第三章生物反应过程的系统优化技术 第一节系统优化技术概述 、系统的定义 系统的形态 、系统的特征 四、系统优化方法的基本原则 第二节ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 、AIP再生系统 ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 三、生物合成谷胱甘肽种间耦合AIP再生系统的构建 16 第三节有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统 研究背景 、实验装置 三、有机废水生产PHAs的初步研究 四、R. eumorphus利用不同有机酸生产PHAs的比较研究 五、有机废水生产PHAs的机理研究 有机废水厌氧酸化最佳工艺条件的探索 七、PHAs分批发酵 八、以有机废水酸化产物为底物进行PHAs流加发酵 第四节生物反应与产物分离的组合系统 随程溶剂萃取 、渗透萃取 、渗透蒸发 四、其它生物反应与产物分离技术 五、生物反应与产物分离组合系统的发展趋势
1 第三章 生物反应过程的系统优化技术.......................................................................... 2 第一节 系统优化技术概述....................................................................................... 2 一、系统的定义................................................................................................. 2 二、系统的形态................................................................................................. 2 三、系统的特征................................................................................................. 3 四、系统优化方法的基本原则............................................................................ 4 第二节 ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用.......................................... 6 一、ATP再生系统 .............................................................................................. 6 二、ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 .................................................. 10 三、生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建........................................ 16 第三节 有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统.............................................. 21 一、研究背景................................................................................................... 21 二、实验装置................................................................................................... 23 三、有机废水生产PHAs的初步研究.................................................................. 23 四、R. eutrophus 利用不同有机酸生产PHAs的比较研究.................................... 24 五、有机废水生产PHAs的机理研究.................................................................. 27 六、有机废水厌氧酸化最佳工艺条件的探索..................................................... 29 七、PHAs分批发酵 .......................................................................................... 32 八、以有机废水酸化产物为底物进行PHAs流加发酵 ......................................... 35 第四节 生物反应与产物分离的组合系统................................................................ 37 一、随程溶剂萃取............................................................................................ 38 二、渗透萃取................................................................................................... 39 三、渗透蒸发................................................................................................... 40 四、其它生物反应与产物分离技术................................................................... 40 五、生物反应与产物分离组合系统的发展趋势.................................................. 43
