2006年第10期 广东化工 第33卷总第162期 www.gdchem.com 25· 专论与综述 纤维素酶水解及其在能源与环境保护中的应用 曾傲，叶君 (华南理工大学资源科学与造纸工程学院，广东广州510640) [清要]纤维素酶的利用是扩大纤维素应用领域和高值化利用纤维素的一条可行的新途径。本文综述了纤维素酶的来源、纤维 素酶的结构和组成、纤维素酶解机理及影响因素、纤维素酶在能源及环境保护方面的应用。 [关健词纤维素酶；纤维素酶解；纤维素酶应用 Progress in Study of Callulase Hydrolysis and Its Application Zeng Ao,Ye Jun (School of Resource Science and Paper-Making Engineering,South China University of Technology, Guangzhou 510640,China) Abstract:Application of cellulase is a feasible and novel route for broadening fields of applications of cellulose and high-vabled utilizing cellulose.In this paper,source of cellulase,the structure and composes of cellulase,mechanism and effect factors of cellulase hydrolysis and cellulase applications for energy and envionment protection are reviewed. Keywords:cellulose;cellulase hydrolysis;application of cellulase 随着现代工业的发展，世界人口的激增，能源危机日趋加 细胞和数种真菌中克隆到纤维酶基因，对一些纤维素酶的氨基 剧，许多专家估计，世界上已知的石油储存量正在逐年减小。 酸序列及活点部位已基本弄清。利用定点突变方法对纤维酶蛋 所以，世界各国纷纷展开新能源的研究与开发，其中以燃料酒 白进行定向设计与改造再也不再是纸上谈兵。还有通过基因 精的生产最为突出。而纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 工程构建生产纤维素酶的高效工程菌，从而提高纤维素酶活力 植物每年通过光合作用，能产生高达15.5×10°t纤维素类物质， 的报道，这些研究成果将会给纤维素酶的生产带来突破性的进 其中纤维素、半纤维素的总量为8.5×100四。而每年用于工业 展。利用酶法水解转化纤维素资源是今后发展的必然趋势。 过程或燃烧的纤维素仅占2%左右，还有很大一部分未被有效利 本文综述了纤维素酶的来源、结构及组成、酶解过程及彩 用。因此研究开发纤维素的转化技术，将秸秆、蔗渣、废纸、 响因素以及纤维素酶在环境保护及能源领域的应用。 垃圾纤维等纤维素类物质高效地转化为糖，进一步发酵成酒精， 对开发新能源、保护环境具有非常重要的现实意义。 1纤维素酶的来源 纤维素大分子降解的方法有酸法水解、酶法水解、氧化降 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物、细菌放线菌、 解、生物降解、热降解、机械降解、离子辐射降解等多种途径。 真菌等都能产生纤维素酶。据不完全统计，20世纪60年代以 其中酶法水解有着反应条件温和、易于控制、产物单纯等优点， 来国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有53个属的几千个 但目前酶法水解仍处于水解速度缓慢、效率甚低的状态。随着 菌株。由于放线菌纤维素酶的产量极低，所以研究很少。细菌 生物技术的发展及基因过程在纤维素酶生产上的应用，有关纤 纤维素酶产量不高，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维 维素酶基因克隆与表达的研究报道日益增多，迄今已从40多种 素没有降解活性，且所产生的酶是胞内酶或吸附在细胞壁上， [收精日期]2006-07-04 [作者简介]曾傲(1985-)，男，广东人，本科生，研究方向为纤维素学科
