天然产物研究与开发Nat Piod Res Dev2007,19:917924 文章编号：10016880(2007)050917-08 灵芝蛋白类活性成分的研究进展 周选围“林娟2，李奇璋，尹1周2，孙小芬2，唐克轩1 1上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研发中心，上海200030： 2复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室，上海200433 摘要：灵芝蛋白质是除了灵芝多糖和三萜外，另一类重要的活性物质。它不仅是灵芝生命活动的重要物质而 且具有独特免疫原性使其在免疫调节和抗肿瘤病等方面具显著效果。近年来，国内外在灵芝蛋白质的结构特 征和生物活性等研究方面已取得显著的成效。本文综述了灵芝蛋白类活性物质的种类和特征，叙述了相关的 药理功能，探讨了灵芝蛋白质研究的前景和意义。 关键词：灵芝；免疫调节蛋白：凝集素；蛋白多糖：酶：功能： 中图分类号：Q9461;Q949329+7 文献标识码：A Study Progress on Bioactive Protens from Ganodem a spp ZHOU Xuanwei',L N Juan',L IQi-zhang,YN Yi-zhou',SUN Xiao-fen',TANG Ke-xuan' PlantB iotechnology Research Center.School of Agricultre and B iology.ShanghaiJiao Tong University. Shanghai 200030.ChinaState Key Laboratory of Genetic Eng ineering. School of Life Sciences.Fudan University.Shanghai 200433.China Abstract:Ganodema proteins are bioactive components,besides Ganodema polysaccharides and triterpenes They are not only mportant for life activity,but also possess pecial mmunogenicity so that showed imunomodulaory and anti- tumour effects Studies on their structures,characteristics and phamacolgical functions had achieved an enomous pro- gress This paper summarized the kinds and characteristics in Ganodema potein,state its phamacobgical functions,dis- cussed the reground and significance of development and utilization Key words:Ganodem a spp.mmunomodulatory protein;lectin;protein bound polysaccharide;enzyme;functon 灵芝(Ganodema lucidum)属于担子菌纲(Ba~ 生理活性，随着生物技术在药物研究和开发中的应 sidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Gano~ 用，特别是对中草药中基因、蛋白和药理作用之间关 demataceat),是一种珍贵的药用真菌。灵芝的活性 系的逐渐探索，灵芝蛋白质的研究逐渐得到了重视， 成分主要包括灵芝多糖，三萜和蛋白质，另外还有腺 具有广阔的开发前景。 苷、有机酸、生物碱等山：其中多糖最早被确定)、 也是至今研究最多的活性成分，其主要功能是防癌 1灵芝中蛋白质的种类和形式 抗癌1，另一类活性成分是三萜类物质，又名灵芝 灵芝(Ganodem a pp.)中蛋白质有多种类型， 酸，其生理活性较广，包括抗氧化、抗过敏、抗高血 包括真菌免疫调节蛋白(fungal mmunomodulatory 压、保肝、抗单纯疱疹病毒(Henpes Smplex Virus,. protein,FPs)、凝集素(lectin)、糖蛋白(glycop ro HSV)、毒杀癌细胞株等51。在近十多年的研究中， ein)、酶(enzyme)等等。 多糖和三萜两类活性物质研究较多，对蛋白质的研 1.1灵芝免疫调节蛋白 究相对较少，而据有关分析，代料栽培的灵芝中蛋白 11.1灵芝免疫调节蛋白 的含量达1434%161，且灵芝中的蛋白有着明显的 真菌免疫调节蛋白最早从灵芝(G lucidum)中 分离得到，迄今为止从灵芝中分离得到的同类蛋白 收稿日期：200609-25接受日期：2006-11-15 质大约有6种（见表1）。 基金项目：国家自然科学基金项目(30771500)；上海市科学技术 委员会专项基金资助(05DZ05007);上海交通大学 L ing Zhi-8(LZ-8)是从灵芝G lucidum菌丝体中 PRP项目(T15010002) 分离出的一种分子量约为13Da的蛋白质)，其蛋 ·通讯作者Email xuarweizhou(@sjtu edu cn 白质的一级结构和二级结构与免疫球蛋白重链区 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
天然产物研究与开发 N at Prod Res Dev 2007, 19: 9172924 文章编号 : 100126880 (2007) 0520917208 收稿日期 : 2006209225 接受日期 : 2006211215 基金项目 :国家自然科学基金项目 ( 30771500) ;上海市科学技术 委员会专项基金资助 ( 05DZ05007 ) ; 上海交通大学 PRP项目 ( T15010002) 3 通讯作者 E2mail: xuanweizhou@ sjtu. edu. cn 灵芝蛋白类活性成分的研究进展 周选围 13 ,林 娟 2 ,李奇璋 1 ,尹 周 2 ,孙小芬 2 ,唐克轩 1 1上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研发中心 ,上海 200030; 2复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室 ,上海 200433 摘 要 :灵芝蛋白质是除了灵芝多糖和三萜外 ,另一类重要的活性物质。它不仅是灵芝生命活动的重要物质而 且具有独特免疫原性使其在免疫调节和抗肿瘤病等方面具显著效果。近年来 ,国内外在灵芝蛋白质的结构特 征和生物活性等研究方面已取得显著的成效。本文综述了灵芝蛋白类活性物质的种类和特征 ,叙述了相关的 药理功能 ,探讨了灵芝蛋白质研究的前景和意义。 关键词 :灵芝 ;免疫调节蛋白 ;凝集素 ;蛋白多糖 ;酶 ;功能 ; 中图分类号 : Q946. 1; Q949. 329 + 7 文献标识码 : A Study Progress on Bioactive Prote ins from Ganode rm a spp. ZHOU Xuan2wei 13 ,L IN Juan 2 ,L IQ i2zhang 1 , YIN Yi2zhou 2 , SUN Xiao2fen 2 , TANG Ke2xuan 13 1 Plant B iotechnology Research Center, School of Agriculture and B iology, Shanghai J iao Tong University, Shanghai 200030, China; 2 S tate Key Laboratory of Genetic Engineering, School of L ife Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China Abstract: Ganoderma p roteins are bioactive components, besides Ganoderma polysaccharides and triterpenes. They are not only important for life activity, but also possess special immunogenicity so that showed immunomodulatory and anti2 tumour effects. Studies on their structures, characteristics and pharmacological functions had achieved an enormous p ro2 gress. This paper summarized the kinds and characteristics in Ganoderma p rotein, state its pharmacological functions, dis2 cussed the foreground and significance of development and utilization. Key words:Ganoderm a spp. ; immunomodulatory p rotein; lectin; p rotein bound polysaccharide; enzyme; function 灵芝 ( Ganoderm a lucidum )属于担子菌纲 (Ba2 sidiomycetes)多孔菌目 (Polyporales)灵芝科 ( Gano2 dermataceat) ,是一种珍贵的药用真菌。灵芝的活性 成分主要包括灵芝多糖 ,三萜和蛋白质 ,另外还有腺 苷、有机酸、生物碱等 [ 1 ] ;其中多糖最早被确定 [ 2 ]、 也是至今研究最多的活性成分 ,其主要功能是防癌 抗癌 [ 3, 4 ] ;另一类活性成分是三萜类物质 ,又名灵芝 酸 ,其生理活性较广 ,包括抗氧化、抗过敏、抗高血 压、保肝、抗单纯疱疹病毒 (Herpes Simp lex V irus, HSV)、毒杀癌细胞株等 [ 5 ]。在近十多年的研究中 , 多糖和三萜两类活性物质研究较多 ,对蛋白质的研 究相对较少 ,而据有关分析 ,代料栽培的灵芝中蛋白 的含量达 14. 34% [ 6 ] ,且灵芝中的蛋白有着明显的 生理活性 ,随着生物技术在药物研究和开发中的应 用 ,特别是对中草药中基因、蛋白和药理作用之间关 系的逐渐探索 ,灵芝蛋白质的研究逐渐得到了重视 , 具有广阔的开发前景。 1 灵芝中蛋白质的种类和形式 灵芝 ( Ganoderm a spp. )中蛋白质有多种类型 , 包括真菌免疫调节蛋白 ( fungal immunomodulatory p rotein, FIPs)、凝集素 ( lectin )、糖蛋白 ( glycop ro2 tein)、酶 ( enzyme)等等。 1. 1 灵芝免疫调节蛋白 1. 1. 1 灵芝免疫调节蛋白 真菌免疫调节蛋白最早从灵芝 (G. lucidum )中 分离得到 ,迄今为止从灵芝中分离得到的同类蛋白 质大约有 6种 (见表 1)。 L ing Zhi28 (LZ28)是从灵芝 G. lucidum 菌丝体中 分离出的一种分子量约为 13 kDa的蛋白质 [ 8 ] ,其蛋 白质的一级结构和二级结构与免疫球蛋白重链区 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