第三章生物反应过程的系统优化技术 第一节系统优化技术概述 在自然界和人类社会中,可以说任何事物都是以系统的形式存在的。人们在认识客观事 物或改造客观事物的过程中,用综合分析的思维方式看待事物,根据事物中内在的、本质 必然的联系,从整体的角度进行分析和研究,这类事物就被看作为一个系统。 系统的定义 系统的思想古已有之,但是将系统作为一个重要的科学概念予以研究,则是由奥地利理 论生物学家贝塔朗菲于1937年第一次提出来的,他认为系统是“一个相互作用的诸要素的 综合体”。到目前为止,系统的确切定义依照学科不同,使用方法不同和解决的问题不同而 有所区别,国外关于系统的定义不下40多个。我国科学家钱学森对系统的定义是:“系统 是由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而成的,具有特定功能的有机整体,而且这个 整体又是它从属的更大的系统的组成部分”。换句话说,系统是同类或相关事物按一定的内 在联系组成的整体。相对于环境而言,系统具有一定目的、一定功能并相对独立。 在日常生活中,我们对系统这个词并不陌生,自然界和人类社会中的很多事物都可以看 作为系统,如消化系统,铁路系统、神经系统等:而一个工厂可以看作是由各个车间、科室、 后勤等构成的系统:一部交响乐也可以看作是由多个乐章构成的系统。系统是有层次的,大 系统中包含着小系统,如在自然界中,宇宙是一个系统,银河系又是一个从属于宇宙的的系 统,是宇宙的子系统,而太阳系又是从属于银河系的一个银河系的子系统,再往下,地球又 是太阳系的一个子系统等等。大系统有大系统的特定规律,小系统不仅要从属于大系统,服 从大系统规律,而且本身又有自己的特定规律性,这是自然科学、社会科学普遍存在的带有 规律性的现象。 二、系统的形态 系统是以不同的形态存在的。根据生产的原因和反映的属性不同,系统可以进行各种各 样的分类。系统的形态与其所要解决的问题密切相关。系统的一般形态有: )自然系统和人造系统 自然系统是自然物等形成的系统。它的特点是自然形成的。自然系统一般表现为环境系 统,如海洋系统、矿藏系统、生态系统、大气系统等。人造系统是为了达到人类所需要的目 的,由人类设计和建造的系统。如工程技术系统、经营管理系统、科学技术系统等。 实际上,多数系统是自然系统与人造系统相结合的复合系统,因为许多系统是由人类运 用科学力量认识和改造了的自然系统。如社会系统,看起来是一个人造系统,但是它的发生 和发展是不以人们的意志为转移的,而是有其内在的规律性。随着科学技术的发展,已出现 了越来越多的人造系统 (二)实体系统和概念系统 实体系统是以生物、矿物、能源、机械等实体组成的系统。就是说,它的组成要素是具 有实体的物质。如人一机系统,机械系统、电力系统等。实体系统以硬件为主体,以静态系 统的形式来表现。概念系统则是由概念、原理、方法、制度、程序的功能观念性的非物质实 体所组成的系统,它是以软件为主体,依附于动态系统的形式来表现的。如科技体制、教育 体系、法律系统、程序系统等 (三)封闭系统与开放系统
2 第三章 生物反应过程的系统优化技术 第一节 系统优化技术概述 在自然界和人类社会中，可以说任何事物都是以系统的形式存在的。人们在认识客观事 物或改造客观事物的过程中，用综合分析的思维方式看待事物，根据事物中内在的、本质、 必然的联系，从整体的角度进行分析和研究，这类事物就被看作为一个系统。 一、系统的定义 系统的思想古已有之，但是将系统作为一个重要的科学概念予以研究，则是由奥地利理 论生物学家贝塔朗菲于 1937 年第一次提出来的，他认为系统是“一个相互作用的诸要素的 综合体”。到目前为止，系统的确切定义依照学科不同，使用方法不同和解决的问题不同而 有所区别，国外关于系统的定义不下 40 多个。我国科学家钱学森对系统的定义是∶“系统 是由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而成的，具有特定功能的有机整体，而且这个 整体又是它从属的更大的系统的组成部分”。换句话说，系统是同类或相关事物按一定的内 在联系组成的整体。相对于环境而言，系统具有一定目的、一定功能并相对独立。 在日常生活中，我们对系统这个词并不陌生，自然界和人类社会中的很多事物都可以看 作为系统，如消化系统，铁路系统、神经系统等；而一个工厂可以看作是由各个车间、科室、 后勤等构成的系统；一部交响乐也可以看作是由多个乐章构成的系统。系统是有层次的，大 系统中包含着小系统，如在自然界中，宇宙是一个系统，银河系又是一个从属于宇宙的的系 统，是宇宙的子系统，而太阳系又是从属于银河系的一个银河系的子系统，再往下，地球又 是太阳系的一个子系统等等。大系统有大系统的特定规律，小系统不仅要从属于大系统，服 从大系统规律，而且本身又有自己的特定规律性，这是自然科学、社会科学普遍存在的带有 规律性的现象。 二、系统的形态 系统是以不同的形态存在的。根据生产的原因和反映的属性不同，系统可以进行各种各 样的分类。系统的形态与其所要解决的问题密切相关。系统的一般形态有： (一)自然系统和人造系统 自然系统是自然物等形成的系统。它的特点是自然形成的。自然系统一般表现为环境系 统，如海洋系统、矿藏系统、生态系统、大气系统等。人造系统是为了达到人类所需要的目 的，由人类设计和建造的系统。如工程技术系统、经营管理系统、科学技术系统等。 实际上，多数系统是自然系统与人造系统相结合的复合系统，因为许多系统是由人类运 用科学力量认识和改造了的自然系统。如社会系统，看起来是一个人造系统，但是它的发生 和发展是不以人们的意志为转移的，而是有其内在的规律性。随着科学技术的发展，已出现 了越来越多的人造系统。 (二)实体系统和概念系统 实体系统是以生物、矿物、能源、机械等实体组成的系统。就是说，它的组成要素是具 有实体的物质。如人─机系统，机械系统、电力系统等。实体系统以硬件为主体，以静态系 统的形式来表现。概念系统则是由概念、原理、方法、制度、程序的功能观念性的非物质实 体所组成的系统，它是以软件为主体，依附于动态系统的形式来表现的。如科技体制、教育 体系、法律系统、程序系统等。 (三)封闭系统与开放系统