2006 年 第 10 期 广 东 化 工 第 33 卷 总第 162 期 www.gdchem.com · 25 · 纤维素酶水解及其在能源与环境保护中的应用 曾傲，叶君 （华南理工大学 资源科学与造纸工程学院，广东 广州 510640） [摘 要]纤维素酶的利用是扩大纤维素应用领域和高值化利用纤维素的一条可行的新途径。本文综述了纤维素酶的来源、纤维 素酶的结构和组成、纤维素酶解机理及影响因素、纤维素酶在能源及环境保护方面的应用。 [关键词]纤维素酶；纤维素酶解；纤维素酶应用 Progress in Study of Callulase Hydrolysis and Its Application Zeng Ao, Ye Jun (School of Resource Science and Paper-Making Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: Application of cellulase is a feasible and novel route for broadening fields of applications of cellulose and high-vabled utilizing cellulose. In this paper, source of cellulase, the structure and composes of cellulase, mechanism and effect factors of cellulase hydrolysis and cellulase applications for energy and envionment protection are reviewed. Keywords: cellulose；cellulase hydrolysis；application of cellulase 随着现代工业的发展，世界人口的激增，能源危机日趋加 剧，许多专家估计，世界上已知的石油储存量正在逐年减小。 所以，世界各国纷纷展开新能源的研究与开发，其中以燃料酒 精的生产最为突出。而纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 植物每年通过光合作用，能产生高达 15.5×1010 t 纤维素类物质， 其中纤维素、半纤维素的总量为 8.5×1010 t[1]。而每年用于工业 过程或燃烧的纤维素仅占 2%左右，还有很大一部分未被有效利 用。因此研究开发纤维素的转化技术，将秸秆、蔗渣、废纸、 垃圾纤维等纤维素类物质高效地转化为糖，进一步发酵成酒精， 对开发新能源、保护环境具有非常重要的现实意义。 纤维素大分子降解的方法有酸法水解、酶法水解、氧化降 解、生物降解、热降解、机械降解、离子辐射降解等多种途径。 其中酶法水解有着反应条件温和、易于控制、产物单纯等优点， 但目前酶法水解仍处于水解速度缓慢、效率甚低的状态。随着 生物技术的发展及基因过程在纤维素酶生产上的应用，有关纤 维素酶基因克隆与表达的研究报道日益增多，迄今已从 40 多种 细胞和数种真菌中克隆到纤维酶基因，对一些纤维素酶的氨基 酸序列及活点部位已基本弄清。利用定点突变方法对纤维酶蛋 白进行定向设计与改造再也不再是纸上谈兵[2]。还有通过基因 工程构建生产纤维素酶的高效工程菌，从而提高纤维素酶活力 的报道，这些研究成果将会给纤维素酶的生产带来突破性的进 展[3]。利用酶法水解转化纤维素资源是今后发展的必然趋势。 本文综述了纤维素酶的来源、结构及组成、酶解过程及影 响因素以及纤维素酶在环境保护及能源领域的应用。 1 纤维素酶的来源[4] 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物、细菌放线菌、 真菌等都能产生纤维素酶。据不完全统计，20 世纪 60 年代以 来国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有 53 个属的几千个 菌株。由于放线菌纤维素酶的产量极低，所以研究很少。细菌 纤维素酶产量不高，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维 素没有降解活性，且所产生的酶是胞内酶或吸附在细胞壁上， 专论与综述 [收稿日期] 2006-07-04 [作者简介] 曾傲（1985-），男，广东人，本科生，研究方向为纤维素学科
广东化工 2006年第10期 ·26 www.gdchem.com 第33卷总第162期 不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，所以工业上很少 4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。③阝葡萄糖苷酶(EC 采用细菌作为生产菌种。目前，用于生产纤维素酶的微生物较 3.2.1.21,简称BG),这类酶可水解纤维二糖和短链的纤维素生 多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉 成葡萄糖。 和青霉，以木霉属菌种居多，较为典型的有里氏木霉、绿色木 3纤维素酶水解过程 霉、康氏木霉，这是目前公认较好的纤维素酶生产菌。现已制 成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉以及拟青霉和斜卧青霉 3.1纤维素酶的作用机理 等生产的纤维素酶。 纤维素酶的作用机制至今仍不很清楚，普遍认为是3种组 分协同作用的结果，但各组分如何作用，尤其是C1酶和Cx酶 2纤维素酶的结构与组成 的作用方式，许多研究者提出了不同看法。 