918 天然产物研究与开发 Vol.19 表1灵芝非糖结合类蛋白的类型及特征 TA-box,一个61bp的内含子。 Table 1 Types and characters of protein free polysaccharides 1.2灵芝中的其它蛋白质 from Ganodema spp. 1.21灵芝凝集素 名称 分子量等电点氨基酸 来源 参考文献 凝集素是一类不同于免疫球蛋白的蛋白质或糖 M Name Ispelectric Am ino (KDa)point acids Sources Ref 蛋白，它能与糖专一地、非共价地可逆结合，并具有 LZ-8 1242 44 110 灵芝(G lucidum) 凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用1。它广 菌丝体 泛存在于动物、植物与微生物中1]，英国各地收集 Fp-gts 3 10松杉灵芝(Ggae) 菌丝体 9 到的403种高等真菌中，约有半数大部分为蘑菇) 灵芝(G lucidum) LZP-1 67 7 都检测到有凝集素的存在，因此可以说它是继真 子实体 菌免疫调节蛋白之后，又一个具有开发前景的蛋白 LZP-2 3 灵芝(G lucidu) 孢子粉 类活性物质。 LZP-3 灵芝(G lucidum) 45.7 7 凝集素是一类可以与特定的糖特异结合的蛋白 孢子粉 灵芝(G hcidum) 质，它广泛存在于植物和大型真菌中，迄今在灵芝中 Ganodem in 15 10 子实体 分离到的凝集素有4种（见表2）。 表2灵芝凝集素的类型及结构特征 variable region of mmunoglobulin heavy chain, Table 2 Types and structural characters of lectin from Ganoder- VH)有极大相似性。LZ-8在生物体内以二聚体的 ma spp 形式存在，分子量约为24kDam。FP-gts(fungal 名称 分子量 等电点 含量 来源 参考文献 mm unomodulatory prote in-gts)是从松杉灵芝G tsug- M Name Isoelectric Content Source Ref (kDa)point ae的菌丝体中分离的与LZ-8有相同氨基酸序列和 GHA 126 97.44 灵芝G.lucidm 相似免疫调节功能的免疫调节蛋白，FP-gts的二 菌丝体 20 级结构中含有7个B折叠，2个ā螺旋和一个B转 CLM 18 4.5 96 灵芝G lucidun 浸出液和菌丝体 21 角)，N端存在一个由10个氨基酸组成的α螺旋结 灵芝G hucidum GLL-F 21 构，a螺旋中有2个氨基酸（△L5/L7)对于保持活 子实体 性至关重要，如果移去△5~7这3个氨基酸，a螺 G capense 18 薄树芝Gcap lectin 日 ense 旋的两亲性特征将被打乱，从而失去活性。这两种 GAL 58 树舌Ganodema 23 蛋白质不仅具有与VH相似的结构，而且具有抑 applanatn 制过敏反应、促进核酸和蛋白质合成、加速代谢的功 能，能够增强机体的免疫力，是一个新的蛋白质家 Ngai&Ng从薄树芝(G capense)中发现的凝集 族-FP2-14] 素，其N端的序列与其它凝集素和真菌免疫调节蛋 1.1.2灵芝免疫调节蛋白基因的研究 白有着微小的相似。其分子量为18Da,带有一个 NCB I(National Center for B iotechnobgy Infor 亚基，不含中性糖，专一糖为D(+)半乳糖和D(+)- mation)相关数据库分析来看，目前灵芝中编码的基 半乳糖胺，125~50 mmol/L FeCk增强凝集活性， 因主要来自赤芝(G hucidu)(GenBank登陆号： NaCl KCL CaCL、MgC、ZnCh对凝集活性无影响， AY449802、AY449803、AY449804、E02372M58032)、紫芝 在100℃60min,pH4~11条件下仍然稳定2。 (G sinense),(GenB ank登陆号：AY449805)和紫芝 张春玉等从树舌(G applanatm)中分离出了一种新 (G japonicum)(GenBank登陆号：AY987805)。Mur 的凝集素GAL(Ganodema applanatm lectin),其分 augi等人usl通过对来自赤芝(Glucidum)的LZ-8 子量为58kDa左右，带有四个亚基，中性糖含量约 基因cDNA的分子克隆发现，LZ-8基因全长520bp, 11.2%,棉籽糖和D松三糖部分抑制其凝血活性： 编码110个氨基酸组成的蛋白质，不同的灵芝种类 热稳定性好，凝血活性不受Ca+、Mg和Zn+等二 编码的灵芝免疫调节蛋白具有非常相似的序列，说 价阳离子的影响。圆二色CD谱显示其含有3.6% 明灵芝免疫调节蛋白具有高度的保守性6。LZ-8 的a螺旋、468%的B转角和496%无规则卷曲， 基因的启动子上游有两个CCAAT-box和一个TA· 不含有B折叠21。 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
表 1 灵芝非糖结合类蛋白的类型及特征 Table 1 Types and characters of p rotein free polysaccharides from Ganoderm a spp. 名称 Name 分子量 M ( kDa) 等电点 Isoelectric point 氨基酸 Amino acids 来源 Sources 参考文献 Ref. LZ28 12. 42 4. 4 110 灵芝 (G. lucidum ) 菌丝体 8 Fip2gts 13 - 110 松杉灵芝 (G. tsugae) 菌丝体 9 LZP21 67 - - 灵芝 (G. lucidum ) 子实体 7 LZP22 43 - - 灵芝 (G. lucidum ) 孢子粉 7 LZP23 45. 7 - - 灵芝 (G. lucidum ) 孢子粉 7 Ganodermin 15 - - 灵芝 (G. lucidum ) 子实体 10 ( variable region of immunoglobulin heavy chain, IgVH)有极大相似性。LZ28在生物体内以二聚体的 形式存在 ,分子量约为 24 kDa [ 11 ]。FIP2gts( fungal immunomodulatory p rotein2gts)是从松杉灵芝 G. tsug2 ae的菌丝体中分离的与 LZ28有相同氨基酸序列和 相似免疫调节功能的免疫调节蛋白 [ 9 ] , FIP2gts的二 级结构中含有 7个 β折叠 , 2个 α螺旋和一个 β转 角 [ 9 ] ,N端存在一个由 10个氨基酸组成的α螺旋结 构 ,α螺旋中有 2个氨基酸 (△L5 / L7) 对于保持活 性至关重要 ,如果移去 △5～7这 3个氨基酸 ,α螺 旋的两亲性特征将被打乱 ,从而失去活性。这两种 蛋白质不仅具有与 IgVH 相似的结构 ,而且具有抑 制过敏反应、促进核酸和蛋白质合成、加速代谢的功 能 ,能够增强机体的免疫力 ,是一个新的蛋白质家 族 2FIP [ 12214 ]。 1. 1. 2 灵芝免疫调节蛋白基因的研究 从 NCB I(National Center for Biotechnology Infor2 mation)相关数据库分析来看 ,目前灵芝中编码的基 因主要来自赤芝 ( G. lucidum ) ( GenBank 登陆号 : AY449802、AY449803、AY449804、E02372、M58032)、紫芝 (G. sinense) ( GenBank登陆号 : AY449805 )和紫芝 (G. japonicum ) ( GenBank登陆号 : AY987805)。Mu2 rasugi等人 [ 15 ]通过对来自赤芝 (G. lucidum )的 LZ28 基因 cDNA的分子克隆发现 ,LZ28基因全长 520 bp, 编码 110个氨基酸组成的蛋白质 ,不同的灵芝种类 编码的灵芝免疫调节蛋白具有非常相似的序列 ,说 明灵芝免疫调节蛋白具有高度的保守性 [ 16 ]。LZ28 基因的启动子上游有两个 CCAAT2box和一个 TA2 TA2box,一个 61 bp的内含子。 1. 2 灵芝中的其它蛋白质 1. 2. 1 灵芝凝集素 凝集素是一类不同于免疫球蛋白的蛋白质或糖 蛋白 ,它能与糖专一地、非共价地可逆结合 ,并具有 凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用 [ 17 ]。它广 泛存在于动物、植物与微生物中 [ 18 ] ,英国各地收集 到的 403种高等真菌中 ,约有半数 (大部分为蘑菇 ) 都检测到有凝集素的存在 [ 19 ] ,因此可以说它是继真 菌免疫调节蛋白之后 ,又一个具有开发前景的蛋白 类活性物质。 凝集素是一类可以与特定的糖特异结合的蛋白 质 ,它广泛存在于植物和大型真菌中 ,迄今在灵芝中 分离到的凝集素有 4种 (见表 2)。 表 2 灵芝凝集素的类型及结构特征 Table 2 Types and structural characters of lectin from Ganoder2 m a spp. 名称 Name 分子量 M ( kDa) 等电点 Isoelectric point 含量 Content 来源 Source 参考文献 Ref. GHA 126 - 97. 44 灵芝 G. lucidum 菌丝体 20 GLL2M 18 4. 