封闭系统是指与外界环境不发生任何形式交换的系统。它不向环境输出也不从环境输 ,一般讲,它是专为研究系统目的而设定的。如封存的设备、仪器以及其他尚未使用的技 术系统等。开放系统是指系统内部与外部环境有能量、物质和信息交换的系统。它从环境得 到输入,并向环境输出,而且系统状态直接受到环境变化的影响。大部分人造系统属于这- 类,如社会系统、经营管理系统等。 (四)静态系统和动态系统 静态系统是其固有状态参数不随时间变化的系统。它没有既定的相对输入与输出,表征 系统运动规律的模型中不含时间因素,即模型中的变量不随时间而变化。如车间平面布置系 统、城市规划布局等。静态系统属于实体系统。动态系统是系统状态变量随时间而改变的系 统,它有输入和输出及转换过程,一般都有人的行为因素在内。如生产系统、服务系统、开 发系统、社会系统等 (五)对象系统和行为系统 对象系统是按照具体研究对象进行区分而产生的系统。如企业的经营计划系统、生产系 统、库存系统等。行为系统是以完成目的行为作为组成要素的系统。所谓行为是指为达到某 确定的目的而执行某特定功能的作用,这种作用对外部环境能产生一定的效用。行为系统 的区别是根据行为特征的内容加以区别的。也就是说,尽管有些系统组成部分及其有关内容 是相同的,但如果起执行特定功能的作用不同,那么它们就不能是同类的系统。行为系统 般需要通过组织体系来体现,如社会系统、经济系统、管理系统等。 (六)控制系统和因果系统 控制系统是具有控制功能和手段的系统。当控制系统由控制装置自动进行时,称之为自 动控制系统。因果系统是输出完全决定于输入的系统,其状态与结果具有一致性,这类系统 一般为测试系统,如信号系统、记录系统、测量系统等。因果系统必须是开放系统 具体系统的形态可能千变完化,但是基本上可以看作是由上述各种系统相互组合而形成的。 它们之间往往是相互交叉和相互渗透的。 三、系统的特征 系统应当具备四个基本特征: )整体性 系统是由两个以上有一定区别又有一定相关的要素所组成,系统的整体性主要表现为系 统的整体功能。系统的整体功能不是各组成要素的简单迭加,而是呈现出各组成要素所没有 的新功能,概括地表述为”"整体大于部分之和"。 (二)相关性 各要素组成了系统是因为它们之间存在相互联系、相互作用、相互影响的关系。这个关 系不是简单的加和,即1十1≠2,而是有可能是互相增强,也有可能是互相减弱。有效的系 统,各要素之间互补增强,使系统保持稳定,具有生命力。而要做到这一点,系统必须有 定的有序结构 (三)目的性 系统具有能使各个要素集合在一起的共同目的,而且人造系统通常具有多重目的。例如 企业的经营管理系统,在限定的资源和现有职能机构的配合下,它的目的就是为了完成或超 额完成生产经营计划,实现规定的质量、品种、成本、利润等指标
3 封闭系统是指与外界环境不发生任何形式交换的系统。它不向环境输出也不从环境输 入，一般讲，它是专为研究系统目的而设定的。如封存的设备、仪器以及其他尚未使用的技 术系统等。开放系统是指系统内部与外部环境有能量、物质和信息交换的系统。它从环境得 到输入，并向环境输出，而且系统状态直接受到环境变化的影响。大部分人造系统属于这一 类，如社会系统、经营管理系统等。 (四)静态系统和动态系统 静态系统是其固有状态参数不随时间变化的系统。它没有既定的相对输入与输出，表征 系统运动规律的模型中不含时间因素，即模型中的变量不随时间而变化。如车间平面布置系 统、城市规划布局等。静态系统属于实体系统。动态系统是系统状态变量随时间而改变的系 统，它有输入和输出及转换过程，一般都有人的行为因素在内。如生产系统、服务系统、开 发系统、社会系统等。 (五)对象系统和行为系统 对象系统是按照具体研究对象进行区分而产生的系统。如企业的经营计划系统、生产系 统、库存系统等。行为系统是以完成目的行为作为组成要素的系统。所谓行为是指为达到某 一确定的目的而执行某特定功能的作用，这种作用对外部环境能产生一定的效用。行为系统 的区别是根据行为特征的内容加以区别的。也就是说，尽管有些系统组成部分及其有关内容 是相同的，但如果起执行特定功能的作用不同，那么它们就不能是同类的系统。行为系统一 般需要通过组织体系来体现，如社会系统、经济系统、管理系统等。 (六)控制系统和因果系统 控制系统是具有控制功能和手段的系统。当控制系统由控制装置自动进行时，称之为自 动控制系统。因果系统是输出完全决定于输入的系统，其状态与结果具有一致性，这类系统 一般为测试系统，如信号系统、记录系统、测量系统等。因果系统必须是开放系统。 具体系统的形态可能千变完化，但是基本上可以看作是由上述各种系统相互组合而形成的。 它们之间往往是相互交叉和相互渗透的。 三、系统的特征 系统应当具备四个基本特征： (一)整体性 系统是由两个以上有一定区别又有一定相关的要素所组成，系统的整体性主要表现为系 统的整体功能。系统的整体功能不是各组成要素的简单迭加，而是呈现出各组成要素所没有 的新功能，概括地表述为"整体大于部分之和"。 (二)相关性 各要素组成了系统是因为它们之间存在相互联系、相互作用、相互影响的关系。这个关 系不是简单的加和，即 l 十 1≠2，而是有可能是互相增强，也有可能是互相减弱。有效的系 统，各要素之间互补增强，使系统保持稳定，具有生命力。而要做到这一点，系统必须有一 定的有序结构。 (三)目的性 系统具有能使各个要素集合在一起的共同目的，而且人造系统通常具有多重目的。例如 企业的经营管理系统，在限定的资源和现有职能机构的配合下，它的目的就是为了完成或超 额完成生产经营计划，实现规定的质量、品种、成本、利润等指标
四)环境适应性。 环境是指出现于系统以外的事物(物质、能量、信息)的总称,相对于系统而言,环境 是一个更高级的、复杂的系统。所以系统时时刻刻存在于环境之中,与环境是相互依存的。 因此,系统必须适应外部环境的变化,能够经常与外部环境保持最佳的适应状态,才能得以 存在。对于社会系统而言,任何系统都是发展和变化着的,根据系统的目的,有时增加一些 要素,有时删除一些要素。也存在系统的分裂及合并,研究系统,尤其是研究社会系统,应 当有发展的观点 四、系统优化方法的基本原则 生物反应系统所包含的参数绝大多数属于不可控因素,且它们相互制约,互为条件。在 外界环境约束条件下,要正确处理好众多因素之间的关系,除非采用系统优化技术,否则难 以得到满意结果。生物反应系统优化的基本思想是整体优化的思想,对所研究的对象采用定 性或定量的模型优化技术,使系统整体目标最优。生物反应系统优化方法的原则主要有以下 四个方面 (一)系统整体性原则 世界上的一切事物、现象和过程,几乎都是自成系统而又互成系统。客观世界的整体性 正是系统优化方法整体性原则的来源和依据。在系统优化中,要求把研究对象看成由不同部 分构成的有机整体,把全局观点、整体观点贯彻于整个研究的各个方面、各个部分、各个阶 段。整体性原则具体包括:(1)不能从系统的局部得出有关系统整体的结论;(2)分系统的目 标必须服从于系统整体的目标 (二)系统有序相关原则 凡是系统都是有序的。系统的有序性,是系统有机联系的反映,系统的任何联系都是按 定等级和层次进行的,都是秩序井然、有条不紊的。在系统层次上表现出来的整体特性是 由要素或分系统组成的系统,由于内部结构方式、有序程度的不同,系统的整体功能表现出 极大的差异性。