提 高 人 源 蛋 白 在 植 物 细 胞 内 的 表 达 水 平 ，人 们采 用 的策 略 ：(1)希 望 在 叶 绿 体 内合 成 复 杂 的 需 要 翻译 后 修饰 的 或亚 基装 配 的真 核蛋 白质 ，如 sIgA；在 高 等 植物 叶绿 体 中表达 外源 基 因是 一 种 可 供 选 择 的转 基 因体 系 。整 合 到 烟草 叶绿 体基 因组 中的 外 源 基 因拷 贝 数 能 够 达 到 每个 细 胞 10000个 拷 贝 ，相 应 的重组 蛋 白 占全 部 可溶 性 蛋 白的 比例 也 提 高 到 47 [4 。叶绿体 转 化 是 使 用 两个 旁 翼 序列 ，通 过 同 源 重组 将外 源 DNA插 入 叶绿 体 功 能 基 因之 间 ，实 现靶 基 因 的 精 确 定 位 ，消 除 了位 置 效 应 (position effect)。 而 且 在 叶 绿 体 转化 体 系 中没有 观察 到在 核 转化 中常 见 的基 因沉 默现 象 。 叶绿 体 遗传 工 程是 一种 对环 境友 好 的策 略 ，对环 境 的影 响 能 够 达 到最 小[4“ 。更 重 要 的是 ，叶 绿 体 能够 使 真 核 蛋 白质 正 确折 叠并 形 成二 硫 键 。叶 绿 体 中存 在 分 子伴 侣 (chapero nin)能够 在 原 核 和 真 核 蛋 白 质 的 折 叠 和装 配 中行 使 功 能 。 而且 ，质体 硫 氧还 蛋 白(plastidthioredoxinsystem)或蛋 白质 二 硫 键 异 构 酶 (proteindisulfideisomerase)通 过 二 硫 键 的 氧 化 还原循 环 能 够激 活 叶 绿体 蛋 白 。利 用 这 个 体 系 已 经 将 完 整 的人 类生 长 激 素 (somatotropin)的 表 达 量 提 高 到 7％ ]。 表达 的外 源 蛋 白质正 确 折 叠 和 装 配 能够 减 少 因 为 体外 加工 而 需 要 的 昂 贵 成 本 。 例 如 ，大 肠 杆 菌 生 产 人 胰 岛 素 必 须 经 过 体 外 加工 过程 以形 成 二硫 键并 去 除 甲硫氨 酸 ，这 些加 工过 程 所需 的 费用 占全 部 成 本 的 6O ；(2)蛋 白质 靶 向定 位 ：重 组 抗 体 不 在细胞 质 中而 是靶 向定 位 在离 质体 (apoplast)的 表达 策 略 明显 提 高 了重 组 抗体 的产 量 ；靶 向定 位 在 内质 网的重 组 蛋 白的表 达水 平提 高 了 1O～100倍 [4 ；(3)植 物 中遗传 密码 子 的使 用频 率 与动 物 不 同 ，对 外源 基 因 的一些 密码 子进 行 替 换 能够显 著 提 高该基 因在 植 物体 内的 表达 水 平[4 ；(4)使 用 组织 特异 启 动子 和病 毒 序 列 能够 提 高 基 因转 录和 翻 译 的 水 平 ]；(5)在拟 南 芥 中 生 产 豆 类 arcelin，同 时 表 达 种 子储 存 蛋 白清 蛋 白(albumin)2S的反 义 基 因 ，结果 使 得 arcelin的 表 达 量 达 到 种 子 总 蛋 白 的 24 ，利 用 相 似 的 策 略 有 助 于 显 著提 高 目标 蛋 白的表 达水 平 。 4 新 的表 达 策 略 从 持 续 大 量 获 得 药 用 蛋 白 的 需 要 出发 ，利 用 转 基 因 技 术 获得 稳定 的可 遗传 的转 化株 系是 首 选 策 略 。但 是新 策 略仍 然值 得不 断探 讨 。瞬 时表 达 策 略 的 特点 ：(1)由 于瞬 时表 达 所 需 的时 间较短 ，在 大规模 转化 获得 稳定 的转 化植 株 之前 能 够 用 来 检 验 基 因 产 物 是 否 具 有 预 期 的 生 物 学 功 能 们；(2)美 国 公 司 LargeScaleBiologyCorporation利 用 烟 草 花 叶 病 毒 载 体快 速 大 量 生 产 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 ，scFvs等 重 组 蛋 白[21 ；(3)目前 主要 的瞬 时表 达 系 统是 农 杆 菌 真空 渗 透 法 (agroinfiltration)和 重组 病 毒 载 体法 (viralvectors)：其 中 农 杆 菌真 空渗 透法 能够 在 一 周 之 内产 生 毫 克级 的一 种 或 多 种 重组 蛋 白 ，如 scFvs、CEA等 ，可 以 在 临 床试 验 之前 对 目标 蛋 白 的功能 进行 检测 。将 目的基 因 克 隆到 一 种 植 物 病 毒 的 基 因组 中 ，在一 强启 动 子 控 制下 能 够 迅 速 侵染 大量 植 株 ，重 组植 物病 毒 载体 具 有 广 泛 的 宿 主 范 围 。 常用 RNA病 毒 载 体 ，例 如 已经 利 用重 组 TMV 载体在 植 物体 内瞬 时表 达 了大 量 的 scFvl5 。此 种 技 术 的 局 限 在 于 一 般 只 能 表 达 30kDa以 下 的 蛋 白 质 。 人 们 期 望 利 用 基 因 枪 法 和 农 杆 菌 法 对 重 组 病 毒载 体进 行技 术 改进 [1 。 目前 虽然 多 数植 物 抗 体 是 在 烟 草 中 表 达 的 ，但 是 马铃 薯 、大 豆 、苜蓿 、水 稻 以及 小麦作 为 生产植 物抗 体 的系 统也 都 取得 了成 功 。利 用 烟 草 、苜 蓿 、大 豆 生 产植 物抗 体 的最 大 优 点 就 是产量 高 。烟 草作 为宿 主植 物 的好 处 还有 易 于转 化 ；能 获 得 大 量 的 种 子 (每 株 烟 草 的 种 子 可 达 到 十 万 粒 )；可 以 实 现 对这 种有 害植 物 的无 害使用 。作 为 宿主 ，种 子或 块茎 还具 有 易储存 的 优点 。在 室温 条 件 下经 过 6个 月 储存 的水 稻 种 子 中 scFv的含 量 并 没 有 明显 地 减 少 l2 。在 冷 冻 条 件 下 储 存 18个 月的 马铃 薯 块 茎 中仍 含 有 5O 的功 能抗 体 [53]。烟 草 和 苜蓿 的干 叶片 中 所含 有 的 scFv或 IgG抗 体 经 过 5～7天 只 有 少 量 损 失 [2 。 在 摇 瓶 或 发 酵 罐 中悬 浮 培 养 植 物 细 胞 ，如 烟 草 (Nicoti— anatabacum )PetiteHavanaSR一 1[]，BY一 2[]，豌 豆 ，小 麦 和水 稻 的悬 浮 细胞 ，经 基 因枪 、农 杆菌 、电穿孔 或病 毒 载体 的转 化 ，2～3天 后 能 够 瞬 时表 达 外 源 蛋 白 。烟 草 悬 浮 细胞 系表 达 scFv—Bryodin融合 蛋 白的量 达 到 了 30mg／L[5 。利 用 内质 网定 位肽 和优 化 培 养 条件 能 够 明 显提 高 目标 蛋 白的 表 达 水 平 。 根 分 泌 (rhizosecretion)是 指 转 基 因 植 物 将 目 标 蛋 白 从 植 物根 系 释放 到液 体培 养基 中。毛状 根 (hairyroots)系统 体 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯http:/www.cqvip.com 110 遗传HEREDITAS(Beijing)2003 25卷 外生产Guys3抗体能够达到2.4mg/L,是目前产率最高、最 问题是如何进一步提高重组蛋白的表达水平。目前的策略 稳定的方法[6,5)。急需解决的问题是如何改进技术减少抗 主要集中在控制基因沉默，筛选更强的启动子和更适宜的植 体在培养基中的损失，人们希望此种策略有助于减少功能蛋 物宿主等方面。利用悬浮细胞大规模生产重组药物蛋白被 白下游加工的成本。 认为是一种可以实际运用的方式。研究表明，表达抗体的植 物还能获得抵抗植物病毒或真菌病害的能力[6。例如，在 5新的纯化策略 细胞质中表达洋蓟斑点皱叶病毒(mottled crinkle virus)外 高效率的纯化程序是生产重组蛋白的前提，也是设计生 壳蛋白的sCFⅴ片段的转基因植物对病毒的敏感性降低，出 产系统时需要考忠的重要问题。目前应用的纯化程序是为 现症状延迟[a)。在鳄梨，芒果和香蕉中表达真菌Colletotri-- 动物细胞或微生物生产抗体系统而设计的。运用相似的工 chum gloeosporioide果胶裂合酶(pectate lyase)的多克隆抗 艺从植物叶片、种子和植物悬浮细胞中提取纯化重组蛋白的 体基因，能够抑制这种真菌病害的发生6)。 