术可显著促进特定酶的活性 在种间耦合反应系统中,通常都采用E.coh作为合成酶活性的受体菌,因为E.cob可 满足大多数重组DNA技术的应用要求。以下举例说明采用重组DNA技术构建的大肠杆菌 和具有较强AP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP生产过程 日本有学者将编码GMP合成酶(或称XMP胺化酶)的基因从E.col中克隆出,再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与ⅹMP的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合,再加入反应所必需的组分,如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂,以转 化XMP为GMP。由于GMP合成酶活性较高,故转化反应用细胞的培养液体积可减少,这 样,反应开始时ⅹMP的浓度相对较高,反应结東后的GMP浓度也较高,从而提高了生产 3、IMP(5-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)+ATP→IMP+ADP 采用种间耦合系统生产IMP的思路与GMP生产类似。Mon从E.co中克隆出编码鸟 苷一肌苷激酶(负责IMP合成)的基因,并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体,产氨短杆菌为ATP再生活性细胞,加入具有较强肌苷一鸟苷 激酶活性的E.co培养液,IMP可大量积累。这一过程的优点亦与GMP生产过程类似 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱十AIP→磷酸胆碱+AD CIP十磷酸胆碱→CDP胆碱 CDP胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成CIP的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统,普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累CTP是很困难的。日本学 者发现,产氨短杆菌只能转化乳清酸为UTP而非CTP,使用E.col中负责CTP合成的酶可 解决这一问题,使CTP大量积累。但细菌不具有CDP胆碱生物合成系统,为此,他们克隆 了酵母的CDP胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因,并使 之在E.co中高效表达。具体操作是,先将来自酵母的CD胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因,再和来自E.coh的CTP合成酶基因一起插入质粒。这样, 携带重组质粒的E.coh细胞内便具有了三种酶的活性。将重组E.cob和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行CDP胆碱的生产。当然,还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中CDP胆碱浓度达到11.7g/L,比起用胞苷和CMP作为前体的传统方法,成本显著下降。 5、GSH的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和E.coh的自耦合ATP再生系统均可生产GSH。前 者的ATP再生能力虽然较强,但GSH合成活性不高:而后者利用乙酸激酶反应再生ATP, 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。 Murata利用S. cerevisiae和E.coli,构建了一个生产GSH的 种间耦合系统,其中S. cerevisiae作为提供AIP的酶源。这一系统可以有两种形式,即共固 定化系统(S. cerevisiae和E.col细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae和E.co分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使ATP能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中,必须加入腺嘌呤。实验结果表明,混 合固定化系统的GSH产量略低于共固定化系统,可能是在分别固定化的S. cerevisiae和E9 术可显著促进特定酶的活性。 在种间耦合反应系统中，通常都采用 E. coli 作为合成酶活性的受体菌，因为 E. coli 可 满足大多数重组 DNA 技术的应用要求。以下举例说明采用重组 DNA 技术构建的大肠杆菌 和具有较强 ATP 生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP 生产过程 日本有学者将编码 GMP 合成酶(或称 XMP 胺化酶)的基因从 E. coli 中克隆出，再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与 XMP 的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合，再加入反应所必需的组分，如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂，以转 化 XMP 为 GMP。由于 GMP 合成酶活性较高，故转化反应用细胞的培养液体积可减少，这 样，反应开始时 XMP 的浓度相对较高，反应结束后的 GMP 浓度也较高，从而提高了生产 率。 3、IMP(5'-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP 采用种间耦合系统生产 IMP 的思路与 GMP 生产类似。Mori 从 E. coli 中克隆出编码鸟 苷─肌苷激酶(负责 IMP 合成)的基因，并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体，产氨短杆菌为 ATP 再生活性细胞，加入具有较强肌苷─鸟苷 激酶活性的 E. coli 培养液，IMP 可大量积累。这一过程的优点亦与 GMP 生产过程类似。 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱＋ATP→磷酸胆碱＋ADP CTP＋磷酸胆碱→CDP 胆碱 CDP 胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成 CTP 的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统，普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累 CTP 是很困难的。日本学 者发现，产氨短杆菌只能转化乳清酸为 UTP 而非 CTP，使用 E. coli 中负责 CTP 合成的酶可 解决这一问题，使 CTP 大量积累。但细菌不具有 CDP 胆碱生物合成系统，为此，他们克隆 了酵母的 CDP 胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因，并使 之在 E. coli 中高效表达。具体操作是，先将来自酵母的 CDP 胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因，再和来自 E. coli 的 CTP 合成酶基因一起插入质粒。这样， 携带重组质粒的 E. coli 细胞内便具有了三种酶的活性。将重组 E. coli 和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行 CDP 胆碱的生产。当然，还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中 CDP 胆碱浓度达到 11.7g/L，比起用胞苷和 CMP 作为前体的传统方法，成本显著下降。 5、GSH 的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和 E. coli 的自耦合 ATP 再生系统均可生产 GSH。前 者的 ATP 再生能力虽然较强，但 GSH 合成活性不高；而后者利用乙酸激酶反应再生 ATP， 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。Murata 利用 S. cerevisiae 和 E. coli，构建了一个生产 GSH 的 种间耦合系统，其中 S. cerevisiae 作为提供 ATP 的酶源。这一系统可以有两种形式，即共固 定化系统(S. cerevisiae 和 E. coli 细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae 和 E. coli 分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使 ATP 能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中，必须加入腺嘌呤。实验结果表明，混 合固定化系统的 GSH 产量略低于共固定化系统，可能是在分别固定化的 S. cerevisiae 和 E