各要素(分系统)之间的相互关系越走向有序,系统的整体功能就越强,因 此,为获得预期的整体功能,从方法论上应把注意力集中于系统内部要素之间,以及各分系 统之间的相互关联上。 (三)系统目标优化原则 最优化的观念贯穿系统优化的始终,它是系统优化技术的指导思想和追求目标。最优化 技术是40年代发展起来的一门较新的数学分支,近几年发展迅速,应用范围愈来愈广,其 方法也愈来愈成熟,所能解决的实际问题也愈来愈多。所谓最优化,就是在一定的约束条件 下,如何求出使目标函数为最大(或最小)的解。求解最优化问题的方法称为最优化方法 般讲,最优化技术所研究的问题是对众多方案进行研究,并从中选择一个最优的方案。一个 系统往往包含许多参数,受外部环境影响较大,有些因素属于不可控因素。因此,也可以说, 优化问题是在不可控参数发生变化的情况下,根据系统的目标,经常、有效地确定可控参数 的数值,使系统经常处于最优状态。系统最优化离不开系统模型化。先有模型化而后才有系 统最优化 (四)系统动态性原则 系统优化是一个比较复杂的过程,研究对象内部复杂的相互作用和外部环境的多变性, 使系统本身呈现出动态特性。因此,应把实施对象看作一个动态过程,分析系统内外的各种
4 (四)环境适应性。 环境是指出现于系统以外的事物（物质、能量、信息）的总称，相对于系统而言，环境 是一个更高级的、复杂的系统。所以系统时时刻刻存在于环境之中，与环境是相互依存的。 因此，系统必须适应外部环境的变化，能够经常与外部环境保持最佳的适应状态，才能得以 存在。对于社会系统而言，任何系统都是发展和变化着的，根据系统的目的，有时增加一些 要素，有时删除一些要素。也存在系统的分裂及合并，研究系统，尤其是研究社会系统，应 当有发展的观点。 四、系统优化方法的基本原则 生物反应系统所包含的参数绝大多数属于不可控因素，且它们相互制约，互为条件。在 外界环境约束条件下，要正确处理好众多因素之间的关系，除非采用系统优化技术，否则难 以得到满意结果。生物反应系统优化的基本思想是整体优化的思想，对所研究的对象采用定 性或定量的模型优化技术，使系统整体目标最优。生物反应系统优化方法的原则主要有以下 四个方面∶ (一)系统整体性原则 世界上的一切事物、现象和过程，几乎都是自成系统而又互成系统。客观世界的整体性 正是系统优化方法整体性原则的来源和依据。在系统优化中，要求把研究对象看成由不同部 分构成的有机整体，把全局观点、整体观点贯彻于整个研究的各个方面、各个部分、各个阶 段。整体性原则具体包括∶(1)不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；(2)分系统的目 标必须服从于系统整体的目标。 (二)系统有序相关原则 凡是系统都是有序的。系统的有序性，是系统有机联系的反映，系统的任何联系都是按 一定等级和层次进行的，都是秩序井然、有条不紊的。在系统层次上表现出来的整体特性是 由要素或分系统组成的系统，由于内部结构方式、有序程度的不同，系统的整体功能表现出 极大的差异性。各要素（分系统）之间的相互关系越走向有序，系统的整体功能就越强，因 此，为获得预期的整体功能，从方法论上应把注意力集中于系统内部要素之间，以及各分系 统之间的相互关联上。 (三)系统目标优化原则 最优化的观念贯穿系统优化的始终，它是系统优化技术的指导思想和追求目标。最优化 技术是 40 年代发展起来的一门较新的数学分支，近几年发展迅速，应用范围愈来愈广，其 方法也愈来愈成熟，所能解决的实际问题也愈来愈多。所谓最优化，就是在一定的约束条件 下，如何求出使目标函数为最大(或最小)的解。求解最优化问题的方法称为最优化方法。一 般讲，最优化技术所研究的问题是对众多方案进行研究，并从中选择一个最优的方案。一个 系统往往包含许多参数，受外部环境影响较大，有些因素属于不可控因素。因此，也可以说， 优化问题是在不可控参数发生变化的情况下，根据系统的目标，经常、有效地确定可控参数 的数值，使系统经常处于最优状态。系统最优化离不开系统模型化。先有模型化而后才有系 统最优化。 (四)系统动态性原则 系统优化是一个比较复杂的过程，研究对象内部复杂的相互作用和外部环境的多变性， 使系统本身呈现出动态特性。因此，应把实施对象看作一个动态过程，分析系统内外的各种
变化,掌握变化的性质、方向和趋势,采取相应的手段,改进研究方法,在动态变化中对系 统整体进行优化 (五)系统分解综合原则 分解是将系统中具有密切相关关系的要素进行分组。对系统来说就是归纳出相对独立、 层次不同的分系统。综合则是完成新系统的筹建过程,即选择具有性能好、适用性强的分系 统,设计出它们的相互关系,形成具有更广泛价值的系统,以达到预定的目的。分解的方法 是多种多样的,一般可按结构要素、功能要素、时间序列、空间状态等方法进行分解。分解 的原则,既要满足于系统的构建要求,又要便于进行研究 (六)系统创造思维原则 系统创造思维的基本原则有两条。其一是把陌生的事物看作熟悉的东西,用己有的知识 加以辩识和解决。从这条原则出发,不只是对新的事物给以旧的解释,还可能给予新的解释, 从而创造出新的理论。其二是把熟悉的对象看作陌生的东西,用新的方法、新的原则加以研 究,从而创造出新的理论,新的技术。这往往是被人们忽略的原则。创造性思维活动极为复 杂,它的形式多种多样,并且常常以多种形式互相重叠交错在一起 五、本章主要内容 图3-1-1是生物反应系统的整体示意图。对这样一个复杂的系统进行优化研究,必须从 优化系统内部各要素的功能和相互间的关系、系统与环境的关系入手,才能使系统实现优化 配置。我们在实践中研究过的生物系统主要包括:(1)生物产品合成的能量(AIP)或辅因子 (NADH)再生系统:(2)废水生物处理的厌氧一好氧组合处理系统:(3)生物反应与产物提取的 耦合系统;(4)有机废水处理和有用物质生产的耦合系统。对这些系统进行优化,主要内容 包括两个方面:首先要构建一个系统,然后使这一系统高效运行。本章对此作一介绍。 发酵技术酶技术 培养技术 反应器 加工过程 加工过程 目的产物 成本经济 应用价值 的生物 大规模 传统育 基因工程 遗传学 图3-1-1生物反应系统示意图 5