2.1纤维素酶的结构 3.1.1C1-Cx理论 近年来对纤维素酶的结构、功能性氨基酸的研究及对其基 1950年，Reese等对纤维素酶的作用方式提出了一个著名的 因的克隆方面研究比较活跃。这些研究成果对深入到分子水平 C1-Cx假说，它的基本水解模式是： 认识纤维素酶作用机制，提高酶活性及提高酶稳定性等起了推 进作用。目前已经对纤维素酶的一级结构和三级结构形成了共 结晶纤维素1→无定形纤维素G→纤维二糖 识。认为纤维素酶分子普遍具有类似的结构，由球状的纤维素 催化结构域(Catalyticdomains,CD),纤维素结合结构域 B-葡萄糖苷酵→葡萄糖 (Cellulose-B inding Domsins,CBD)和连接桥Linker)三部分 C1酶首先作用于结晶纤维素使其变成无定形纤维素，再 组成。不同来源的纤维素酶尽管具有不同的分子量，但是其CD 被Cx酶进一步水解成可溶性产物，即C1酶的作用是Cx酶水解的 的大小却基本一致；纤维素酶的CBD主要可维持酶分子的构象 先决条件。但对C1酶的作用机理不清楚，提出了种种推测，如 稳定性，调节酶对可溶性和非可溶性底物的结合专一性；Linker C1可能作用于纤维素链间的氢键或者作用于纤维素中少数的 可保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较为稳 B-1,4-葡萄糖苷键，或者其它一些不规则的键、薄弱键等等， 定的聚集体。 可是都没有分离得到C1酶。后来Wood等人分离鉴定了C1酶， 在对CD的研究中，研究者们为了确定纤维素酶中哪个氨基 改变了C1酶的非水解作用的概念，认为C1酶是一种水解酶，它 酸是酶催化的必需氨基酸，运用定点突变的技术，利用合成的 不易作用于羧甲基纤维素，而能作用于结晶纤维素，磷酸膨胀 寡核苷酸作诱变物。按照设计的方案，在已知的核苷酸序列中 纤维素等，主要产物是纤维二糖，证明C1酶是一种B-1,4-葡聚 准确地诱变密码子中的一个或数个碱基，改变组成酶的一个或 糖纤维二糖水解酶。但陈洪章等1研究认为C1是CMC酶、BH 数个氨基酸残基，从而确定功能性氨基酸基团。研究虽然取得 酶、CB酶自组织的一个复合体，作用于结晶区。 了很大的进展，但是由于纤维素酶属于糖基水解酶，而糖基水 3.1.2协同降解模型四 解酶共有82个族，纤维素酶仅占十几个族，各族水解酶的催化 目前，普遍接受的酶解机制是协同作用模型，见图1。 机制和功能性氨基酸都有所不同，这也给研究带来了许多困难。 目前国内外的研究主要针对纤维素酶所属的第5,7,9等族纤维 不溶性Cx酶 不溶性和可溶性纤 素酶，如对第5族纤维素酶的研究中Park认为Ser287和Ala296 纤维素 维寡糖 是该酶的功能性氨基酸；在对第7族纤维素酶的研究中Divne!向 C1酶 等利用定点突变的方法发现Glu212和Gu217是其催化残基； 反 CB Riedell等对第9族的研究中推断Asp84和Glu447为其催化残基 馈 纤维二糖 等，而对于其它族的研究并不透彻。 多 秀 2.2纤维素腾的组成4,8 制 CB酶 纤维素酶是指能够水解纤维素B-1,4葡萄糖苷键，使纤维素 葡萄糖 变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是一种单一酶， 而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶主要有3种组分：①葡 图1协同降解模型 聚糖内切酶(EC3.2.1.4,也称Cx酶，CMC酶或EG),这类酶 作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键， 在协同降解过程中，首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起 将长链纤维分子截断，产生大量具有非还原性末端的小分子纤 作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后 维素。②葡聚糖外切酶(EC3.2.1.91,也称C1酶，纤维二糖水 再由C1酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将 解酶或BH),这类酶作用于纤维素线状分子的末端，水解郢1， 纤维二糖水解为葡萄糖