5 96 灵芝 G. lucidum 浸出液和菌丝体 21 GLL2F - - - 灵芝 G. lucidum 子实体 21 G. capense lectin 18 - - 薄树芝 G. cap2 ense 22 GAL 58 - - 树舌 Ganoderm a applanatum 23 Ngai & Ng从薄树芝 (G. capense)中发现的凝集 素 ,其 N端的序列与其它凝集素和真菌免疫调节蛋 白有着微小的相似。其分子量为 18 kDa,带有一个 亚基 ,不含中性糖 ,专一糖为 D ( +) 2半乳糖和 D ( +) 2 半乳糖胺 ; 12. 5～50 mmol/L FeCl3 增强凝集活性 , NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2 对凝集活性无影响 , 在 100 ℃ 60 m in , pH 4～11条件下仍然稳定 [ 22 ]。 张春玉等从树舌 (G. applanatum )中分离出了一种新 的凝集素 GAL (Ganoderm a applanatum lectin) ,其分 子量为 58 kDa左右 ,带有四个亚基 ,中性糖含量约 11. 2% ,棉籽糖和 D2松三糖部分抑制其凝血活性 ; 热稳定性好 ,凝血活性不受 Ca 2 + 、Mg 2 +和 Zn 2 +等二 价阳离子的影响。圆二色 CD谱显示其含有 3. 6% 的 α螺旋、46. 8%的 β转角和 49. 6%无规则卷曲 , 不含有 β折叠 [ 23 ]。 819 天然产物研究与开发 Vol119 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
Vol.19 周选围等：灵芝蛋白类活性成分的研究进展 919 1.22灵芝中的糖蛋白、糖肽和酶 Sephadex-25柱层析法将灵芝菌丝体水的提取超滤 1221灵芝糖蛋白 膜过滤物中小肽与游离氨基酸有效地分离，经毛细 糖蛋白是由蛋白质的肽链和糖链通过共价键结 管电泳分析初步认为得到13种肽等3川。 合而形成的复合蛋白质，其中糖与蛋白质之间，以蛋 1222灵芝中酶类成分 白质为主，其一定部位以共价键与若干糖分子链相 除上述活性蛋白以外，灵芝中还有木质素酶 连构成整个分子：糖肽也是一种糖蛋白，一般含有很 (包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及漆酶)和 高比例的多糖。它具有多种生物功能，在免疫系统 纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等其它酶类（见表4）。这 中也有重要作用，特别是在细胞间的免疫识别方面， 些酶在灵芝细胞自身构成和新陈代谢活动中发挥着 主要依赖于糖蛋白的结构。灵芝中的糖蛋白和糖肽 重要作用。 的种类见表3。 表4灵芝中的酶类 表3灵芝部分糖蛋白和糖肽 Table 4 Enzymes from G lucidum Table 3 Part of glycoprotein and peptide-polysaccharides from 名称 来源 参考文献 Ganodem a spp Name Source Ref 名称 蛋白质含量 来源 参考文献 a半乳糖苷酶a-lactosidase 子实体 32 Name Protein content(%） Source Ref 羧基蛋白酶ⅡCarboxyl prote inaseⅡ 培养液 33 CLhw 12.14n38 灵芝G hucidum 24 内切多聚半乳糖醛酸酶和 内切果胶甲基反式消除酶 CLhw0l 294n82 灵芝Ghucidu 24 培养液 34 Endopolyg学lacturonase和endo- w-02 7.80n25 灵芝G lucidum 24 pectin methyl trans-elm inase (hw-03 3.78n18 灵芝G hucidu 24 淀粉酶Amylase 灵芝 34 NPBP 灵芝G lucidim水浸液 25 1,4B-d葡聚糖麦芽糖水解酶 培养液 APBP 7.80 灵芝Gcdm水浸液 25 1,4-B-d-Glucan glucanohydolase CS 灵芝Ghucidum子实体 26 内切多聚半乳糖醛酸酶和 外切多聚半乳糖醛酸酶 灵芝 34 (M3 381 灵芝Ggae菌丝体 27 Endo-and exopolygalacturonase CPA II 30 灵芝G hcidim发酵液 27 34,40 CLSP2 266 灵芝G lucidum子实体 28 纤维素酶Cellulases 培养液，菌丝体 CLSP3 123 灵芝G lucidum子实体 28 锰超氧化物歧化酶 菌丝体 34 41 TOLP-2 89% 灵芝Glucidum 29 Manganese superoxide dismutase TCLP-3 4% 灵芝G lucidum 29 我甲基纤维素 培养液 34 Carboxymethyl cellubse TCLP-6 3.7% 灵芝G lucidum 29 TOLP-7 5.5% 灵芝G hucidum 29 木质素修饰酶 培养液 L ignin modifying enzymes 漆酶同工酶 培养液 在蛋白质的研究中，糖蛋白的研究难度较大且 Laccase isozymes 逐渐成为研究的热点[0。灵芝中糖蛋白的研究主 胰凝乳蛋白酶抑制剂异构体 子实体 Chymotryp sin inhibitors isofoms 要集中在分子量、糖的组成分析、结构、肽的氨基酸 核糖核酸酶 组成及比例等方面2,1。如黎铁立等研究认为， 子实体 ribonuclease TGLP-2分子量为209×10，肽链由甘氨酸 环磷腺苷结合蛋白 菌丝体 Cyclic AMP-binding potein (173%),丝氨酸(125%)，谷氨酸(9.6%)，丙氨 肽基脯氨酰顺反异构酶 酸(92%)，缬氨酸(78%)，天门冬氨酸(72%)， 子实体 Peptidyl polyl cis-trans isomerase,PP lase 苯丙氨酸(62%)，异亮氨酸(61%)，亮氨酸 a葡萄糖苷酶抑制剂SKG3 子实体 39 a-glucosidase inhibitor,SKG-3 (60%),苏氨酸(59%)等14种氨基酸组成，肽的 蛋白酶抑制剂GPA2 含量占总多糖肽的&19%，化学结构为含B-(1→3) 发酵液 42 Pioteinase inhibitor PA2 (1→4)武键的甘露葡聚糖肽。同样，TGP-3和 TGP6分子量、肽部分的氨基酸分析检测结果、化 随着上世纪70年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳 学结构等也进行了详细的报道2)。 和分子克隆等生物学技术的问世，灵芝中酶的研究 此外，Zhang等从灵芝(G lucidum)子实体中分 也掀开了新的一页，从体内功能研究发展到体外分 离出了一种蛋白多糖GSs1。何慧等利用Cu 子性质和功能研究，取得了巨大的进步，主要表现在 e1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
1. 2. 2 灵芝中的糖蛋白、糖肽和酶 1. 2. 2. 1 灵芝糖蛋白 糖蛋白是由蛋白质的肽链和糖链通过共价键结 合而形成的复合蛋白质 ,其中糖与蛋白质之间 ,以蛋 白质为主 ,其一定部位以共价键与若干糖分子链相 连构成整个分子 ;糖肽也是一种糖蛋白 ,一般含有很 高比例的多糖。它具有多种生物功能 ,在免疫系统 中也有重要作用 ,特别是在细胞间的免疫识别方面 , 主要依赖于糖蛋白的结构。灵芝中的糖蛋白和糖肽 的种类见表 3。 表 3 灵芝部分糖蛋白和糖肽 Table 3 Part of glycop rotein and pep tide2polysaccharides from Ganoderm a spp. 名称 Name 蛋白质含量 Protein content ( % ) 来源 Source 参考文献 Ref. GLhw 12. 14 ±0. 38 灵芝 G. lucidum 24 GLhw201 2. 94 ±0. 82 灵芝 G. lucidum 24 GLhw202 7. 80 ±0. 25 灵芝 G. lucidum 24 GLhw203 3. 78 ±0. 18 灵芝 G. lucidum 24 NPBP - 灵芝 G. lucidum 水浸液 25 APBP 7. 80 灵芝 G. lucidum 水浸液 25 GL IS 8 灵芝 G. lucidum 子实体 26 GM3 38. 1 灵芝 G. tsugae菌丝体 27 GLPA I1 30 灵芝 G. lucidum 发酵液 27 GLSP2 26. 6 灵芝 G. lucidum 子实体 28 GLSP3 12. 3 灵芝 G. lucidum 子实体 28 TGLP22 8. 9% 灵芝 G. lucidum 29 TGLP23 4% 灵芝 G. lucidum 29 TGLP26 3. 7% 灵芝 G. lucidum 29 TGLP27 5. 5% 灵芝 G. lucidum 29 在蛋白质的研究中 ,糖蛋白的研究难度较大且 逐渐成为研究的热点 [ 30 ]。灵芝中糖蛋白的研究主 要集中在分子量、糖的组成分析、结构、肽的氨基酸 组成及比例等方面 [ 28, 29 ]。如黎铁立等研究认为 , TGLP22 分 子 量 为 20. 9 ×10 4 , 肽 链 由 甘 氨 酸 (17. 3% ) ,丝氨酸 (12. 5% ) ,谷氨酸 (9. 6% ) ,丙氨 酸 (9. 2% ) ,缬氨酸 (7. 8% ) ,天门冬氨酸 (7. 2% ) , 苯丙氨酸 ( 6. 2% ) , 异亮氨酸 ( 6. 1% ) , 亮氨酸 (6. 0% ) ,苏氨酸 (5. 9% )等 14种氨基酸组成 ,肽的 含量占总多糖肽的 8. 19% ,化学结构为含 β2(1→3) (1→4 ) 甙键的甘露葡聚糖肽。同样 , TGLP23 和 TGLP26分子量、肽部分的氨基酸分析检测结果、化 学结构等也进行了详细的报道 [ 29 ]。 此外 , Zhang等从灵芝 (G. lucidum )子实体中分 离出了一种蛋白多糖 GL IS [ 18 ]。何慧等利用 Cu2 Sephadex225柱层析法将灵芝菌丝体水的提取超滤 膜过滤物中小肽与游离氨基酸有效地分离 ,经毛细 管电泳分析初步认为得到 13种肽等 [ 31 ]。 1. 2. 2. 