5 变化，掌握变化的性质、方向和趋势，采取相应的手段，改进研究方法，在动态变化中对系 统整体进行优化。 (五)系统分解综合原则 分解是将系统中具有密切相关关系的要素进行分组。对系统来说就是归纳出相对独立、 层次不同的分系统。综合则是完成新系统的筹建过程，即选择具有性能好、适用性强的分系 统，设计出它们的相互关系，形成具有更广泛价值的系统，以达到预定的目的。分解的方法 是多种多样的，一般可按结构要素、功能要素、时间序列、空间状态等方法进行分解。分解 的原则，既要满足于系统的构建要求，又要便于进行研究。 (六)系统创造思维原则 系统创造思维的基本原则有两条。其一是把陌生的事物看作熟悉的东西，用已有的知识 加以辩识和解决。从这条原则出发，不只是对新的事物给以旧的解释，还可能给予新的解释， 从而创造出新的理论。其二是把熟悉的对象看作陌生的东西，用新的方法、新的原则加以研 究，从而创造出新的理论，新的技术。这往往是被人们忽略的原则。创造性思维活动极为复 杂，它的形式多种多样，并且常常以多种形式互相重叠交错在一起。 五、本章主要内容 图 3-1-1 是生物反应系统的整体示意图。对这样一个复杂的系统进行优化研究，必须从 优化系统内部各要素的功能和相互间的关系、系统与环境的关系入手，才能使系统实现优化 配置。我们在实践中研究过的生物系统主要包括∶(1)生物产品合成的能量(ATP)或辅因子 (NADH)再生系统；(2)废水生物处理的厌氧─好氧组合处理系统；(3)生物反应与产物提取的 耦合系统；(4)有机废水处理和有用物质生产的耦合系统。对这些系统进行优化，主要内容 包括两个方面∶首先要构建一个系统，然后使这一系统高效运行。本章对此作一介绍。 生物反应 过程 上游 加工过程 加工过程 下游 成本经济学 原料 的生物 具有 应用价值 传统育种 基因工程 细胞工程 目的产物 大规模 工艺开发 设计思想 遗传学 生理学 培养技术 反应器 发酵技术 酶技术 图 3-1-1 生物反应系统示意图
第二节ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 、ATP再生系统 20世纪60年代以来固定化技术的飞速发展,极大地促进了作为高效催化剂的酶和微生 物细胞在实际工业生产中的应用。目前,固定化细胞和酶不仅已被用于大规模连续生产医药 生物和营养方面的重要产品,而且在有机合成、化学和临床分析、食品工业、医药以及生物 化学的基础研究领域中也倍受人们关注。然而,遗憾的是,直到现在,固定化酶的工业应用 几乎全限于催化降解反应或简单的转化反应,在复杂合成过程中的应用鲜有报道,对人们所 关心的由简单前体合成复杂分子的过程更是研究甚少。而实际上,许多有用的、特别是那些 本来由传统发酵工艺生产的化合物,在细胞中通常是通过多酶反应合成的,因此,如何建立 一个合理的生物反应系统以实现有用化合物的高效生产,近年来已成为生化工程研究者所注 目的焦点问题。 阻碍多步酶反应经济可行工艺发展的屏障在于缺乏辅因子如5-三磷酸腺苷(AIP)和烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及辅酶A的再生和保留系统,故构建辅因子再生系统,无论是对 酶的经济利用还是对提高反应效率来讲都是必需的。其中又以AIP再生系统最为重要,因 为ATP通常作为生物合成酶反应生产有用物质所必需的能量来源,但ATP的价格又相对昂 贵,经济上不允许在反应过程中直接添加ATP。因此,一旦需要利用生物合成酶反应生产某 些物质,ATP提供方式是否经济、有效,直接影响反应的成功与否 ATP再生系统可定义为一个需要ATP的生物酶反应系统与一个ATP生物合成系统所构 成的耦合系统。一般地,ATP在降解为ADP(或AMP)的同时,释放贮存在AP分子中的能 量用于生物合成反应。若能建立一个适宜的反应系统,在这个系统中,由ATP降解而来的 ADP(或AMP)可通过其它途径再合成ATP,使AP能够循环使用,这样就有可能采用能够 再生ATP的廉价底物来替代ATP,从而提高有用物质生产过程的经济性 到目前为止所报道的ATP再生系统中,如果按底物的不同来分类,可以分为转移高能 磷酸基的反应系统和采用碳水化合物作为基质的反应系统。前一系统由于采用高能化合物作 为底物,实验室规模操作的效率虽然较高,但在工业上使用却很不稳定,会导致AIP再生 反应总产率的下降,且大规模提供这些物质也有问题,故用途不广。后一系统与前者相比优 势明显。因为从工业规模AP再生反应的角度来看,碳水化合物和磷酸基团无疑是价廉 稳定且能够大规模提供的基质。采用碳水化合物为基质再生ATP,通常需要多种参与糖代谢 的酶,由于不太可能分离出酵解系统的所有酶,故可以采用含有这些酶的微生物细胞作为合 成ATP的酶源。根据酶源的不同,又可将利用碳水化合物为基质的ATP再生系统再分为自 耦合系统(图3-2-1)和种间耦合系统(图3-2-2)
6 第二节 ATP 再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 一、ATP 再生系统 20 世纪 60 年代以来固定化技术的飞速发展，极大地促进了作为高效催化剂的酶和微生 物细胞在实际工业生产中的应用。目前，固定化细胞和酶不仅已被用于大规模连续生产医药、 生物和营养方面的重要产品，而且在有机合成、化学和临床分析、食品工业、医药以及生物 化学的基础研究领域中也倍受人们关注。然而，遗憾的是，直到现在，固定化酶的工业应用 几乎全限于催化降解反应或简单的转化反应，在复杂合成过程中的应用鲜有报道，对人们所 关心的由简单前体合成复杂分子的过程更是研究甚少。而实际上，许多有用的、特别是那些 本来由传统发酵工艺生产的化合物，在细胞中通常是通过多酶反应合成的，因此，如何建立 一个合理的生物反应系统以实现有用化合物的高效生产，近年来已成为生化工程研究者所注 目的焦点问题。 阻碍多步酶反应经济可行工艺发展的屏障在于缺乏辅因子如 5'-三磷酸腺苷(ATP)和烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及辅酶 A 的再生和保留系统，故构建辅因子再生系统，无论是对 酶的经济利用还是对提高反应效率来讲都是必需的。其中又以 ATP 再生系统最为重要，因 为 ATP 通常作为生物合成酶反应生产有用物质所必需的能量来源，但 ATP 的价格又相对昂 贵，经济上不允许在反应过程中直接添加 ATP。因此，一旦需要利用生物合成酶反应生产某 些物质，ATP 提供方式是否经济、有效，直接影响反应的成功与否。 ATP 再生系统可定义为一个需要 ATP 的生物酶反应系统与一个 ATP 生物合成系统所构 成的耦合系统。一般地，ATP 在降解为 ADP(或 AMP)的同时，释放贮存在 ATP 分子中的能 量用于生物合成反应。若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由 ATP 降解而来的 ADP(或 AMP)可通过其它途径再合成 ATP，使 ATP 能够循环使用，这样就有可能采用能够 再生 ATP 的廉价底物来替代 ATP，从而提高有用物质生产过程的经济性。 到目前为止所报道的 ATP 再生系统中，如果按底物的不同来分类，可以分为转移高能 磷酸基的反应系统和采用碳水化合物作为基质的反应系统。前一系统由于采用高能化合物作 为底物，实验室规模操作的效率虽然较高，但在工业上使用却很不稳定，会导致 ATP 再生 反应总产率的下降，且大规模提供这些物质也有问题，故用途不广。后一系统与前者相比优 势明显。因为从工业规模 ATP 再生反应的角度来看，碳水化合物和磷酸基团无疑是价廉、 稳定且能够大规模提供的基质。采用碳水化合物为基质再生 ATP，通常需要多种参与糖代谢 的酶，由于不太可能分离出酵解系统的所有酶，故可以采用含有这些酶的微生物细胞作为合 成 ATP 的酶源。根据酶源的不同，又可将利用碳水化合物为基质的 ATP 再生系统再分为自 耦合系统(图 3-2-1)和种间耦合系统(图 3-2-2)