成本中，设备费用占70%，而层析纯化的费用占30%。为了 随着人类基因组计划的逐渐深入，人们将会发现更多的 能够降低成本，人们正在研究新的策略试图降低或消除层析 有医疗作用的蛋白质，进而需要生产使用这些重要的重组产 在生物药生产中的费用。 物。转基因植物将会成为主要的生产系统[)，成为21世纪 一个成功的例子是加拿大科学家在油菜种子油体中表 人类药物的“生产车间”，不断为人类健康提供充足的药物来 达一种抗凝剂蛭素（从水蛭Hirudo medicinalis中分离），并 源。 且通过漂浮离心法进行纯化，使其成为商品5。另一个例 子是利用GVGVP作为融合蛋白(GVGVP是一种人工合成 参考文献(References): 基因编码的蛋白多聚体)，只要一步纯化即可，不需要使用昂 [1]Hiatt A Cafferkey R,Bowdish K,et al.Production of antibod- 贵的层析柱5)。应用这一方法已经成功地将胰岛素纯化。 ies in transgenic plants[J].Nature,1989,342:76~78. 近来还有另一种方法，是利用分子伴侣蛋白将外源蛋白折叠 [2]Zeitlin L,Olmsted SS,Moench T R,et al.A humanized mono- 成立方体结晶，只须一步离心就达到了纯化的目的)。该 clonal antibody produced in transgenic plants for immunopro- 方法还可以防止外源蛋白被细胞内的蛋白酶降解。 tection of the vagina against genital herpes[J].Nat Biotechnol, 前面提到的毛状根系统和悬浮细胞系统也是减少下游 199816:1361-1364. 纯化的研究热点。研究发现分子质量小于20~30kDa的重 [3]Fischer R,Drossard J,Commandeur U,etal.Toward molecular 组蛋白能够通过植物细胞壁分泌到培养基中]，对于分子 farming in the future:Moving from diagnostic protein and anti- 量较大的重组蛋白，通过酶温和地消化植物细胞壁也可以使 body production in microbes to plants[J].Biotechnol Appl Bio- 目标蛋白分泌到培养基中，由此减少了提取纯化的步骤[]。 chem,1999,30:101~108. [4]Magnuson N S,Linzmaier P M,Reeves R,etal.Secretion of bi- 6商业化现状及展望 ologically active human interleukin-2 and interleulin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture [J]. 抗生物素蛋白(avidin)是一种应用广泛的诊断试剂，转 Protein Expr Purif,1998,13:45~52. 基因玉米表达抗生物素蛋白的量已经达到230mg/kg种 [5]Arakawa T,Chong D K,Langridge W H,et al.Efficacy of a 子6门。与从鸡蛋清中提取相比，具用同样的功效而成本降 food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine[J]pub- 低了10倍，现在已经成为Sigma一Aldrich的商品。植物表 licshed erratum appears in Nat Biotechnol 1998 16:478].Nat 达的葡糖醛酸糖苷酶(B一Glucuronidase)也已经进人市 Biotechnol,1998,16:292-297. 场[62]。全球每年需要人血清白蛋白550吨，只有转基因植 [6] Franken E,Teuschel U.Hain R.Recombinant protein from 物系统能够满足这一巨大的需求。据估算，需要30000公顷 transgenic plants[J].Curr Opin Biotech,1997,8:411~416. 的转基因烟草（表达量占TSP的1%）就能生产出足够的蛋 [7]Barta A,Sommergruber K,Thompson D,et al.The expression 白质产品，这仅仅相当于美国可耕作土地面积的1/10001]。 of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene Monsanto公司建立的转基因玉米体系生产人类抗体的 in transformed tobacco and sunflower callus tissue[J].Plant 水平已经达到1.5公斤/英亩。Stanford大学和Bioscource Mol Biol,1986,6:347-357. [8]De Zoeten G A,Penswick J R,Horisberger M A,et al.The ex- Technologies合作研究，开发了一种基于植物病毒的植物瞬 pression,localization and effect of a human interferon in plants 时表达系统生产肿瘤体异性疫苗，在烟草离质体中表达了高 [].Virology,1989,172:213~222. 水平的38C13scFv。经过这种疫苗免疫的小鼠能够产生 [9]Sijmons P C,Dekker B MM,Schrammeijer B,et al.Production 10g/mL以上的抗独特型免疫球蛋白，能够抵御致死剂量 of correctly processed human serum albumin in transgenic 的38C13肿瘤21]。 plants[J].Bio/Technol,1990,8:217~221. 进一步研究及应用植物生物反应器首先要解决的技术 [10]During K,Hippe S,Kreuzaler F,Schell J.Synthesis and selfas- 6
11O 遗 传 HEREDITAS(Beijing)2003 25卷 外 生产 Guy's3抗体 能 够达 到 2．4mg／L，是 目前 产率 最 高 、最 稳定 的方法 [5657]。急需 解决 的 问题 是 如 何 改进 技 术 减 少抗 体 在培 养基 中 的损失 ，人们 希望 此 种策 略有 助 于减 少功 能 蛋 白 下 游 加 工 的 成 本 。 5 新 的纯 化 策 略 高效 率 的纯 化程 序是 生 产重 组蛋 白的前提 ，也是 设 计 生 产 系统 时需 要考 虑 的 重要 问题 。 目前 应 用 的 纯 化 程序 是 为 动 物 细 胞 或 微 生 物 生 产 抗 体 系 统 而 设 计 的 。 运 用 相 似 的 工 艺 从 植 物 叶 片 、种 子 和植 物 悬 浮 细 胞 中 提 取 纯 化 重 组 蛋 白 的 成本 中 ，设 备 费用 占 7O ，而 层析 纯 化 的费用 占 3O 。为 了 能够 降低 成本 ，人们 正 在研 究新 的策 略试 图降低 或 消除 层析 在 生 物 药 生 产 中 的 费 用 。 一 个成 功 的例子 是 加拿 大 科 学 家 在 油 菜 种 子 油体 中 表 达 一种 抗凝 剂蛭 素 (从水 蛭 Hirudomedicinalis中分离 )，并 且通 过 漂浮 离 心 法进 行纯 化 ，使 其 成 为 商 品 [5 。另 一个 例 子是 利 用 GVGVP作为 融合 蛋 白(GVGVP是 一 种 人 工合 成 基 因 编 码 的 蛋 白 多 聚 体 )，只 要 一 步 纯 化 即 可 ，不 需 要 使 用 昂 贵 的层 析柱 [5 。应用 这 一 方 法 已经 成 功 地 将 胰 岛 素 纯 化 。 近来 还 有另 一种方 法 ，是利 用分 子伴 侣 蛋 白将外 源 蛋 白折 叠 成 立 方 体 结 晶 ，只 须 一 步 离 心 就 达 到 了 纯 化 的 目 的 [4 。 该 方法 还 可 以防止 外源 蛋 白被 细胞 内 的蛋 白酶 降解 。 前 面 提 到 的 毛 状 根 系 统 和 悬 浮 细 胞 系 统 也 是 减 少 下 游 纯 化 的研 究 热 点 。