广 东 化 工 2006 年 第 10 期 · 26 · www.gdchem.com 第 33 卷 总第 162 期 不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，所以工业上很少 采用细菌作为生产菌种。目前，用于生产纤维素酶的微生物较 多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉 和青霉，以木霉属菌种居多，较为典型的有里氏木霉、绿色木 霉、康氏木霉，这是目前公认较好的纤维素酶生产菌。现已制 成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉以及拟青霉和斜卧青霉 等生产的纤维素酶。 2 纤维素酶的结构与组成 2.1 纤维素酶的结构 近年来对纤维素酶的结构、功能性氨基酸的研究及对其基 因的克隆方面研究比较活跃。这些研究成果对深入到分子水平 认识纤维素酶作用机制，提高酶活性及提高酶稳定性等起了推 进作用。目前已经对纤维素酶的一级结构和三级结构形成了共 识。认为纤维素酶分子普遍具有类似的结构，由球状的纤维素 催化结构域（Catalyticdomains，CD），纤维素结合结构域 （Cellulose-B inding Domsins，CBD）和连接桥(Linker)三部分 组成。不同来源的纤维素酶尽管具有不同的分子量，但是其CD 的大小却基本一致；纤维素酶的CBD主要可维持酶分子的构象 稳定性，调节酶对可溶性和非可溶性底物的结合专一性；Linker 可保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较为稳 定的聚集体。 在对CD的研究中，研究者们为了确定纤维素酶中哪个氨基 酸是酶催化的必需氨基酸，运用定点突变的技术，利用合成的 寡核苷酸作诱变物。按照设计的方案，在已知的核苷酸序列中 准确地诱变密码子中的一个或数个碱基，改变组成酶的一个或 数个氨基酸残基，从而确定功能性氨基酸基团。研究虽然取得 了很大的进展，但是由于纤维素酶属于糖基水解酶，而糖基水 解酶共有82个族，纤维素酶仅占十几个族，各族水解酶的催化 机制和功能性氨基酸都有所不同，这也给研究带来了许多困难。 目前国内外的研究主要针对纤维素酶所属的第5，7，9等族纤维 素酶，如对第5族纤维素酶的研究中Park[5]认为Ser 287和Ala 296 是该酶的功能性氨基酸；在对第7族纤维素酶的研究中Divne[6] 等利用定点突变的方法发现Glu212和Glu217是其催化残基； Riedel[7]等对第9族的研究中推断Asp 84和Glu 447为其催化残基 等，而对于其它族的研究并不透彻。 2.2 纤维素酶的组成[4,8] 纤维素酶是指能够水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使纤维素 变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是一种单一酶， 而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶主要有3种组分：① 葡 聚糖内切酶（EC 3.2.1.4，也称 Cx 酶，CMC酶或EG），这类酶 作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键， 将长链纤维分子截断，产生大量具有非还原性末端的小分子纤 维素。② 葡聚糖外切酶（EC 3.2.1.91，也称C1酶，纤维二糖水 解酶或BH），这类酶作用于纤维素线状分子的末端，水解β-1， 4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。③ β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21，简称BG），这类酶可水解纤维二糖和短链的纤维素生 成葡萄糖。 3 纤维素酶水解过程 3.1 纤维素酶的作用机理 纤维素酶的作用机制至今仍不很清楚，普遍认为是3 种组 分协同作用的结果，但各组分如何作用，尤其是C1 酶和Cx 酶 的作用方式，许多研究者提出了不同看法。 3.1.1 C1-Cx 理论[9] 1950年，Reese等对纤维素酶的作用方式提出了一个著名的 C1-Cx假说，它的基本水解模式是： 结晶纤维素 ⎯⎯→C1 无定形纤维素 ⎯⎯→Cx 纤维二糖 ⎯β ⎯ → −葡萄糖苷酶 ⎯⎯⎯ 葡萄糖 C1 酶首先作用于结晶纤维素使其变成无定形纤维素，再 被Cx酶进一步水解成可溶性产物，即C1酶的作用是Cx酶水解的 先决条件。但对C1酶的作用机理不清楚，提出了种种推测，如 C1 可能作用于纤维素链间的氢键或者作用于纤维素中少数的 β-1,4 -葡萄糖苷键，或者其它一些不规则的键、薄弱键等等， 可是都没有分离得到C1酶。后来Wood等人分离鉴定了C1酶， 改变了C1酶的非水解作用的概念，认为C1酶是一种水解酶，它 不易作用于羧甲基纤维素，而能作用于结晶纤维素，磷酸膨胀 纤维素等，主要产物是纤维二糖，证明C1酶是一种β-1，4-葡聚 糖纤维二糖水解酶。但陈洪章等[10]研究认为C1是CMC酶、BH 酶、CB酶自组织的一个复合体，作用于结晶区。 3.1.2 协同降解模型[11] 目前，普遍接受的酶解机制是协同作用模型，见图1。 图1 协同降解模型 在协同降解过程中，首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起 作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后 再由C1酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将 纤维二糖水解为葡萄糖。 不溶性 纤维素 CB 酶 C1 酶 纤维二糖 CB 酶 葡萄糖 Cx 酶 反 馈 抑 制 不溶性和可溶性纤 维寡糖