ADP或AMP 葡萄糖 再生ATP的反应系统 化碳 有机酸 ATP 需要ATP的生物合成反应 产物 ADP或AMP 微生物细胞 图3-2-1自耦合ATP再生系统示意图 大肠杆菌 前体 需要ATP的生物酶反应 产物 ATP ADP(AMP) 葡萄糖一-再生ATP的反应系统 氧化碳 有机酸(或乙醇) 产氨短杆菌或面包酵母 图3-2-2种间耦合ATP再生系统示意图 )ATP再生系统的必要条件 为了建立如图3-2-1和图3-22所示的耦合反应系统并成功地用于实际生产,必须满足 以下条件∶(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定;(2)能大量提供廉价、稳定的前 体物质:(3)再生AP的活性足够强且稳定,能与生物合成酶反应成功地耦合;(4)提供廉价 的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于AIP再生:(5)若有类似于分解 反应的有害副反应,则必须对其加以控制;(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜,则必 须设法提高膜的通透性。 (二)自耦合ATP再生系统 1、反应系统概述 如图3-2-1所示,在自耦合反应系统中,生物合成酶反应所消耗的ATP被具有ATP合 成活性的同种微生物菌株再生,后再用于生物合成反应。故只需提供葡萄糖和目标产物的前 体,生物合成反应便可以进行下去,而无需添加超过催化剂量的昂贵的AIP。下面就举几个 采用自耦合反应系统生产有用物质的例子。 2、GMP(5-鸟苷酸钠盐)生产过程 KMP+NH3+ATP--GMP+ AMP+PP GMP具有很强的调味功能,全世界每年的需求量为数千吨。产氨短杆菌( Brevibacterium ammol/Loniagenes)具有转化XMP(5-磷酸黄苷)生成GMP的能力,此外还需要添加葡萄糖和
7 再生ATP的反应系统 需要ATP的生物合成反应 ATP ADP或AMP ADP或AMP 葡萄糖 前体 产物 微生物细胞 二氧化碳 水和有机酸 图 3-2-1 自耦合 ATP 再生系统示意图 需要ATP的生物酶反应 再生ATP的反应系统 ATP ADP(AMP) 前体 产物 葡萄糖 二氧化碳、水 有机酸(或乙醇) 大肠杆菌 产氨短杆菌或面包酵母 图 3-2-2 种间耦合 ATP 再生系统示意图 (一)ATP 再生系统的必要条件 为了建立如图 3-2-1 和图 3-2-2 所示的耦合反应系统并成功地用于实际生产，必须满足 以下条件∶(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定；(2)能大量提供廉价、稳定的前 体物质；(3)再生 ATP 的活性足够强且稳定，能与生物合成酶反应成功地耦合；(4)提供廉价 的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于 ATP 再生；(5)若有类似于分解 反应的有害副反应，则必须对其加以控制；(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜，则必 须设法提高膜的通透性。 (二)自耦合 ATP 再生系统 1、反应系统概述 如图 3-2-1 所示，在自耦合反应系统中，生物合成酶反应所消耗的 ATP 被具有 ATP 合 成活性的同种微生物菌株再生，后再用于生物合成反应。故只需提供葡萄糖和目标产物的前 体，生物合成反应便可以进行下去，而无需添加超过催化剂量的昂贵的 ATP。下面就举几个 采用自耦合反应系统生产有用物质的例子。 2、GMP(5'-鸟苷酸钠盐)生产过程 XMP＋NH3＋ATP→GMP＋AMP＋PPi GMP 具有很强的调味功能，全世界每年的需求量为数千吨。产氨短杆菌(Brevibacterium ammol/Loniagenes)具有转化 XMP(5'-磷酸黄苷)生成 GMP 的能力，此外还需要添加葡萄糖和
铵离子。由于产物GMP不能透过细胞膜,因而必须加入一种表面活性剂( POESA,聚氧乙 烯硬脂酰胺)以提高细胞膜的渗透性。该菌的缺点是具有核苷酸分解酶活性,能分解XM 和GMP:并具有磷酸化GMP生成GDP和GTP的酶活性,还能转移ATP的磷酸基团到GMP 的3'位置,这些都会导致GMP的产率下降。选育低核苷酸分解活性的菌株及进一步控制有 关酶的形成可克服前一困难,而后面的问题则可通过优化反应条件来解决。 3、AIP(腺嘌呤核苷-5-三磷酸钠盐)生产过程 葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤+PRPP→AMP+PPi ATP可用作生化试剂及治疗心脏疾病、肌肉营养障碍的药物。用腺苷和AMP作为前体 可积累大量AP。近来发现,用腺嘌呤作为AP生产的前体可能更为适宜,因为化学合成 的腺嘌呤价格比较低廉。唯一的问题是腺嘌呤分子中不含核糖,若要用腺嘌呤作为前体,必 须以某种方式提供核糖。一种同时具有PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与AP生物合 成活性的产氨短杆菌可利用腺嘌呤为前体生产AP。实验中观察到当ATP开始积累时反应 便告停止,分析发现,镁离子是这一转化过程必须的辅因子,但AIP对二价金属离子有很 强的螯合作用,而被ATP螯合后的镁离子不能作为辅因子,镁离子不足抑制了反应的继续 进行。为此必须随着反应的进行适当补加镁离子以防止反应液中镁离子的缺乏。 4、GSH(谷胱甘肽)的生产过程 Gilu+Cys+ATP→y-GC(γ-谷氨酰半胱氨酸 Y-GC+Gly +ATP-GSH+ADP+Pi GSH是生物体内一种重要的生物活性三肽,通常用作治疗肝脏疾病的药物。它是由y 谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSHI)和谷胱甘肽合成酶(GSH)在ATP存在下催化L-谷氨酸、L 半胱氨酸和甘氨酸的一个序贯酶反应合成的。每合成1摩尔GSH需消耗2摩尔ATP。用于 核苷酸生产的产氨短杆菌不能用作合成GSH的酶源,因为该菌中GSHI和GSHⅡ的活性非 常弱。