研 究 发 现 分 子 质 量 小 于 2O～ 30kDa的 重 组 蛋 白能够 通 过植 物 细胞 壁 分 泌 到培 养 基 中D83；对 于分 子 量 较 大 的 重 组 蛋 白 ，通 过 酶 温 和 地 消 化 植 物 细 胞 壁 也 可 以 使 目标 蛋 白 分 泌 到 培 养 基 中 ，由此 减 少 了提 取 纯 化 的 步 骤 [6 。 6 商 业 化 现 状 及 展 望 抗 生物 素 蛋 白(avidin)是 一 种 应 用 广 泛 的诊 断 试 剂 ，转 基 因 玉 米 表 达 抗 生 物 素 蛋 白 的 量 已 经 达 到 230mg／kg 种 子 。 与从鸡 蛋清 中提 取 相 比 ，具 用 同 样 的 功 效 而 成 本 降 低 了 1O倍 ，现 在 已经 成 为 Sigma— Aldrich的商 品 。植 物 表 达 的 葡 糖 醛 酸 糖 苷 酶 (13一 Glucuronidase)也 已 经 进 入 市 场 。全 球每 年需 要 人 血 清 白 蛋 白 550吨 ，只有 转 基 因植 物 系 统能 够满 足这 一 巨大 的需 求 。据估 算 ，需 要 30000公 顷 的转 基 因烟 草 (表 达量 占 TSP的 1 )就 能 生产 出足 够 的蛋 白质 产 品 ，这仅 仅相 当于美 国可 耕作 土地 面 积 的 1／1000[1 。 Monsanto公 司建 立 的转 基 因玉米 体 系 生 产人 类抗 体 的 水 平 已 经 达 到 1．5公 斤 ／英 亩 。 Stanford大 学 和 Bioscource Technologies合作 研 究 ，开发 了一 种基 于植 物 病 毒 的植 物 瞬 时表 达 系统生 产肿 瘤 体异 性疫 苗 ，在 烟草 离质 体 中表 达 了 高 水平 的 38C13scFv。经 过 这 种 疫 苗 免 疫 的 小 鼠能 够 产 生 10btg／mL 以上 的抗 独 特 型 免 疫 球 蛋 白，能 够 抵 御 致 死 剂 量 的 38C13肿 瘤 l_2 。 进一 步研 究及 应 用植 物 生 物 反 应 器 首先 要 解 决 的技 术 问题 是如 何进 一 步提 高 重 组 蛋 白 的表 达 水 平 。 目前 的 策 略 主 要集 中在 控制 基 因沉 默 ，筛选 更 强 的启动 子 和更适 宜 的植 物 宿 主等 方面 。利 用悬 浮 细 胞 大 规模 生 产 重 组 药 物 蛋 白被 认 为是 一 种可 以实 际运 用 的方式 。研 究 表 明 ，表 达抗 体 的 植 物 还 能获 得抵 抗 植 物 病 毒 或 真 菌 病 害 的能 力 。例 如 ，在 细胞 质 中表 达 洋 蓟 斑 点 皱 叶病 毒 (mottledcrinklevirus)外 壳 蛋 白的 scFv片段 的转 基 因植 物 对 病 毒 的敏 感 性 降低 ，出 现 症状 延迟 。在鳄 梨 、芒 果和 香蕉 中表 达真 菌 Colletotri— chumgloeosporioide果胶 裂 合 酶 (pectatelyase)的 多 克 隆抗 体 基 因 ，能够 抑制 这种 真 菌病 害 的发生 [6 。 随着人 类基 因组计 划 的逐渐 深入 ，人们 将会 发现 更 多 的 有 医 疗 作 用 的 蛋 白 质 ，进 而 需 要 生 产 使 用 这 些 重 要 的 重 组 产 物 。转 基 因 植 物 将 会 成 为 主 要 的 生 产 系 统 [6 ，成 为 21世 纪 人 类药 物 的“生产 车 间”，不断 为人类 健 康提 供充 足 的药 物 来 源 。 参 考 文 献 (References)： [1] HiattA CafferkeyR，BowdishK，eta1．Productionofantibodiesintransgenicplants[J]．Nature，1989，342：76～78． [2] ZeitlinL，OlmstedSS，MoenchT R，eta1．A humanizedmono— clonalantibody produced in transgenic plants for imm unopro— tectionofthevaginaagainstgenitalherpes[J]．NatBiotechnol， 1998 16：1361～ 1364． [3] FischerR，DrossardJ，CommandeurU，eta1．Towardmolecular farm ing in the future：M ovingfrom diagnosticproteinandanti— bodyproductioninmicrobestoplants[J]．BiotechnolApplBio— chem ，1999，3O：101～ 1O8． [43 MagnusonN S，LinzmaierPM，ReevesR，eta1．Secretionofbi— ologicallyactive human interleukin- 2 and interleulin- 4 from geneticallymodified tobacco cellsinsuspension culture[J]． Protein ExprPurif，1998，13：45～ 52． [53 ArakawaT，ChongD K，LangridgeW H，eta1．Efficacyofa foodplant—basedoralcholeratoxinBsubunitvaccine[J][pub— licshederratum appearsinNatBiotechnol199816：478]．Nat Biotechnol，1998，16：292～ 297． [6] Franken E，TeuschelU，HainR．Recombinantprotein from transgenicplants[J]．CurrOpinBiotech，1997，8：411～416． [7] BartaA，SommergruberK，ThompsonD，eta1．Theexpression ofa nopalinesynthase hum an growth horm onechim aericgene intransformed tobaccoandsunflowercallustissue[J]．Plant M olBiol，1986，6：347～ 357． [8] DeZoetenG A，PenswickJR，HorisbergerM A，eta1．Theex— pression，localizationand effectofahuman interferon in plants [J]．Virology，1989，172：213～222． [9] SijmonsPC，DekkerBM M，SchrammeijerB，eta1．Production of correctly processed human serum album in in transgenic plants[J]．Bio／Technol，1990，8：217~221． [1O] DtiringK，Hippes，KreuzalerF，SehellJ．Synthesisandselfas— 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯htp:/ww.cqvip.com 1期 肖乃仲等：植物生物反应器生产药物蛋白的前景 111 sembly of a functional monoclonal antibody in transgenic Nic- C25]Haq T A,Mason H S,Clements J D,et al.Oral immunization otiana tabacum [J].Plant Mol Biol,1990,15:281~293. with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic [11]Ma J K,Hikmat B Y,Wycoff K,et al.Characterization of a re- plants[J].Science,1995,268:714~716. combinant plant monoclonal secretory antibody and preventive 26]Mason H S,Lam D M,Arntzen C J.Expression of hepatitis B immunotherapy in humans[J].Nat Med,1998,4:601~606. surface