2006年第10期 广东化工 第33卷总第162期 www.gdchem.com 27· 3.1.3分子结构理论 乙醇等物质。而甲醇、乙醇除了作为重要的化工原料外，还可 纤维素酶分子的CBD通过芳香族氨基酸上芳香环和葡萄糖 以替代汽油与煤炭等矿物质燃料，应用于汽车燃料、发电等重 环的堆积力吸附到纤维素上，再由CBD上其余的氢键形成残基 要方面。 与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下 4.2纤维素酶在石油开采方面的应用 来，以利于催化区的水解作用。而CD中的Gu位于细菌，真菌 我国石油资源丰富，目前很多油田已进入了中后期开采。 的内切酶、外切酶、葡萄糖苷的活性位点，在异头碳原子位通 为了增加石油产量，现常采用带压力的压滤液压入地层内，以 过构型的保留或转化完成催化作用，其中两个保守的羧基氨基 维持地下裂缝，保持地下压力。用纤维素酶制成的一种酶剂是 酸分别作为质子供体或亲核试剂，通过水解双置换反应脱去葡 较适宜的破乳剂。酶制剂作为破乳剂，专一性强，无副作用， 萄糖残基2，)。通过纤维素酶的分子结构和功能的研究，对其 对地层和环境无污染1。 水解机制作出了基本的阐明，但关于CBD是如何吸附到纤维素 纤维素酶还被广泛应用于地质钻井中，其洗井用量为0.1~ 表面，然后CBD是如何与催化区相互作用降解纤维素，目前尚 1kgm3孔段体积，它能够在静压下使淤塞在井壁内的冲洗液中 未作出合理解释。 的魔芋聚糖催化水解为单糖，从而快速恢复岩层的透水性质， 3.2影响纤维素酶解作用的因素 提高洗井质量。此外，利用纤维素酶生产的洗涤剂可作为降硬 纤维素酶与其它生物酶一样，其酶解过程有最佳酶解条件。 剂使用，是一种具有高活性纤维素酶的浓缩洗涤剂组合物，性 研究结果发现，对纤维素酶解得率产生影响的主要因素有温度、 能极佳。 pH值、底物浓度及加酶量等。 4.3纤维素酶在可降解塑料业中的应用 3.2.1温度的形响 目前，“白色污染”问题倍受人们的关注，作为解决“白 酶作为生物催化剂与一般催化剂一样具有温度效应，温度 色污染”问题有效途径之一的可降解塑料的研究自然很受人们 主要影响酶活力，从而影响酶解得率。纤维素酶解得率随温度 的重视。近年来，利用米根霉发酵生产L-乳酸，但以葡萄糖、 升高呈抛物线变化，最适宜酶水解温度为45~55℃。 淀粉为原料的生产成本依然较高，这限制了L-乳酸在可降解塑 3.2.2pH值的影响 料方面的应用。玉米中含有丰富的米根霉生长所需的营养因子， 酶的催化活性与环境H值有密切关系，通常各种酶只有在 直接利用玉米为原料生产L-乳酸，可以利用这些丰富的营养因 一定H值范围内才具有活性。pH值的影响呈抛物线关系，最适 子提高原料的利用率。最近，崔洪斌等阿成功地以纤维素酶水 pH值为4.5~5.5。 解玉米芯得到了L-乳酸，并研究确定了纤维素酶水解玉米芯的 3.2.3底物浓度的形响14 最佳条件：pH=4.5,温度35℃，酶添加量10Wg玉米芯，底物浓 当酶浓度一定时，在较低的底物浓度范围内(0~1.0%)， 度100gL,纤维素酶水解玉米芯的葡萄糖收率为27.1%。徐忠 酶反应的速度随底物浓度的增大而增大，酶解得率增幅很大； 等对大豆秸秆纤维素酶水解条件进行研究，取得了新进展， 但当底物浓度大于1.0%后，底物浓度的增加不再明显，因此， 加酶量450Wg,温度45℃，底物浓度5%，反应时间28h,酶解 最佳底物浓度为1.0%。 糖得率28.63%。 3.2.4加醉量的彭响 5结束语 在温度、pH值、底物浓度和酶解时间相同的情况下，通常 是加酶量越大，纤维素酶得率越高；但当加酶量大于1.0Umg 纤维素物质是一个可再生的资源宝库，对纤维素资源转化 后，得率随加酶量增加的幅度不大，因此，最佳的加酶量确定 与利用的研究具有广阔的前景和应用价值，其中纤维素酶法降 为1.0U/mg。 解纤维素物质是一条经济可行的途径。关于纤维素酶降解纤维 素一直受到欧美、日本等发达国家的高度重视，特别是近年来， 4纤维素酶在能源及环境保护领域中的应用 纤维素酶基因克隆技术、固定化酶技术及微生物发酵技术等新 4.1纤维素酶在纤维原料（废渣）降解中的应用 技术的应用，使得在纤维素的生物降解方面取得长足的进展， 植物纤维原料是地球上最丰富、最廉价而又可再生的资源， 工业化应用已日趋成熟。目前，国内在这方面的研究也处于方 其主要成分是纤维素和半纤维素，应用纤维素酶或微生物发酵 兴未艾的阶段，所以通过酶法转化纤维素资源具有深刻的社会 把植物纤维，如木林、农作物秸秆和城市废料中的纤维素转化 意义。 成葡萄糖、酒精和有机酸等产品，这对于开辟工业原料来源， 提供新能源和变废为宝具有十分重要的意义。 参考文献 因此，利用纤维素酶水解纤维素，用于生产葡萄糖则更为 [1]汪维云，朱金华，吴守一。纤维素科学及纤维素酶的研究进展。江苏 重要。葡萄糖本身是一种非常易于消化的营养物质，更是生产 理工大学学报，1998,193)：20-27. 许多化工材料的重要原料。通过发酵，用葡萄糖可生产甲醇、 [2]Anu Harkki Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with