2 灵芝中酶类成分 除上述活性蛋白以外 ,灵芝中还有木质素酶 (包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及漆酶 )和 纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等其它酶类 (见表 4)。这 些酶在灵芝细胞自身构成和新陈代谢活动中发挥着 重要作用。 表 4 灵芝中的酶类 Table 4 Enzymes from G. lucidum 名 称 Name 来 源 Source 参考文献 Ref. α2半乳糖苷酶 α2galactosidase 子实体 32 羧基蛋白酶 II Carboxyl p roteinase II 培养液 33 内切多聚半乳糖醛酸酶和 内切果胶甲基反式消除酶 Endopolygalacturonase和 endo2 pectin methyl trans2eliminase 培养液 34 淀粉酶 Amylase 灵芝 34 1, 42B2d2葡聚糖 2麦芽糖水解酶 1, 42B2d2Glucan glucanohydrolase 培养液 34 内切多聚半乳糖醛酸酶和 外切多聚半乳糖醛酸酶 Endo2 and exo2polygalacturonase 灵芝 34 纤维素酶 Cellulases 培养液 ,菌丝体 34, 40 锰超氧化物歧化酶 Manganese superoxide dismutase 菌丝体 34, 41 羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose 培养液 34 木质素修饰酶 Lignin2modifying enzymes 培养液 34 漆酶同工酶 Laccase isozymes 培养液 34 胰凝乳蛋白酶抑制剂异构体 Chymotryp sin inhibitors isoforms 子实体 35 核糖核酸酶 ribonuclease 子实体 36 环磷腺苷结合蛋白 Cyclic AMP2binding p rotein 菌丝体 37 肽基脯氨酰顺反异构酶 Pep tidyl p rolyl cis2trans isomerase, PPIase 子实体 38 α2葡萄糖苷酶抑制剂 SKG23 α2glucosidase inhibitor, SKG23 子实体 39 蛋白酶抑制剂 GLPIA2 Proteinase inhibitor GLPIA2 发酵液 42 随着上世纪 70年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳 和分子克隆等生物学技术的问世 ,灵芝中酶的研究 也掀开了新的一页 ,从体内功能研究发展到体外分 子性质和功能研究 ,取得了巨大的进步 ,主要表现在 Vol119 周选围等 :灵芝蛋白类活性成分的研究进展 919 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
920 天然产物研究与开发 Vol.19 三方面：很多不同灵芝种来源的酶得到了纯化并进 的增殖被GPP抑制，呈现一定的剂量关系；而不是 行了理化、生化性质研究9,0,21：部分基因己得到了 因为细胞毒素的关系。根据流式细胞分析表明， 克隆和表达，有些研究者51专门从灵芝属菌株 HUVECs的GkPP处理能够直接引起细胞调亡。另 中筛选了一些高效降解木质素的菌株，为其应用于 外，GPP的增加也会导致HUVECs的Bc-2基因抗 工农业生产奠定了基础。 凋亡蛋白表达的减少和Bax基因前调亡蛋白表达的 增加。因此，Cao等认为GrPP诱导的细胞调亡是 2灵芝蛋白的生物学活性 抑制HUVEC增殖的机理。当人类肺癌PG细胞在 2.1免疫调节作用 缺氧的条件下，在高剂量的GPP下处理18h,血管 生物有机体对侵入体内的各种病原微生物和它 内皮生长因子的分泌量增加。 们所产生的毒素的抵抗作用的总称叫免疫。LZ8 王关林等报道了富硒灵芝可以消除机体的自由 在被分离出的同时，也证明了其免疫调节和促进细 基，增强机体免疫能力，达到防癌、抗癌的多种效 胞有丝分裂的作用81，随后的研究证明，LZ-8可有 果5。何慧等指出灵芝中分离出的多肽在细胞中 效抑制非肥胖糖尿病鼠自体免疫第一型糖尿病的发 是以糖蛋白的形式存在，是一种较强的抗羟基、自由 生【6]并对B型肝炎表面抗原所引起的抗体有明显 基的生物活性物质，有防癌功能3)。李穗阳等报道 的抑制作用a,Haak-Frendscho等学者研究LZ-8的 了灵芝多糖蛋白可以提高机体细胞膜封闭度，增强 免疫调节机制，发现LZ-8具有抑制人类外周血淋巴 机体抗肿瘤机能)。以上实验结果都充分说明，灵 细胞(peripherol blood lymphocytes,.BL)分裂的作 芝多糖蛋白是一种生物大分子的活性物质，具有明 用，而且有类似外源凝集素(lectin)及植物凝血素 显的防癌性能。 (phtohem atoaggluti in,.PHA)等促细胞分裂素之效 2.3抗氧化活性 果。研究结果表明，LZ-8为体细胞的活化因子，经 灵芝中糖类、多糖蛋白复合体和酚类物质都是 由细胞激素如白细胞素2(L2),干扰素a(NF- 灵芝中抗氧化剂的组成成分。最近的研究指出，灵 a),肿瘤坏死因子a(NFa),白细胞素1B(L1- 芝多糖肽在体内、外由于清除巨噬细胞中叔丁基氢 B)等来表现，从而达到调节细胞分裂素(cytokine) 过氧化物(BOOH)产生的自由基，而具有抗氧化作 的效应[4】，Van der Ham也发现LZ-8可以抑制实验 用s]。Sun等人认为，GP(Ganodema lucidum pep~ 鼠同种异体移植的免疫作用，延长存活期49。 tide)是灵芝中主要的抗氧化剂成分s。通过脂过 叶波平等从灵芝(G hucidum)孢子粉中分离 氧化物值(lipid peroxidant value)评估，GP在避光 得到的LZP-1、LZP-2和LZP-3,经体外实验验证，都 的大豆油和猪油中都表现出有效的抗氧化活性。在 有促进小鼠T淋巴细胞增殖的活性：当用量均为50 大豆油体系中，GP表现出比二丁基羟基甲苯(bu~ μgmL时，灵芝孢子粉的LZP-2和LZP-3促进淋巴 ylated hydroxy~toluene,.BHT)更强的抗氧化性。在 细胞增殖率分别高达413%±3.1%和387%± Cso为27.1μgmL下，GP阻滞大豆脂肪氧合酶的 48%,且呈现出一定的剂量依赖效应，而灵芝子实 活性依赖剂量依存方式。在脱氧核糖体系中，C0 体的LZP-1促进淋巴细胞增殖率较低，为182%± 为25μgmL,GLP表现出清除羟自由基活性；通过 3.9%。 邻苯三酚自氧化法测试，GP在依赖剂量依存方式 2.2防癌与抗肿瘤作用 下能有效的清除超氧化物阴离子自由基。另外， 从薄树芝(G capense)中分离的凝集素能有效 GP在小鼠肝细胞匀浆和线粒体膜体系中，也显示 地抑制瘤细胞的增殖，Ngai等人研究发现，该凝集 出很强的抗氧化活性。 素具有抑制白血病细胞株(L1201和M1)以及肝细 游育红等研究灵芝多糖肽(Ganodema polysac- 胞瘤细胞株HpG2增殖的作用；同时该凝集素能促 charide peptid,.GLPP)的抗氧化作用及其机制，结果 进小鼠脾细胞有丝分裂，其活性也高于伴刀豆凝集 GLPP使LDL(ow lipoprotei)氧化修饰减少，氧化产 素(concanavalin a,.ConA)I2。一些多肽，如GPp 物RBM(relative electrophoretic mobilit)降低。GLPp 在小鼠体内表现出一定的抗癌的作用和潜在的抗血 50,100,200和400mg/kgp20d,使血清和心肌匀 管生成能力。据Cao等so的研究，人脐静脉内皮细 浆的丙二醛(mabndialdehyd,MDA)水平下降，谷胱 (human umbilical vein endothelial cells,HUVECs) 甘肽过氧化物酶(GSHpx)升高，超氧化物歧化酶 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
三方面 :很多不同灵芝种来源的酶得到了纯化并进 行了理化、生化性质研究 [ 39, 40, 42 ] ;部分基因已得到了 克隆和表达 [ 43, 44 ]有些研究者 [ 45 ]专门从灵芝属菌株 中筛选了一些高效降解木质素的菌株 ,为其应用于 工农业生产奠定了基础。 2 灵芝蛋白的生物学活性 2. 1 免疫调节作用 生物有机体对侵入体内的各种病原微生物和它 们所产生的毒素的抵抗作用的总称叫免疫。LZ28 在被分离出的同时 ,也证明了其免疫调节和促进细 胞有丝分裂的作用 [ 8 ] ,随后的研究证明 , LZ28可有 效抑制非肥胖糖尿病鼠自体免疫第一型糖尿病的发 生 [ 46 ] ,并对 B型肝炎表面抗原所引起的抗体有明显 的抑制作用 [ 47 ] , Haak2Frendscho等学者研究 LZ28的 免疫调节机制 ,发现 LZ28具有抑制人类外周血淋巴 细胞 ( peripherol blood lymphocytes, PBL )分裂的作 用 ,而且有类似外源凝集素 ( lectin)及植物凝血素 (phtohematoagglutim in, PHA )等促细胞分裂素之效 果。研究结果表明 , LZ28为体细胞的活化因子 ,经 由细胞激素如白细胞素 22 ( IL22) ,干扰素 2α ( INF2 α) ,肿瘤坏死因子 2α ( TNF2α) ,白细胞素 12β ( IL12 β)等来表现 ,从而达到调节细胞分裂素 ( cytokine) 的效应 [ 48 ] ,Van der Ham也发现 LZ28可以抑制实验 鼠同种异体移植的免疫作用 ,延长存活期 [ 49 ]。 叶波平等 [ 7 ]从灵芝 (G. lucidum )孢子粉中分离 得到的 LZP21、LZP22和 LZP23,经体外实验验证 ,都 有促进小鼠 T2淋巴细胞增殖的活性 :当用量均为 50 μg/mL时 ,灵芝孢子粉的 LZP22和 LZP23促进淋巴 细胞增殖率分别高达 41. 3% ±3. 1%和 38. 7% ± 4. 8% ,且呈现出一定的剂量依赖效应 ,而灵芝子实 体的 LZP21促进淋巴细胞增殖率较低 ,为 18. 2% ± 3. 9%。 2. 2 防癌与抗肿瘤作用 从薄树芝 (G. capense)中分离的凝集素能有效 地抑制瘤细胞的增殖 , Ngai等人研究发现 ,该凝集 素具有抑制白血病细胞株 (L1201和 M1)以及肝细 胞瘤细胞株 HepG2增殖的作用 ;同时该凝集素能促 进小鼠脾细胞有丝分裂 ,其活性也高于伴刀豆凝集 素 ( concanavalin a, Con A) [ 22 ]。一些多肽 ,如 Gl2PP 在小鼠体内表现出一定的抗癌的作用和潜在的抗血 管生成能力。