antigen in transgenic plants [J].Proc Natl Acad Sci [12]Hiatt A,Ma J K.Characterization and applications of antibod- USA,1992,89:11745~11749. ies produced in plants[J].Int Rev Immunol,1993,10:139~ [27]Mason H S,Ball J M,Shi JJ,et al.Expression of Norwalk vi- 152. rus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral [13]Baum T J,Hiatt,Parrott W A,et al.Expression in tobacco of a immunogenicity in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93. functional monoclonal antibody specific to stylet secretions of 5335-5340. the root-knot nematode[J].Mol Plant Microbe In,1996,9:382 [28]McGarvey P B,Hammond J,Dienelt MM,et al.Expression of 387. the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes[]].Bio- [14]De Wilde C,De Neve M,De Rycke R,et al.Intact antigen-bind- technology,1995,13:1484-1487. ing MAK33 antibody and Fab fragment accumulate in intercel- [29]Arakawa T,Chong D K,Merritt J L,et al.Expression of chol- lular spaces of Arabidopsis thaliana []]Plant Sci,1996,114: era toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants[J]. 233-241. Transgenic Res,1997,6:403~413. [15]Schouten A,Roosien J,van Engelen F A,de Jong GA M,et al. [30]Arakawa T,Chong D K,Langridge W H.Efficacy of a food The C-terminal KDEL sequence increases the expression level plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine[J].Nat Bio- of a single-chain antibody designed to be targeted to both cyto- technol,.1998,16:292~297. sol and secretory pathway in transgenic tobacco[J].Plant Mol [31]Carrillo C,Wigdorovitz A,Oliveros J C,et al.Protective im- Biol,1996,30:781793. mune response to foot-and-mouth disease virus with VPl ex- [16]De Neve M,De Loose M,Jacobs A.et al.Assembly of an anti- pressed in transgenic plants[J].J Virol,1998,72:1688~1690. body and its derived antibody fragment in Nicotiana and Arabi [32]Gomez N,Carrillo C,Salinas J,et al.Expression of immuno- dopsis[J].Transgenic Res,1993,2:227~237. genic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroen- [17]Fischer R,Schumann D,Zimmermann S,et al.Expression and teritis coronavirus in transgenic plants [J].Virology,1998, characterization of bispecific single chain Fv fragments pro 249:352358. duced in transgenic plants[J].European J Biochem,1999,262: [33]Mason H S,Haq T A,Clements J D,et al.Edible vaccine pro- 810-816. tects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin [18]Fischer R,Emans N.Molecular farming of pharmaceutical pro- (LT):potatoes expressing a synthetic LT-B gene[J].Vaccine, teins[J].Transgenic Res,2000,9:279~299. 1998,16:13361343. 19]Vaquero C,Sack M,Chandler J,etal.Transient expression of a [34]Thanavala Y,Yang Y F,Lyons P,et al.Immunogenicity of tumor-specific single chain fragment and chimeric antibody in transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen[J].Proc tobacco leaves [J].Proc Natl Acad Sci,1999,96:11128~ Natl Acad Sci USA,1995,92:3358~3360. 11133. [35]Wigdorovitz A,Carrillo C,Dus Santos M J,et al.Induction of a [20]Stoger E,Vaquero C,Torres E,et al.Cereal crops as viable protective antibody response to foot and mouth disease in mice production and story systems for pharmaceutical scFv antibod- following oral or parenteral immunization with alfafa transgen- ies[J].Plant Mol Biol,2000,42:583. ic plants expressing the viral structural protein VPI[J].Virol- [21]McCormick AA,Kumagai MH,Hanley K,et al.Rapid produc- gy,1999,255:347~353. tion of specific vaccine for lymphoma by expression of the [36]Tuboly T,Yu W,Bailey A,et al.Immunogenicity of porcine tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants[J]. transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:703~708. plants[J].Vaccine,2000,18:2023~2028. [22]Khoudi