有报道说,将编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gsh/和gsh∥自克隆入E.coi中,构建 株具有高GSH合成活性的重组E.coli,利用该菌可建立一个用于生产GSH的自耦合反应系 统,反应液中积累的GSH比出发菌株提高了10倍。研究结果还表明该菌中AIP再生系统 的效率是影响GSH产率的主要因素 (三)种间耦合ATP再生系统 1、反应系统概况 自耦合ATP再生系统由于只用到一种微生物,故该菌中必须同时具有需要ATP的生物 合成反应的酶活性和再生ATP的酶活性。要提高自耦合反应系统的效率,必须同时提高这 两个系统的活性,而实际上这很难做到。一方面,虽然目前采用重组DNA技术可显著促进 特定酶的活性,但酶活性的提高与作为酶活性供体的细胞数量成反比,故所需的细胞量将大 量减少:另一方面,ATP的生物合成是一个多酶反应系统,要想分离出参与反应和促进活性 表达的全部酶的基因非常困难,采用重组DNA技术也很难大幅度提高其活性,由此导致的 结果是,用于反应的细胞数量又不能减少。这样就形成了一个矛盾。 由此想到,如果能采用不同的微生物,一种作为AP合成活性的供体,另一种作为与 此相偶联的生物合成酶活性的供体(图3-2-2),即可构成一个种间耦合ATP再生系统。这 系统的优点在于:①合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择:;②采用重组DNA技
8 铵离子。由于产物 GMP 不能透过细胞膜，因而必须加入一种表面活性剂(POESA，聚氧乙 烯硬脂酰胺)以提高细胞膜的渗透性。该菌的缺点是具有核苷酸分解酶活性，能分解 XMP 和 GMP；并具有磷酸化 GMP 生成 GDP 和 GTP 的酶活性，还能转移 ATP 的磷酸基团到 GMP 的 3'位置，这些都会导致 GMP 的产率下降。选育低核苷酸分解活性的菌株及进一步控制有 关酶的形成可克服前一困难，而后面的问题则可通过优化反应条件来解决。 3、ATP(腺嘌呤核苷-5'-三磷酸钠盐)生产过程 葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤＋PRPP→AMP＋PPi ATP 可用作生化试剂及治疗心脏疾病、肌肉营养障碍的药物。用腺苷和 AMP 作为前体 可积累大量 ATP。近来发现，用腺嘌呤作为 ATP 生产的前体可能更为适宜，因为化学合成 的腺嘌呤价格比较低廉。唯一的问题是腺嘌呤分子中不含核糖，若要用腺嘌呤作为前体，必 须以某种方式提供核糖。一种同时具有 PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与 ATP 生物合 成活性的产氨短杆菌可利用腺嘌呤为前体生产 ATP。实验中观察到当 ATP 开始积累时反应 便告停止，分析发现，镁离子是这一转化过程必须的辅因子，但 ATP 对二价金属离子有很 强的螯合作用，而被 ATP 螯合后的镁离子不能作为辅因子，镁离子不足抑制了反应的继续 进行。为此必须随着反应的进行适当补加镁离子以防止反应液中镁离子的缺乏。 4、GSH(谷胱甘肽)的生产过程 Glu＋Cys＋ATP→-GC(-谷氨酰半胱氨酸) -GC＋Gly＋ATP→GSH＋ADP＋Pi GSH 是生物体内一种重要的生物活性三肽，通常用作治疗肝脏疾病的药物。它是由- 谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)在 ATP 存在下催化 L-谷氨酸、L- 半胱氨酸和甘氨酸的一个序贯酶反应合成的。每合成 1 摩尔 GSH 需消耗 2 摩尔 ATP。用于 核苷酸生产的产氨短杆菌不能用作合成 GSH 的酶源，因为该菌中 GSHⅠ和 GSHⅡ的活性非 常弱。有报道说，将编码 GSHⅠ和 GSHⅡ的基因 gshⅠ和 gshⅡ自克隆入 E. coli 中，构建一 株具有高 GSH 合成活性的重组 E. coli，利用该菌可建立一个用于生产 GSH 的自耦合反应系 统，反应液中积累的 GSH 比出发菌株提高了 10 倍。研究结果还表明该菌中 ATP 再生系统 的效率是影响 GSH 产率的主要因素。 (三)种间耦合 ATP 再生系统 1、反应系统概况 自耦合 ATP 再生系统由于只用到一种微生物，故该菌中必须同时具有需要 ATP 的生物 合成反应的酶活性和再生 ATP 的酶活性。要提高自耦合反应系统的效率，必须同时提高这 两个系统的活性，而实际上这很难做到。一方面，虽然目前采用重组 DNA 技术可显著促进 特定酶的活性，但酶活性的提高与作为酶活性供体的细胞数量成反比，故所需的细胞量将大 量减少；另一方面，ATP 的生物合成是一个多酶反应系统，要想分离出参与反应和促进活性 表达的全部酶的基因非常困难，采用重组 DNA 技术也很难大幅度提高其活性，由此导致的 结果是，用于反应的细胞数量又不能减少。这样就形成了一个矛盾。 由此想到，如果能采用不同的微生物，一种作为 ATP 合成活性的供体，另一种作为与 此相偶联的生物合成酶活性的供体(图 3-2-2)，即可构成一个种间耦合 ATP 再生系统。这一 系统的优点在于∶①合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择；②采用重组 DNA 技
术可显著促进特定酶的活性 在种间耦合反应系统中,通常都采用E.coh作为合成酶活性的受体菌,因为E.cob可 满足大多数重组DNA技术的应用要求。以下举例说明采用重组DNA技术构建的大肠杆菌 和具有较强AP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP生产过程 日本有学者将编码GMP合成酶(或称XMP胺化酶)的基因从E.col中克隆出,再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与ⅹMP的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合,再加入反应所必需的组分,如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂,以转 化XMP为GMP。由于GMP合成酶活性较高,故转化反应用细胞的培养液体积可减少,这 样,反应开始时ⅹMP的浓度相对较高,反应结東后的GMP浓度也较高,从而提高了生产 3、IMP(5-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)+ATP→IMP+ADP 采用种间耦合系统生产IMP的思路与GMP生产类似。