据 Cao等 [ 50 ]的研究 ,人脐静脉内皮细 胞 ( human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 的增殖被 Gl2PP抑制 ,呈现一定的剂量关系 ;而不是 因为细胞毒素的关系。根据流式细胞分析表明 , HUVECs的 Gl2PP处理能够直接引起细胞凋亡。另 外 , Gl2PP的增加也会导致 HUVECs的 Bcl22基因抗 凋亡蛋白表达的减少和 Bax基因前凋亡蛋白表达的 增加。因此 , Cao等认为 Gl2PP诱导的细胞凋亡是 抑制 HUVEC增殖的机理。当人类肺癌 PG细胞在 缺氧的条件下 ,在高剂量的 Gl2PP下处理 18 h,血管 内皮生长因子的分泌量增加。 王关林等报道了富硒灵芝可以消除机体的自由 基 ,增强机体免疫能力 ,达到防癌、抗癌的多种效 果 [ 51 ]。何慧等指出灵芝中分离出的多肽在细胞中 是以糖蛋白的形式存在 ,是一种较强的抗羟基、自由 基的生物活性物质 ,有防癌功能 [ 31 ]。李穗阳等报道 了灵芝多糖蛋白可以提高机体细胞膜封闭度 ,增强 机体抗肿瘤机能 [ 52 ]。以上实验结果都充分说明 ,灵 芝多糖蛋白是一种生物大分子的活性物质 ,具有明 显的防癌性能。 2. 3 抗氧化活性 灵芝中糖类、多糖蛋白复合体和酚类物质都是 灵芝中抗氧化剂的组成成分。最近的研究指出 ,灵 芝多糖肽在体内、外由于清除巨噬细胞中叔丁基氢 过氧化物 ( tBOOH)产生的自由基 ,而具有抗氧化作 用 [ 53 ]。Sun等人认为 , GLP( Ganoderma lucidum pep2 tide)是灵芝中主要的抗氧化剂成分 [ 54 ]。通过脂过 氧化物值 ( lip id peroxidant value)评估 , GLP在避光 的大豆油和猪油中都表现出有效的抗氧化活性。在 大豆油体系中 , GLP表现出比二丁基羟基甲苯 ( bu2 tylated hydroxy2toluene,BHT) 更强的抗氧化性。在 IC50为 27. 1μg/mL下 , GLP阻滞大豆脂肪氧合酶的 活性依赖剂量依存方式。在脱氧核糖体系中 , IC50 为 25μg/mL, GLP表现出清除羟自由基活性 ;通过 邻苯三酚自氧化法测试 , GLP在依赖剂量依存方式 下能有效的清除超氧化物阴离子自由基。另外 , GLP在小鼠肝细胞匀浆和线粒体膜体系中 ,也显示 出很强的抗氧化活性。 游育红等研究灵芝多糖肽 ( Ganoderma polysac2 charide pep tid, GLPP)的抗氧化作用及其机制 ,结果 GLPP使 LDL ( low lipop rotei)氧化修饰减少 ,氧化产 物 REM ( relative electrophoretic mobilit)降低。GLPP 50, 100, 200和 400 mg/kg ip20 d,使血清和心肌匀 浆的丙二醛 (malondialdehyd; MDA )水平下降 ,谷胱 甘肽过氧化物酶 ( GSHpx)升高 ,超氧化物歧化酶 029 天然产物研究与开发 Vol119 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
Vol.19 周选围等：灵芝蛋白类活性成分的研究进展 921 (SOD)减少，过氧化氢酶(catalase,CAT)不变s)。 寡聚糖抑制，而被一些糖蛋白抑制，而分离出的另外 因此他们认为，GPP具有体内外抗氧化作用，其抗 一种凝集素GLF诱导的血凝反应会被高浓度的 氧化作用与清除氧自由基或提高GSHpx2水平有关。 葡萄糖胺(glucosamine)和半乳糖胺(galactosam ine) 2.4抗菌、抗病毒活性 抑制2)。何慧等研究发现，灵芝多糖不是抑制 E0等从灵芝中分离出的四种糖结合蛋白-G~ ·OH的活性因子，灵芝蛋白质对抑制·OH的活性 w,Gw-O1,Gw-O2,Ghw-O3,通过体外室斑减少 有一定作用，小分子化合物(M<10000Da)对抑制 测定法分析发现2]：这四种糖结合蛋白对HSV-1 ·OH的作用较大，灵芝肽是抑制·OH的重要活性 (Herpes Smplex V irus type 1,I型疱疹单纯病毒)和 因子，其C0值为25μgmLs91。 HSV-2(Hepes Smplex Virus type2,2型疱疹单纯病 Wang等从灵芝(G lucidum)中得到了一种分子 毒)都表现出抗性活性。其中，在EC0为300~520 量为42kDa的核糖核酸酶，它的N端序列和其他真 μgmL时，多聚糖结合酸性蛋白GhwO2在Veo 菌核糖核酸酶的N端序列有显著的不同6)。研究 和HE印2细胞中表现出最强的抗疱疹病毒的活性， 发现，该核糖核酸酶在pH4,60℃下活性最高。它 另外Ghw-O2的SI(selectivity indices)超过了20。 聚合G(24Umg)和C(25Umg)的活性只有聚 Eo等认为，GhwO2很有可能成为一种新的抗疱疹 合A(49Umg)的一半、聚合U(9.2Umg)的四分 制剂。后来，该研究小组又从灵芝的水浸液中分离 之一。此外，Yang等[6o以小鼠肝脏细胞为材料，研 出的糖结合蛋白NPBP(neutral protein bound poly 究灵芝蛋白多糖对CC肝损伤的疗效，结果表明灵 saccharide,中性糖结合蛋白)和ABP(acidic protein 芝蛋白多糖在体内和体外均能有效地保护CCl对 bound polysaccharide,酸性糖结合蛋白)通过空斑减 老鼠肝细胞LO2的损伤，其可能的抗肝毒素的机制 数实验测定，发现NPBP和ABP对HSV-1和HV- 与抑制NF-a的水平和清除自由基的活动相关。 2都有抗过滤性病原体的活性。在ECso(50%efc- 3 tive concentrations,半数有效浓度)为300520μg/ 研究意义与前景 mL时，对HSV-1和HSV-2的抑制，ABP表现的抗 十多年来对灵芝免疫调节蛋白的研究，促进了 菌活性比NPBP更更有效2sI。 对FP家族的深入研究【)，也给深入研究灵芝中其 Lu等从灵芝菌丝体中分离蛋白多糖GPG,通 它蛋白类活性物质2以有益的启迪，但仍缺少FP 过细胞培养研究了糖蛋白对抗HSV1和HSV-2的 家族的免疫活性机制如信号传导、蛋白质间的相互 效果，结果表明GPG抗滤过性病原体的效果是非 作用等的深入分析，另外，不同的FP家族成员在促 常显著的61；L等进一步研究了灵芝蛋白多糖抗 发免疫响应过程中存在剂量效应，比如在激活人外 HSV的可能机制，虽然详细的作用机理并没有阐 周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocytes, 明，但他们认为灵芝蛋白多糖能抑制过滤性病原体 hBL)增殖实验中，Fp-fve的有效浓度为1O0μg/ 的复制，通过干扰病毒早期进入目标细胞的吸附而 mL1,而Fpo的有效浓度仅为5μgmL,而天 达到抗病毒的目的。因此，灵芝蛋白多糖可以作为 然产物中该蛋白的含量很低[2)，在大肠杆菌表达的 治疗HSV的制剂) 产量也不能达到工业化生产的要求，仅为20mgL 此外，Wang等从灵芝(G lucidum)的子实体中 )。由此可见，提高FP在真菌中的表达以及在原 分离出的抗真菌蛋白Ganode m in在Co(50%mhr 核生物中的表达、寻求新的生物反应器，并进一步研 bition concentration,.半数抑制浓度)为(1520.7) 究该蛋白质家族编码基因的表达调控是今后一段时 μmolL,(124±03)μmol/L和(181±05) 期内利用基因工程手段开发新产品的一种重要手段 μmol/L(mean D,n=3)时，Ganodem in对番茄 和今后发展的必然趋势。 灰霉病菌(B.cinerea),,尖孢镰刀菌(F oxysponm) 对灵芝活性蛋白的研究，也有利于进一步开发 和苹果轮纹病菌(P.piricola)分别表现抗真菌的活 和利用灵芝中的小分子活性物质。虽然灵芝多糖大 性I58) 多具有B-1,3葡聚糖主链及1,6葡聚糖支链结构 2.5其它生物学活性 但分子量从数万到数百万不等；有些是纯粹的葡聚 Kawagish等从赤芝(G lucidu)中分离出的凝 糖，有些则为糖蛋白，且糖基化程度不同，其生理效 集素GLM诱导的血凝反应没有被任何单糖或是 果各异B,61,621。在利用基因工程手段研究其表达 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net
(SOD)减少 ,过氧化氢酶 ( catalase, CAT)不变 [ 55 ]。 因此他们认为 , GLPP具有体内外抗氧化作用 ,其抗 氧化作用与清除氧自由基或提高 GSHpx水平有关。 2. 4 抗菌、抗病毒活性 Eo等从灵芝中分离出的四种糖结合蛋白 2GL2 hw, GLhw201, GLhw202, GLhw203,通过体外室斑减少 测定法分析发现 [ 24 ] :这四种糖结合蛋白对 HSV21 (Herpes Simp lex V irus type 1, 1型疱疹单纯病毒 )和 HSV22 (Herpes Simp lex V irus type 2, 2型疱疹单纯病 毒 )都表现出抗性活性。其中 ,在 EC50为 300～520 μg/mL时 ,多聚糖结合酸性蛋白 GLhw202 在 Vero 和 HEp22细胞中表现出最强的抗疱疹病毒的活性 ; 另外 GLhw202的 SI( selectivity indices)超过了 20。 Eo等认为 , GLhw202很有可能成为一种新的抗疱疹 制剂。后来 ,该研究小组又从灵芝的水浸液中分离 出的糖结合蛋白 NPBP ( neutral p rotein bound poly2 saccharide,中性糖结合蛋白 )和 APBP( acidic p rotein bound polysaccharide,酸性糖结合蛋白 )通过空斑减 数实验测定 ,发现 NPBP和 APBP对 HSV21和 HSV2 2都有抗过滤性病原体的活性。在 EC50 (50% effec2 tive concentrations,半数有效浓度 )为 300～520μg/ mL时 ,对 HSV21和 HSV22的抑制 , APBP表现的抗 菌活性比 NPBP更更有效 [ 25 ]。 L iu等从灵芝菌丝体中分离蛋白多糖 GLPG,通 过细胞培养研究了糖蛋白对抗 HSV21和 HSV22的 效果 ,结果表明 GLPG抗滤过性病原体的效果是非 常显著的 [ 56 ] ; Li等进一步研究了灵芝蛋白多糖抗 HSV的可能机制 ,虽然详细的作用机理并没有阐 明 ,但他们认为灵芝蛋白多糖能抑制过滤性病原体 的复制 ,通过干扰病毒早期进入目标细胞的吸附而 达到抗病毒的目的。