H,Laberge S,Ferullo J M,et al.Production of a diag- [37]Streatfield S J,Jilka J M,Hood EE,et al.Plant-based vac- nostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants[J].Bio- cines:unique advantages[J].Vaccine,2001,19:2742~2748. technol Bioeng,1999,64:135~143. [38]Ma S W,Zhao DL,Yin Z Q,et al.Transgenic plants express- [23]Ma J K,Hiatt A,Hein M,et al.Generation and assembly of se ing autoantigens fed to mice to induce oral immune tolerance cretory antibodies in plants[J].Science,1995,268:716~719. [J].Nat Med,1997,3:793796. [24]Daniell H,Streatfield S J,Wycoff K.Medical molecular farm- [39]Kapusta J.Modelska A,Figlerowicz M,et al.A plant-derived ing:production of antibodies,biopharmaceuticals and edible edible vaccine against hepatitis B virus[J].FASEB J,1999,13: vaccines in plants[J].Trend in Plant Science,2001,6:219~ 17961799. 226. [40]Tacket C O,Mason H S,Losonsky G,et al.Human immune
1期 肖乃仲 等 ：植物 生 物反 应器 生产 药物 蛋 白的前 景 111 sembly ofa functionalm onoclonalantibody in transgenic N ic otianatabacum[J]．PlantMolBiol，1990，15：281～293． [11] MaJK，HikmatBY，WycoffK，eta1．characterizati0nofare— com binantplantm onoclonalsecretory antibody and preventive immunotherapyinhumans[J]．NatMed．1998，4：601～ 606． [12] HiattA，MaJK．Characterizationandapplicationsofantibod iesproducedinplants[J]．IntRevImmunol，1993，10：139～ 152． [13] Baum TJ，Hiatt，ParrottW A，eta1．Expressionintobaccoofa functionalm onoclonalantibody specific to styletsecretions of theroot—knotnematode[J]．MolPlantMicrobeIn，1996，9：382 ～ 387． [143 DeWildeC，DeNeveM，DeRyckeR，eta1．Intactantigenbind— ing M AK33 antibody andFabfragm entaccumulatein intercel— lularspacesofArabidopsisthalianaEJ]．PlantSci，1996，114： 233～ 241． [15] SchoutenA，RoosienJ，vanEngelenFA，deJongG AM ，eta1． T he C—terminalK DEL sequence increases theexpression level ofasingle-chain antibodydesigned to betargeted tobothcyto— solandsecretorypathwayintransgenictobacco[J]．PlantMol Biol，1996，30：781～ 793． [16] DeNeveM，DeLooseM ，JacobsA，eta1．Assemblyofananti— body and itsderivedantibody fragm entin NicotianaandA rabi— dopsis[J]．TransgenicRes，1993，2：227～ 237． [17]FischerR，SchumannD，ZimmermannS，eta1．Expressionand characterization of bispecific single chain Fv fragm ents pro ducedintransgenicplants[J]．EuropeanJBiochem，1999，262： 810～ 816． [18] FischerR，EmansN．Molecularfarmingofpharmaceuticalpro— teins[J]．TransgenicRes，2000，9：279～ 299． [19] VaqueroC，SackM ，ChandlerJ，eta1．Transientexpressionofa tumor-specificsingle chain fragm entand chim eric antibody in tobaccoleaves[J]．ProcNatlAcad Sci，1999，96：11128～ 11133． [20] StogerE，VaqueroC，TorresE，eta1．Cerealcropsasviable production and story systemsforpharm aceuticalscFv antibod— ies[J]．PlantMolBiol，2000，42：583． [21]McCormickAA，KumagaiMH，HanleyK，eta1．Rapidproduc— tion of specific vaccine for lym phom a by expression of the tumor-derivedsingle-chainFvepitopesin tobaccoplants[J]． ProcNatlA cad SciU SA ，1999，96：703～ 708． [223KhoudiH，LabergeS，FerulloJM，eta1．Productionofadiag— nosticmonoclonalantibodyinperennialalfalfaplants[J]．Bio— technolBioeng，1999，64：135～ 143． [23]MaJK，HiattA，HeinM ，eta1．Generationandassemblyofse cretoryantibodiesinplants[J]．Science，1995，268：716～ 719． [243DaniellH，StreatfieldSJ，WycoffK．Medicalmolecularfarm ing：production of antibodies，biopharmaceuticals and edible vaccinesinplants[J]．Trendin PlantScience，2001，6：219～ 226． [25] HaqT A，MasonH S，ClementsJD，eta1．Oralimmunization with a recom binant bacterialantigen produced in transgenic plants[J]．Science，1995，268：714～716． [263 MasonH S，Lam D M，ArntzenC J．ExpressionofhepatitisB surfaceantigenin transgenicplants[J]．ProcNatlAcadSci U SA ，1992，89：11745～ 11749． [273 MasonH S，BallJM ，ShiJJ，eta1．