2006 年 第 10 期 广 东 化 工 第 33 卷 总第 162 期 www.gdchem.com · 27 · 3.1.3 分子结构理论 纤维素酶分子的CBD通过芳香族氨基酸上芳香环和葡萄糖 环的堆积力吸附到纤维素上，再由CBD上其余的氢键形成残基 与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下 来，以利于催化区的水解作用。而CD中的Glu位于细菌，真菌 的内切酶、外切酶、葡萄糖苷的活性位点，在异头碳原子位通 过构型的保留或转化完成催化作用，其中两个保守的羧基氨基 酸分别作为质子供体或亲核试剂，通过水解双置换反应脱去葡 萄糖残基[12,13]。通过纤维素酶的分子结构和功能的研究，对其 水解机制作出了基本的阐明，但关于CBD是如何吸附到纤维素 表面，然后CBD是如何与催化区相互作用降解纤维素，目前尚 未作出合理解释。 3.2 影响纤维素酶解作用的因素 纤维素酶与其它生物酶一样，其酶解过程有最佳酶解条件。 研究结果发现，对纤维素酶解得率产生影响的主要因素有温度、 pH 值、底物浓度及加酶量等[14]。 3.2.1 温度的影响 酶作为生物催化剂与一般催化剂一样具有温度效应，温度 主要影响酶活力，从而影响酶解得率。纤维素酶解得率随温度 升高呈抛物线变化，最适宜酶水解温度为45～55℃。 3.2.2 pH值的影响 酶的催化活性与环境pH值有密切关系，通常各种酶只有在 一定pH值范围内才具有活性。pH值的影响呈抛物线关系，最适 pH值为4.5～5.5。 3.2.3 底物浓度的影响[14] 当酶浓度一定时，在较低的底物浓度范围内（0～1.0%）， 酶反应的速度随底物浓度的增大而增大，酶解得率增幅很大； 但当底物浓度大于1.0%后，底物浓度的增加不再明显，因此， 最佳底物浓度为1.0%。 3.2.4 加酶量的影响 在温度、pH值、底物浓度和酶解时间相同的情况下，通常 是加酶量越大，纤维素酶得率越高；但当加酶量大于1.0 IU/mg 后，得率随加酶量增加的幅度不大，因此，最佳的加酶量确定 为1.0 IU/mg。 4 纤维素酶在能源及环境保护领域中的应用 4.1 纤维素酶在纤维原料（废渣）降解中的应用 植物纤维原料是地球上最丰富、最廉价而又可再生的资源， 其主要成分是纤维素和半纤维素，应用纤维素酶或微生物发酵 把植物纤维，如木材、农作物秸秆和城市废料中的纤维素转化 成葡萄糖、酒精和有机酸等产品，这对于开辟工业原料来源， 提供新能源和变废为宝具有十分重要的意义。 因此，利用纤维素酶水解纤维素，用于生产葡萄糖则更为 重要。葡萄糖本身是一种非常易于消化的营养物质，更是生产 许多化工材料的重要原料。通过发酵，用葡萄糖可生产甲醇、 乙醇等物质。而甲醇、乙醇除了作为重要的化工原料外，还可 以替代汽油与煤炭等矿物质燃料，应用于汽车燃料、发电等重 要方面[15]。 4.2 纤维素酶在石油开采方面的应用 我国石油资源丰富，目前很多油田已进入了中后期开采。 为了增加石油产量，现常采用带压力的压滤液压入地层内，以 维持地下裂缝，保持地下压力。用纤维素酶制成的一种酶剂是 较适宜的破乳剂。酶制剂作为破乳剂，专一性强，无副作用， 对地层和环境无污染[18]。 纤维素酶还被广泛应用于地质钻井中，其洗井用量为0.1～ 1 kg/m3 孔段体积，它能够在静压下使淤塞在井壁内的冲洗液中 的魔芋聚糖催化水解为单糖，从而快速恢复岩层的透水性质， 提高洗井质量。此外，利用纤维素酶生产的洗涤剂可作为降硬 剂使用，是一种具有高活性纤维素酶的浓缩洗涤剂组合物，性 能极佳[19]。 4.3 纤维素酶在可降解塑料业中的应用 目前，“白色污染”问题倍受人们的关注，作为解决“白 色污染”问题有效途径之一的可降解塑料的研究自然很受人们 的重视。近年来，利用米根霉发酵生产L-乳酸，但以葡萄糖、 淀粉为原料的生产成本依然较高，这限制了L-乳酸在可降解塑 料方面的应用。玉米中含有丰富的米根霉生长所需的营养因子， 直接利用玉米为原料生产L-乳酸，可以利用这些丰富的营养因 子提高原料的利用率。最近，崔洪斌等[16]成功地以纤维素酶水 解玉米芯得到了L-乳酸，并研究确定了纤维素酶水解玉米芯的 最佳条件：pH=4.5，温度35℃，酶添加量10 µ/g玉米芯，底物浓 度100 g/L，纤维素酶水解玉米芯的葡萄糖收率为27.1%。徐忠 等[17]对大豆秸秆纤维素酶水解条件进行研究，取得了新进展， 加酶量450 µ/g，温度45℃，底物浓度5%，反应时间28 h，酶解 糖得率28.63%。 5 结束语 纤维素物质是一个可再生的资源宝库，对纤维素资源转化 与利用的研究具有广阔的前景和应用价值，其中纤维素酶法降 解纤维素物质是一条经济可行的途径。关于纤维素酶降解纤维 素一直受到欧美、日本等发达国家的高度重视，特别是近年来， 纤维素酶基因克隆技术、固定化酶技术及微生物发酵技术等新 技术的应用，使得在纤维素的生物降解方面取得长足的进展， 工业化应用已日趋成熟。目前，国内在这方面的研究也处于方 兴未艾的阶段，所以通过酶法转化纤维素资源具有深刻的社会 意义。 参考文献 [1]汪维云，朱金华，吴守一．纤维素科学及纤维素酶的研究进展[J]．江苏 理工大学学报，1998，19(3)：20-27． [2]Anu Harkki ．Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with