因此 ,灵芝蛋白多糖可以作为 治疗 HSV的制剂 [ 57 ]。 此外 ,W ang等从灵芝 (G. lucidum )的子实体中 分离出的抗真菌蛋白 Ganoderm in在 IC50 (50% inhi2 bition concentration,半数抑制浓度 )为 (15. 2 ±0. 7) μmol/L, ( 12. 4 ±0. 3 ) μmol/L 和 ( 18. 1 ±0. 5 ) μmol/L (mean ±SD, n = 3)时 , Ganoderm in对番茄 灰霉病菌 (B. cinerea) ,尖孢镰刀菌 ( F. oxysporum ) 和苹果轮纹病菌 ( P. piricola)分别表现抗真菌的活 性 [ 58 ]。 2. 5 其它生物学活性 Kawagishi等从赤芝 (G. lucidum )中分离出的凝 集素 GLL2M诱导的血凝反应没有被任何单糖或是 寡聚糖抑制 ,而被一些糖蛋白抑制 ,而分离出的另外 一种凝集素 GLL2F诱导的血凝反应会被高浓度的 葡萄糖胺 ( glucosarnine)和半乳糖胺 ( galactosam ine) 抑制 [ 21 ]。何慧等研究发现 , 灵芝多糖不是抑制 ·OH 的活性因子 ,灵芝蛋白质对抑制 ·OH 的活性 有一定作用 ,小分子化合物 (M < 10000 Da)对抑制 ·OH的作用较大 ,灵芝肽是抑制 ·OH 的重要活性 因子 ,其 IC50值为 25μg/mL [ 59 ]。 Wang等从灵芝 (G. lucidum )中得到了一种分子 量为 42 kDa的核糖核酸酶 ,它的 N端序列和其他真 菌核糖核酸酶的 N端序列有显著的不同 [ 36 ]。研究 发现 ,该核糖核酸酶在 pH 4, 60 ℃下活性最高。它 聚合 G(2. 4 U /mg)和 C ( 2. 5 U /mg)的活性只有聚 合 A (4. 9 U /mg)的一半、聚合 U (9. 2 U /mg)的四分 之一。此外 , Yang等 [ 60 ]以小鼠肝脏细胞为材料 ,研 究灵芝蛋白多糖对 CCl4 肝损伤的疗效 ,结果表明灵 芝蛋白多糖在体内和体外均能有效地保护 CCl4 对 老鼠肝细胞 L202的损伤 ,其可能的抗肝毒素的机制 与抑制 TNF2α的水平和清除自由基的活动相关。 3 研究意义与前景 十多年来对灵芝免疫调节蛋白的研究 ,促进了 对 FIP家族的深入研究 [ 12 ] ,也给深入研究灵芝中其 它蛋白类活性物质 [ 21 ]以有益的启迪 ,但仍缺少 FIP 家族的免疫活性机制如信号传导、蛋白质间的相互 作用等的深入分析 ;另外 ,不同的 FIP家族成员在促 发免疫响应过程中存在剂量效应 ,比如在激活人外 周血淋巴细胞 ( human peripheral blood lymphocytes, hPBL) 增殖实验中 , Fip2fve 的有效浓度为 100μg/ mL [ 12 ] ,而 Fip2vvo的有效浓度仅为 5μg/mL [ 8 ] ,而天 然产物中该蛋白的含量很低 [ 29 ] ,在大肠杆菌表达的 产量也不能达到工业化生产的要求 ,仅为 20 mg/L [ 9 ]。由此可见 ,提高 FIP在真菌中的表达以及在原 核生物中的表达、寻求新的生物反应器 ,并进一步研 究该蛋白质家族编码基因的表达调控是今后一段时 期内利用基因工程手段开发新产品的一种重要手段 和今后发展的必然趋势。 对灵芝活性蛋白的研究 ,也有利于进一步开发 和利用灵芝中的小分子活性物质。虽然灵芝多糖大 多具有 β21, 32葡聚糖主链及 1, 62葡聚糖支链结构 , 但分子量从数万到数百万不等 ;有些是纯粹的葡聚 糖 ,有些则为糖蛋白 ,且糖基化程度不同 ,其生理效 果各异 [ 3, 61, 62 ]。在利用基因工程手段研究其表达 Vol119 周选围等 :灵芝蛋白类活性成分的研究进展 129 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
922 天然产物研究与开发 Vol.19 时，需要了解其合成途径中各种重要的酶类；以糖蛋 tube-cultivated Ganodema hucidim II nutritional compo- 白为例，目前其合成从理论上讲可以在体内(mr nents spore colypep tides fat components Stait Pham J( o或体外(in vitro进行，常见的在体内合成糖蛋白 峡药学)，2005,17：8890 的宿主有酿酒酵母(Sacchrmyees pam bee)Is/、毕赤 7YeBP叶波平)，W ang QH任庆华)，Zhou S(倜书进)， 酵母(Pichia pastoris)I61或面包酵母(Saccharmyces et al Isolating of proteins fiom Lingzhi and study on its m- cerevisiae))Is1等，但其合成糖基的大小及糖基的构型 mune activity Pham B iotech(药物生物技术)，2002,9： 150-152 形式往往不能达到预期的目的。若体外合成糖蛋 8 Kino K,Yamashita A,Yamaoka K,et al Isolation and char 白，需要在多个酶的作用下通过反应进行，十分不经 acterizaton of a new mmunomodulabory protein,ling zhi-8 济，而糖基的大小及构型也是一个难题。因此，若以 (LZ-8),from Ganodem a lucidi J B iol Chen,1989,264: 代谢工程的方式提高代谢物产量，必须首先选择相 472-478 关酶的基因进行研究，并研究其蛋白的结构、功能和 9 L in WH,Huang CH,Hsu CL et al Dmerization of the N-ter 特性，经蛋白工程的方式改造或研究其代谢途径中 m inal amphpathic abha-helix domain of the fungal mmuno- 的关键酶，针对这个关键酶的调控如转录或翻译作 modulatory protein from Ganodema tsugae(Fip-gts)defined 增强或抑制，可采取直接改动基因上游相关DNA序 by a yeast to-hybrid system and site-directed mutagenesis/ 列或导入抑制子相关基因或反义调控片断等方法进 Bio1Cham,1997,272:20044-20048 行。 10 Wang HX,Ng TB.Ganodem in,an antifungal protein firom fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganodem a lucid- 随着生物技术的迅猛发展，利用基因工程菌株 m.Peptides,2006,27:27-30 的培养获得大量的重组免疫调节蛋白，将成为人类 11 Tanaka S,Ko K,Kino K,et al Complete am ino acid se- 开发和利用灵芝的一个新方向，该领域的研究和探 quence of an mmunomodulatory protein,Ling Zhi-8 (LZ- 索将有效推动利用食药用菌资源，探索生产提高人 8).An mmunomodulatory from a fungus,Ganodema luc id- 体免疫能力的功能食品和新型免疫蛋白药物，其中 um having smilarity to mmunoglobulin variable regons 免疫调节蛋白直接在食品级宿主中的表达，将更加 B iol Chen,1989,264:16372-16377. 受到关注，灵芝免疫调节蛋白的研究具有更广阔的 12 Ko JL,Hsu CLL in RH,et al A new fungal imunomodula- 的开发空间和更大的挖掘潜力。 ory protein,FIP-fve isolated fiom the edible mushoom, Flamm ulina veltipes and its complete am ino acid sequence 参考文献 Eur J B iochen FEBS,1995,228:244-249 1 Zjaw iony JK Biolgically active compounds fiom Aphyllopho 13LnZP(林忠平)，BaiJY(白杰英)，LiYF李彦舫).Stuc- rales (polypore)fungi J Nat Prod,2004,67:300-310,re- ture and functon study of fungal mmunomodulatory protein view (FP).J L iaoning Nomal Univ,Nat Sci辽宁师范大学学 2 Sasaki T,A rai Y,Ikekawa T,et al Antitumer polysaccharides 报，自科版)，2006,29：83-87. from some polyporaceae,Ganodem a aplanatm and Phelli 14LinW(林景卫)，SunF(孙非)，Zhang R(张韧)，etal nus linteus Aoshina Chen Pham Bull(Tokyo).1971.19: The research advance on the fungal mmunomodulatory pro- 821-826 tem(FP).Chin J mm unol(中国免疫学杂志)，2005,21： 3 Wang G,Zhang J,M izuno T,et al Antitumor active polysac- 477-480 charides fiom the Chinese mushroom Song Shan Lingzhi,the 15 MurasugiA,Tanaka S,Kom iyama N,et al Molecular cbning fruiting body of Ganodema tsugae B iosci B iotech B iochen, of a cNA and a gene encoding an mmunomodulatory pro- 1993.57:894900 tein,L ing Zhi-8,from a fungus,Ganodem a lucidum J B iol 4 Yuen N,Gohel MD.Anticancer effects of Ganodema lucid- Cham,1991,266:2486-2493 