ExpressionofNorwalkvi— rus capsid protein in transgenictobaccoand potatoand itsoral immunogenicityinmice[J]．ProcNatlAcadSciUSA，1996，93： 5335～ 5340． [28] McGarveyPB，HammondJ，DieneltM M ，eta1．Expressionof therabiesvirusglycoprotein intransgenictomatoes[J]．Bio— technology，1995，13：1484~ 1487． [29] ArakawaT，ChongDK，MerrittJL，eta1．Expressionofchol— eratoxinBsubunitoligomersintransgenicpotatoplants[J]． TransgenicRes，1997，6：403～ 413． [3o3 ArakawaT，ChongD K，LangridgeW H．Efficacyofafood plant-basedoralcholeratoxinBsubunitvaccine[J]．NatBio— technol，1998，16：292～ 297． [31] CarrilloC，WigdorovitzA，OliverosJC，eta1．Protectiveim— m une response to foot-and—m outh disease virus with VP1 ex—‘ pressedintransgenicplants[J]．JVirol，1998，72：1688~ 1690． [32] GomezN，CarrilloC，SalinasJ，eta1．Expressionofimmuno— genicglycoprotein S polypeptides from transmissible gastroen— teritiscoronavirusin transgenic plants[J]．Virology，1998， 249：352～ 358． [33] MasonH S，HaqT A，ClementsJD，eta1．Ediblevaccinepro— tects m ice against Eschei'ichia coli heat—labile enterotoxin (LT)：potatoesexpressingasyntheticLT-Bgene[J]．Vaccine， 1998．16：1336～ 1343． [343 ThanavalaY，YangY F，LyonsP，eta1．Immunogenicityof transgenicplant—derived hepatitisB surfaceantigen[J]．Proc N at1Acad SciUSA ，1995，92：3358～ 3360． [35] WigdorovitzA，CarrilloC，DusSantosM J，eta1．Inductionofa protective antibody responseto footand m outhdisease in mice following oralorparenteralim munization withalfafatransgen— icplantsexpressingtheviralstructuralproteinVP1[J]．Virol— ogy，1999，255：347～ 353． [363 TubolyT，YuW ，BaileyA，eta1．Immunogenicityofporcine transm issible gastr0enteritis virus spike protein expressed in plants[J]．Vaccine，2000，18：2023~2028． [37] StreatfieldSJ，JilkaJM，HoodE E，eta1．Plant-basedvac— cines：uniqueadvantages[J]．Vaccine，2001，19：2742～2748． [38]MaSW ，ZhaoD L，YinZQ，eta1．Transgenicplantsexpress— ing autoantigens fed to m ice to induce oralimm une tolerance [J]．NatMed，1997，3：793～796． [39] KapustaJ．ModelskaA，FiglerowiczM，eta1．A plant—derived ediblevaccineagainsthepatitisBvirus[J]．FASEBJ，1999，13： 1796～ 1799． [40] TacketC O，MasonH S，LosonskyG，eta1．Humanimmune 维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯http:/www.cqvip.com 112 遗传HEREDITAS(Beijing)2O03 25卷 responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in trans- Mol Breeding,1995,1:39~50. genic potatoes[J].J Infect Dis,2000,182:302~305. [55]Nagata T,Nemoto Y,Seiichiro H.Tobacco BY-2 cell line as [41]May G D,et al.Application of transgenic plants as production the 'HeLa cell in the cell biology of higher plants[J].Int Rev systems for pharmaceuticals.In Agricultural Materials as Re- Cytol,1992,132:130. newable Resources:Nonfood and Industrial Applications (ACS [56]Francisco J A,Gawlak S L,Miller M,et al.Expression and Symposium Series 647)[C].American Chemical Society,Clar characterization of bryodin 1 and a bryodin 1-based single-chain endon Hills,II,USA,1996,196~204. immunotoxin from tobacco cell culture[J].Bioconjug Chem, [42]Kusnadi A R,Nikolov Z L,Howard J A.Production of recom- 1997,8:708713. binant proteins in transgenic plants:practical considerations [57]Sharp J M,Doran P M.Strategies for enhancing monoclonal [J].Biorechnol Bioeng,1997,56:473~484. antibody accumulation in plant cell and organ culture[J].Bio- [43]DeCosa B,Moar W,Lee S B et al.Hyper-expression of the Bt technol Prog(2001)17:979-992. Cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecti- [58]Sharp J M,Doran P M.Characterization of monoclonal antibod- cidal crystals[J].Nat Biotechnol,2001,19:71~74. y fragments produced by plant cells[J].Biotechnol and Bioeng, [44]Daniell H.GM crops:public perception and scientific solutions 2001,73:338-346. [J].Trends