广东化工 2006年第10期 ·28 www.gdchem.com 第33卷总第162期 novel cellulase profile[J].Enzyme Mirobial Technology,1991,(13):227. [11杜秉海，曲音波，高培基。纤维废渣固态酒精发酵及纤维素一淀粉共发 [3]Stangl H.Characterization of the Trichoderma reesei cbh promoter 酵的研究).食品与发酵工业，1995，(5)：15-20. [J].Current Genetics,1993,(23):115. [12]Mitsuishi Y,Nitisinprasert S.Site directe mutagenesis of the putative [4李大蜻，刘春泉，王振字。纤维素酶及其在天然产物开发中的应用).江 catalytic residue of T [J].FEBS Letters,1990,275(1):135-138. 苏农业科学，2005,6：140-141. [13]Linder M,Mattine ML,Kontteli M,et al.Identification of functionally [5]Park J S,Hitomi J,Beppu T.Identification of two amino acids contributing improtant amino acids in the cellulose binding domain of Trichoderma reesei the high enzyme activity in the alkaline Ph ran alkaline endoglucanase from a cellobiohydrolase I [J].Protein Science,1995,4(6):1056-1064. Bacillus sp [J].Protein Engineering,1993,6:921-926. 14]秦全贵，宋永华，许开绍，等.纤维素酶与造纸工业.广西轻工业， [6]Divne C,Stahlberg J,Teeri T,et al.High-resolution crystal structures 1997,3:12-15. reveal how a cellulose chain is bound in the 50 long tumnel of cellobiohydrolase [15]Lee R.Lynd et al.Fuel Ethanol form Cellulosic Biomass[J].Science,1991, I from Trichoderma reesei[J].Journal Molecular Biology,1998,275:309-325. (1251):1318-1323. 7]Riedel K,Bronnenmeier K.Active-site mutations which change the substrate [16崔洪斌，金滨释，徐涛，等，纤维素酶水解玉米芯的研究).食品与机 specificity of the Clostridium ercorarium stcellulase Celz imp lications for 械，2004,20(3)：9-10. synergism].European Joumal of.biochemistry,1999,262:218-223. [17徐忠，等.大豆秸秆纤维素酶水解条件的研究.食品工业科技，2004， [⑧]农向，伍红，秦天莺，等.纤维素酶的研究进展)，西南民族大学学报（自 25(3):58-59. 然科学版)，2005，（增刊）：29-33 [18]王玉芝.纤维素酶的生产和应用[U.湖北化工，1997，(3)：5657. [9]Reese E T.Polysaccharases and the hydrolysis of insoluble substrates [19列乞永立，歌月霞，任章启.纤维素酶的生产及应用).河北化工，2000， [J].Proceedings of the Session,1976,(6):9-12. (1):25-26. [10陈洪章，李佐虎.影响纤维素酶解的因素和纤维素酶被吸附性能的研究 (本文文献格式：曾傲，叶君.纤维素酶水解及其在能源与环境 [).化学反应工程与工艺，2000,16(1)：30-35. 保护中的应用[J].广东化工，2006,33(10)：25-28.)