i:A review of scientific evidence Nutr Cancer,2005,53: 16LiuY(柳永)，Guo LQ(郭丽琼)，Wang HY(任海燕)，et 11-17 al Isolation and sequence analysis of mmunomodulaory po- 5LuoJ罗俊)，LinB(林志彬).Advances of phamacobgi- tein gene fiom Ganodema Chin J Trop Crop(热带作物学 cal effects of triterpenes fiom Ganodem a lucidin.Acta 报)，2006.27：54-58 Pham Sin药学学报)，2002,37：574-578 17 Barondes SH Bifunctional properties of lectins lectins rede- 6 Lin SQ(林树钱)，W ang SZ任赛贞)，LiuB(刘斌)，e1al fined Trends B iochan Sci,1988,13:480-882 Studies on chem ical components of wood bg cultivated and 18 Kennedy JF,Palva PMG,Corella MTS,et al Lectins,versa- 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved http://www.cnki.net
时 ,需要了解其合成途径中各种重要的酶类 ;以糖蛋 白为例 ,目前其合成从理论上讲可以在体内 ( in vi2 vo)或体外 ( in vitro)进行 ,常见的在体内合成糖蛋白 的宿主有酿酒酵母 ( S acchrom yces pom bee) [ 63 ]、毕赤 酵母 ( Pichia pastoris) [ 64 ]或面包酵母 (Saccharom yces cerevisiae) [ 65 ]等 ,但其合成糖基的大小及糖基的构型 形式往往不能达到预期的目的。若体外合成糖蛋 白 ,需要在多个酶的作用下通过反应进行 ,十分不经 济 ,而糖基的大小及构型也是一个难题。因此 ,若以 代谢工程的方式提高代谢物产量 ,必须首先选择相 关酶的基因进行研究 ,并研究其蛋白的结构、功能和 特性 ,经蛋白工程的方式改造或研究其代谢途径中 的关键酶 ,针对这个关键酶的调控如转录或翻译作 增强或抑制 ,可采取直接改动基因上游相关 DNA序 列或导入抑制子相关基因或反义调控片断等方法进 行。 随着生物技术的迅猛发展 ,利用基因工程菌株 的培养获得大量的重组免疫调节蛋白 ,将成为人类 开发和利用灵芝的一个新方向 ,该领域的研究和探 索将有效推动利用食药用菌资源 ,探索生产提高人 体免疫能力的功能食品和新型免疫蛋白药物 ,其中 免疫调节蛋白直接在食品级宿主中的表达 ,将更加 受到关注 ,灵芝免疫调节蛋白的研究具有更广阔的 的开发空间和更大的挖掘潜力。 参考文献 1 Zjawiony JK. Biologically active compounds from Aphy llopho2 rales (polypore) fungi. J N at Prod, 2004, 67: 3002310, re2 view. 2 Sasaki T,A rai Y, Ikekawa T, et al. Antitumer polysaccharides from some polyporaceae, Ganoderm a aplanatum and Phelli2 nus linteus. Aoshim a Chem Pharm B ull ( Tokyo) , 1971, 19: 8212826. 3 W ang G, Zhang J,M izuno T, et al. Antitumor active polysac2 charides from the Chinese mushroom Song Shan L ingzhi, the fruiting body of Ganoderm a tsugae. B iosci B iotech B iochem , 1993, 57: 8942900. 4 Yuen JW , GohelMD. Anticancer effects of Ganoderm a lucid2 um : A review of scientific evidence. N utr Cancer, 2005, 53: 11217. 5 Luo J (罗俊 ) ,L in ZB (林志彬 ). Advances of pharmacologi2 cal effects of triterpenes from Ganoderm a lucidum. Acta Pharm S in (药学学报 ) , 2002, 37: 5742578. 6 L in SQ (林树钱 ) ,W ang SZ(王赛贞 ) ,L iu B (刘斌 ) , et al. Studies on chem ical components of wood log cultivated and tube2cultivated Ganoderm a lucidum Ⅱ nutritional compo2 nents spore colypep tides fat components. S trait Pharm J (海 峡药学 ) , 2005, 17: 88290. 7 Ye BP (叶波平 ) ,W ang QH (王庆华 ) , Zhou SJ (周书进 ) , et al. Isolating of p roteins from L ingzhi and study on its im2 mune activity. Pharm B iotech (药物生物技术 ) , 2002, 9: 1502152. 8 Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, et al. Isolation and char2 acterization of a new immunomodulatory p rotein, ling zhi28 (LZ28) , from Ganoderm a lucidiu. J B iol Chem , 1989, 264: 4722478. 9 L in WH, Huang CH, H su CI, et al. D imerization of the N2ter2 minal amphipathic alpha2helix domain of the fungal immuno2 modulatory p rotein from Ganoderm a tsugae ( Fip2gts) defined by a yeast two2hybrid system and site2directed mutagenesis. J B iol Chem , 1997, 272: 20044220048. 10 W ang HX, Ng TB. Ganodermin, an antifungal p rotein from fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganoderm a lucid2 um. Peptides, 2006, 27: 27230. 11 Tanaka S, Ko K, Kino K, et al. Comp lete am ino acid se2 quence of an immunomodulatory p rotein, L ing Zhi28 (LZ2 8). An immunomodulatory from a fungus, Ganoderm a lucid2 um having sim ilarity to immunoglobulin variable regions. J B iol Chem , 1989, 264: 16372216377. 12 Ko JL, Hsu CI,L in RH, et al. A new fungal immunomodula2 tory p rotein, F IP2fve isolated from the edible mushroom, Flamm ulina veltipes and its comp lete amino acid sequence. Eur J B iochem / FEBS , 1995, 228: 2442249. 13 L in ZP (林忠平 ) ,Bai JY(白杰英 ) ,L i YF (李彦舫 ). Struc2 ture and function study of fungal immunomodulatory p rotein ( F IP). J L iaoning N orm al Univ, N at Sci (辽宁师范大学学 报 ,自科版 ) , 2006, 29: 83287. 14 L in JW (林景卫 ) , Sun F (孙非 ) , Zhang R (张韧 ) , et al. The research advance on the fungal immunomodulatory p ro2 tein ( F IP). Chin J Imm unol (中国免疫学杂志 ) , 2005, 21: 4772480. 15 Murasugi A, Tanaka S, Kom iyama N, et al. Molecular cloning of a cDNA and a gene encoding an immunomodulatory p ro2 tein,L ing Zhi28, from a fungus, Ganoderm a lucidurn. J B iol Chem , 1991, 266: 248622493. 16 L iu Y(柳永 ) , Guo LQ (郭丽琼 ) ,W ang HY (王海燕 ) , et al. Isolation and sequence analysis of immunomodulatory p ro2 tein gene from Ganoderm a. Chin J Trop Crop (热带作物学 报 ) , 2006, 27: 54258. 17 Barondes SH. Bifunctional p roperties of lectins: lectins rede2 fined. Trends B iochem Sci, 1988, 13: 4802882. 18 Kennedy JF, Palva PMG, Corella MTS, et al. Lectins, versa2 229 天然产物研究与开发 Vol119 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