Plant Sci,1999,4:467~469. [59]Boothe J G,et al.Molecular farming in plants:oil seeds as vehi- [45]Daniell H.Environmentally friendly approaches to genetic en- cles for production of pharmaceutical proteins[J].Drug Dev gineering[J].In vitro Cell Dev Biol-plant,1999,35:361~368. Res,1997,42:172~181. [46]Staub J M,Garcia B,Graves J,et al.High-yield production of [60]Daniell H,Guda C,MePherson D T,et al.Hyperexpression of human therapeutic protein in tobacco chloroplasts[J].Nat Bio- an environmentally friendly synthetic polymer gene[J].Meth- technol,2000,18:333~338. ods Mol Biol,1997,63:359-371. [47]Conrad U,Fiedler U,Artsaenko O,et al.High level and stable [61]Fischer R,Liao Y-C,Drossard J.Affinity-purification of a accumulation of single chain Fv antibodies in plant storage or- TMV-specific recombinant full-size antibody from a transgenic gans[J].J Plant Physiol,1998,152:708~711. tobacco suspension culture[J].J Immunol Meth,1999,226:1~ [48]Gallie D.Controlling gene expression in transgenics[J].Curr 10. Opin Plant Biol,1998,1:166~172. [62]Hood E,Witcher D,Maddock S,et al.Commercial production [49]Gossens A,Van Montagu M.Angenon G.Co-introduction of an of Avidin from transgenic maize:characterization of transfor- antisense gene for an endogenous seed storage protein can in- mant,production,processing,extraction and purification[J]. crease expression of a transgene in Arabidopsis thaliana seeds Mol Breed,1997,3:291-306. [J].FEBS Lett,1999,456:160~164. [63]Witcher D,Hood E,Peterson D,et al.Commercial production [50]Kapila J,De Rycke R,van Montagu M,et al.An Agrobacteri- of B-glucuronidase (GUS):a model system for the production um mediated transient gene system for intact leaves[J].Plant of proteins in plants[J].Mol Breeding,1998,4:301~312. Sci,1996,122,101~108. [64]Fischer R,Liao Y-C,Hoffmann K,et al.Molecular farming of [51]Kumagai M H,Donson J,della-Cioppa G,et al.Rapid,high-level recombinant antibodies in plants.Biol Chem,1999,380:825~ expression of glycosylated rice alpha-amylase in transfected plants 839. by an RNA viral vector[J].Gene,2000,245:169~174. [65]Tavladoraki P,Benvenuto E,Trinca S,et al.Transgenic plants ex- [52]Verch T,Yusibov V,Koprowski H.Expression and assembly pressing a functional single-chain Fy antibody are specifically pro- of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant vi- tected from virus attack[].Nature,1993,366:469~472. rus vector[J].J Immunol Meth,1998,220:69~75. [66]Wattad C,Kobiler D,Dinoor A,et al.Pectase lyase of Colleto- [53]Artsaenko O,Kettig B,Fiedler U,et al.Potato tubers as a bio- trichum gloeospoprioides attacking avocado fruits:cDNA clo- factory for recombinant antibodies[J].Mol Breed,1998,4:313 ning and involvment in pathogenicity [J].Physiological and 319. Molecular Plant Pathology,1997,50:197~212. [54]Voss A,Niersbach M,Hain R,et al.Reduced virus infectivity [67]刘涤.转基因植物一生产药物的生物反应器[J门.生物技术 in N.tabacum secreting a TMV-specific full size antibody[J]. 通报，1999,15(3)：2327
112 遗 传 HEREDITAS(Beijing)2003 25卷 [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [5O] [51] [52] [53] [54] responsesto a novelNorw alk virus vaccinedelivered in trans— genicpotatoes[J]．JInfectDis，2000，182：302～305． M ay G D，eta1．Application oftransgenicplantsasproduction system sfor pharm aceuticals．In AgriculturalM aterials as Re— newable ResourcesiN onfood and IndustrialA pplications (A CS Symposium Series647)[c]．AmericanChemicalSociety，Clar— endon H ills。II，USA 。1996。196～ 204． K usnadiA R ，N ikolov Z L ，H oward J A ．Production ofrecom binant proteins in transgenic plants：practical considerations [J]．BiotechnolBioeng，1997，56：473～484． DeCosa B，M oar W ，Lee S B eta1．