广 东 化 工 2006 年 第 10 期 · 28 · www.gdchem.com 第 33 卷 总第 162 期 novel cellulase profile[J]．Enzyme Mirobial Technology，1991，(13)：227． [3]Stangl H ． Characterization of the Trichoderma reesei cbh promoter [J]．Current Genetics，1993，(23)：115． [4]李大婧，刘春泉，王振宇．纤维素酶及其在天然产物开发中的应用[J]．江 苏农业科学，2005，6：140-141． [5]Park J S，Hitomi J，Beppu T．Identification of two amino acids contributing the high enzyme activity in the alkaline Ph ran alkaline endoglucanase from a Bacillus sp [J]．Protein Engineering，1993，6： 921-926． [6]Divne C，Stahlberg J ，Teeri T，et al．High - resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 long tumnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei[J]．Journal Molecular Biology，1998，275： 309-325． [7]Riedel K，Bronnenmeier K．Active - site mutations which change the substrate specificity of the Clostridium ercorarium stcellulase CelZ imp lications for synergism[J]．European Journal of ．biochemistry，1999，262： 218-223． [8]农向，伍红，秦天莺，等．纤维素酶的研究进展[J]．西南民族大学学报(自 然科学版)，2005，(增刊)：29-33 [9]Reese E T．Polysaccharases and the hydrolysis of insoluble substrates [J]．Proceedings of the Session，1976，(6) ：9-12． [10]陈洪章，李佐虎．影响纤维素酶解的因素和纤维素酶被吸附性能的研究 [J]．化学反应工程与工艺，2000，16(1) ：30-35． [11]杜秉海，曲音波，高培基．纤维废渣固态酒精发酵及纤维素－淀粉共发 酵的研究[J]．食品与发酵工业，1995，(5) ：15-20． [12]Mitsuishi Y，Nitisinprasert S．Site directe mutagenesis of the putative catalytic residue of T [J]．FEBS Letters，1990，275(1) ：135-138． [13]Linder M，Mattine M L，Kontteli M，et al．Identification of functionally improtant amino acids in the cellulose binding domain of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I [J]．Protein Science，1995，4 (6) ：1056-1064． [14]秦全贵，宋永华，许开绍，等．纤维素酶与造纸工业[J]．广西轻工业， 1997，3：12-15． [15]Lee R．Lynd et al．Fuel Ethanol form Cellulosic Biomass[J]．Science，1991， (1251)：1318-1323． [16]崔洪斌，金滨铎，徐涛，等．纤维素酶水解玉米芯的研究[J]．食品与机 械，2004，20(3)：9-10． [17]徐忠，等．大豆秸秆纤维素酶水解条件的研究[J]．食品工业科技，2004， 25(3)：58-59． [18]王玉芝．纤维素酶的生产和应用[J]．湖北化工，1997，(3)： 56-57． [19]乞永立，耿月霞，任章启．纤维素酶的生产及应用[J]．河北化工，2000， (1)：25-26． (本文文献格式：曾傲，叶君．纤维素酶水解及其在能源与环境 保护中的应用[J]．广东化工，2006，33(10)：25-28．)