Vol.19 周选围等：灵芝蛋白类活性成分的研究进展 923 tile poteins of recognition:a review.Carbohyd Polm,1995, dema lucidum Food Sci(食品科学)，2001,21：5657. 26:219-230 32 Srpuan T,Aoki K,Yamamo K,et al Purification and char 19 Penberton RT Agglutinins lectins)from some British high- acterization of themostable alpha-galactosidase fiom Gano- er fungi Mycol Res,1994,98:277-290 dema lucidum.B iosci B iotech B iochen,2003.67:1485- 20 Peng YF,Zhang LN.Characterization of a polysaccharide 3 1491. protein complex fiom Ganodem a tsugae mycelium by stze- 33 Terashita T,Oda K,Kono M,et al Streptomyces pepsin in- exclusion chromatography combined with laser light scatter- hibitor-insensitive carboxyl proteinase fiom Ganodem a lucid- inG J B iochen B iophys Methods,2003,56:243-252 im.Agric B iol Chen,1984,48:1029-1035 21 Kawagishi H.Mrrsunaga S,YamawakiM,et al A lectin om 34 Huie CW,DiX Chromatographic and electrophoretic meth- mycelia of the fungus Ganodem a lucidum.Photochen istry, ods orL ingzhiphamacolgically active componentsJ Chro 1997.44:7-10 m atogr B,2004,812:241-257. 22 Ngai PH,Ng TB.A mushroom (Ganodema capense)lectin 35 Li JLBae BN,Jhun BS,et al A siple preparative polyac- with pectacular themostability,potent miogenic activity on rylam ide gel electrophoresis for the purification of chymotryp- sp lenocytes,and antproliferative activity toward tumor cells sin inhibipr isofoms from Ganodem a lucidum.Bull Korean B iochen B ioph Res Co,2004,314:988-993. Chen Soc,2003,24:1531-1534 23 Zhang CY张春玉)，Huang GH(黄国辉)，LnW(林景 36 Wang HX,Ng TB,Chiu SW.A distinctive ribonuclease fiom )et al Purrification and characterization of a novel lectin fresh fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganodema from the medicinal fungus Ganodem a applananm in Chang lucidum.B iochen B iophys Res Camm un,2004,314:519- baiMountain Chin B iotech(中国生物工程杂志)，2005， 522 25:84-88 37 WangQ,Km JS,Chung KC Purification and characterization 24 Eo SK,Km YS,Lee CK,et al Antiherpetic activities of vari- of cyclic AMP-binding protein from Ganodema lucidun. ous protein bound polysaccharides isolated from Ganodem a Chen Res Chin Univ,2004,20:588-593 lucidum.J Ethnopham acol,1999,68:175-181. 38 L m JL Jeong KC,Kang IS,et al A new cyclphilin Inhibitor 25 Eo SK,Km YS,Lee CK,et al Possible mode of antiviral ac- from Ganodem a lucidim:purification and characterization tivity of acidic protein bound polysaccharide isolated from Bull Korean Chen Soc,2004,25:1055-1060 Ganodem a lucidum on hempes smplex viruses J Ethnophar 39 Km SD,Nho HJ.Isolation and characterization ofa -glucosi- macol,2000,72:475-481. dase inhibior from the fungus Ganodem a lucidum.J Micn- 26 Zhang JS,Tang QJ,Zmmeman-Kordmann M,et al Activa- b0l2004.42:223-227. tion of B lymphocytes by G IS,a biactive proteoglycan from 40 Duan MX(段明星)，huT(朱涛)，XuWL(徐文联)，et Ganodem a lucidu.L ife Sci,2002,71:623-638 al Purification and characterization of carboxymethyl cellu- 27 Tian YP,Zhang KC Purification and characterization of a no- bose ((MCase)produced by Ganodem a lucidu.J Tsinghua vel proteinase A inhibitor from Ganodem a lucidim by sub- Univ.Sci&Tech清华大学学报，自科版)，1998,38：56- merged fementation Enzme Microb Tech,2005,36:357- 58 361 41 GuoJC郭建春)，W ang YG任字光)，HuxW(胡新文). 28HeYQ(何云庆)，LiRZ(李荣芷)，CaiW(蔡廷威)，et Superoxide disnutase in mycelia of some edible and medici- al Chem ical studies on peptide-polysaccharides of Lingzhi nal fungi Chin J Trop Crop(热带作物学报)，1995,16：79- (Ganodema lucidum).Chin Tradit Herb Dngs(中草药)， 82 1994.25:395-397. 42 Tian YP(田亚平)，Zhang KC(章克昌).Purification and 29LiL黎铁立)，HeYO(何云庆).LiRZ(李荣芷).Cham characteristic of p roteinase inhibitor GPA from Ganodema cal studies on eptide-po lysaccharides of Ganodem a lucidu lucidum by submerged fementation Chin J Chrom atogr Taishan Chin J Chin MatMed(中国中药杂志)，1997,22： 谱)，2005,23：267-269 487-489 43 D'souza TM,Boom inathan K,Reddy CA.Isolation of laccase 30 Zhang LH张礼和).The chem istry research opportunity in gene-specific sequences from white rot and brown rot fungi life science advanced Uniy Chen(大学化学)，200l,16: by PCR.Appl Environ M icrob,1996,62:3739-3744 13-17 44 Varela E,Martinez AT,Martinez MJ.Southem bbt screening 31HeH(何慧)，SunJ孙颉)，XieBJ(谢笔钧).Study on iso- for lignin peroxidase and aryl-alcohol oxidase genes in 30 lation and component of biological active peptides fiom Gano- fungal species J B iotech,2000,83:245-251 C 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.hitp://ww.cnki.net
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