H yperexpression ofthe Bt Cry2A a2 operon in chloroplasts leads to formation ofinsecti cidalcrystals[J]．NatBiotechnol，2001，19：71～74． DaniellH ．GM crops；public perception and scientificsolutions [J]．TrendsPlantSci，1999，4；467～469． DaniellH．Environmentally friendly approaches to genetic en— gineering[J]．InvitroCellDevBiolplant，1999，35：361～368． Staub J M ，Garcia B，GravesJ，eta1．High—yield production of humantherapeuticproteinintobaccochl0r0plasts[J]．NatBio technol。2000，18：333～ 338． Conrad U ，Fiedler U ，Artsaenko O ，eta1．H igh leveland stable accum ulation ofsingle chain Fv antibodies in plantstorage or— gans[J]．JPlantPhysiol，1998，152：7O8～711． GallicD．Controllinggeneexpression intransgenics[J]．Curr Opin PlantBiol，1998，1：166～ 172． GossensA ，Van M ontagu M ，AngenonG．Co-introduction ofan antisensegene foran endogenous seed storage protein can in creaseexpression ofa transgene in Arabidopsis thaliana seeds [J]．FEBSLett，1999，456：160～164． KapilaJ，De Rycke R ，van M ontagu M ，eta1．An Agrobacteri um mediatedtransientgenesystem forintactleaves[J]．Plant Sci，1996，122：101～ 1O8． KumagaiM H ，Donson J，della-Cioppa G ，eta1．Rapid，high-level expression ofglycosylated rice alpha-amylase in transfected plants byanRNA viralvector[J]．Gene，2000，245：169～174． Vetch T ，Yusibov V 。Koprow skiH．Expression and assembly ofafull—length monoclonalantibody in plantsusing aplantvi— rusvector[J]．JImmunolMeth，1998，220：69～75． ArtsaenkoO ，Kettig B。FiedlerU ，eta1．Potatotubersasabio factoryforrecombinantantibodies[J]．MolBreed，1998，4：313 ～ 319． VossA ，N iersbach M ，H ain R ，eta1．Reduced virus infectivity inN．tabacum secretingaTMV specificfullsizeantibody[J]． M olBreeding，1995，1：39～ 5O． [ss] NagataT，NemotoY，SeiichiroH．TobaccoBY-2celllineas theHeLa"cellinthecellbiologyofhigherplants[J]．IntRev Cytol，1992，132：1～ 3O． [56] FranciscoJA，Gawlak S L，MillerM ，eta1．Expressionand characterization ofbryodin 1andabryodin 1-based single-chain immunotoxinfrom tobaccocellculture[J]．BioconjugChem， 1997，8：7O8～ 713． [57] SharpJM，DoranP M．Strategiesforenhancingmonoclonal antibodyaccumulationinplantcellandorganculture[J]．Bio— technolProg (2001) 17：979～ 992． [58]SharpJM ，DoranPM．Characterizationofmonoclonalantibod— yfragmentsproducedbyplantcells[J]．BiotechnolandBioeng， 2001，73：338～ 346． [59] BootheJG，eta1．Molecularfarminginplants：oilseedsasvehi— clesforproductionofpharmaceuticalproteins[J]．Drug Dev Res。1997，42：172～ 181． [6O] DaniellH，GudaC，McPhersonD T，eta1．Hyperexpressi0n0f anenvironmentallyfriendlysyntheticpolymergene[J]．Meth— odsM olBiol，1997，63：359～ 371． [61] FischerR，Liao Y-C，Drossard J．Affinity-purification ofa T M V—specificrecombinantfull—size antibody from a transgenic tobaccosuspensionculture[J]．JImmunolMeth，1999，226：1～ 10． [62] HoodE，WitcherD，MaddockS，eta1．Commercialproduction ofA vidin from transgenic maize：characterization of transfor— mant，production，processing，extraction andpurification[J]． M olBreed，1997，3：291～ 306． [63] WitcherD，HoodE，PetersonD，eta1．Commercialproduction 0fe glucuronidase (GU S)：a m odelsystem forthe production ofproteinsinplants[J]．MolBreeding。1998。4：301～312． [64]FischerR，LiaoY—C，HoffmannK，eta1．Molecularfarmingof recombinantantibodies in plants．BiolChem 。1999。380：825～ 839． [65]TavladorakiP，BenvenutoE，Trinca S，eta1．Transgenieplantsex— pressing a functionalsing le-chain Fv antibody arespecifically pro— tectedfrom virusattack[J]．Nature，1993。366：469~472． [66]WattadC，KobilerD，DinoorA，eta1．PectaselyaseofColleto trichum gl0e0sp0pri0ides attacking avocado fruits：cDN A clo— ningand involvmentin pathogenicity[J]．Physiologicaland M olecularPlantPathology，1997，50：197～ 212． [67]刘 涤．转 基 因植 物—— 生 产药 物 的生 物反 应器 [J]．生 物 技术 通 报 ，1999，15(3)：23～ 27． 维普资讯 http://www.cqvip.com