Mon从E.co中克隆出编码鸟 苷一肌苷激酶(负责IMP合成)的基因,并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体,产氨短杆菌为ATP再生活性细胞,加入具有较强肌苷一鸟苷 激酶活性的E.co培养液,IMP可大量积累。这一过程的优点亦与GMP生产过程类似 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱十AIP→磷酸胆碱+AD CIP十磷酸胆碱→CDP胆碱 CDP胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成CIP的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统,普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累CTP是很困难的。日本学 者发现,产氨短杆菌只能转化乳清酸为UTP而非CTP,使用E.col中负责CTP合成的酶可 解决这一问题,使CTP大量积累。但细菌不具有CDP胆碱生物合成系统,为此,他们克隆 了酵母的CDP胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因,并使 之在E.co中高效表达。具体操作是,先将来自酵母的CD胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因,再和来自E.coh的CTP合成酶基因一起插入质粒。这样, 携带重组质粒的E.coh细胞内便具有了三种酶的活性。将重组E.cob和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行CDP胆碱的生产。当然,还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中CDP胆碱浓度达到11.7g/L,比起用胞苷和CMP作为前体的传统方法,成本显著下降。 5、GSH的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和E.coh的自耦合ATP再生系统均可生产GSH。前 者的ATP再生能力虽然较强,但GSH合成活性不高:而后者利用乙酸激酶反应再生ATP, 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。 Murata利用S. cerevisiae和E.coli,构建了一个生产GSH的 种间耦合系统,其中S. cerevisiae作为提供AIP的酶源。这一系统可以有两种形式,即共固 定化系统(S. cerevisiae和E.col细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae和E.co分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使ATP能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中,必须加入腺嘌呤。实验结果表明,混 合固定化系统的GSH产量略低于共固定化系统,可能是在分别固定化的S. cerevisiae和E
9 术可显著促进特定酶的活性。 在种间耦合反应系统中，通常都采用 E. coli 作为合成酶活性的受体菌，因为 E. coli 可 满足大多数重组 DNA 技术的应用要求。以下举例说明采用重组 DNA 技术构建的大肠杆菌 和具有较强 ATP 生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP 生产过程 日本有学者将编码 GMP 合成酶(或称 XMP 胺化酶)的基因从 E. coli 中克隆出，再通过 自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与 XMP 的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混 合，再加入反应所必需的组分，如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂，以转 化 XMP 为 GMP。由于 GMP 合成酶活性较高，故转化反应用细胞的培养液体积可减少，这 样，反应开始时 XMP 的浓度相对较高，反应结束后的 GMP 浓度也较高，从而提高了生产 率。 3、IMP(5'-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP 采用种间耦合系统生产 IMP 的思路与 GMP 生产类似。Mori 从 E. coli 中克隆出编码鸟 苷─肌苷激酶(负责 IMP 合成)的基因，并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养 液中生产的肌苷被用作前体，产氨短杆菌为 ATP 再生活性细胞，加入具有较强肌苷─鸟苷 激酶活性的 E. coli 培养液，IMP 可大量积累。这一过程的优点亦与 GMP 生产过程类似。 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱＋ATP→磷酸胆碱＋ADP CTP＋磷酸胆碱→CDP 胆碱 CDP 胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成 CTP 的途径是一个 多酶参与的复杂反应系统，普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累 CTP 是很困难的。日本学 者发现，产氨短杆菌只能转化乳清酸为 UTP 而非 CTP，使用 E. coli 中负责 CTP 合成的酶可 解决这一问题，使 CTP 大量积累。但细菌不具有 CDP 胆碱生物合成系统，为此，他们克隆 了酵母的 CDP 胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因，并使 之在 E. coli 中高效表达。具体操作是，先将来自酵母的 CDP 胆碱合成酶基因和胆碱激酶的 基因结合起来制备一个融合基因，再和来自 E. coli 的 CTP 合成酶基因一起插入质粒。这样， 携带重组质粒的 E. coli 细胞内便具有了三种酶的活性。将重组 E. coli 和产氨短杆菌的培养 液相混合就可进行 CDP 胆碱的生产。当然，还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应 液中 CDP 胆碱浓度达到 11.7g/L，比起用胞苷和 CMP 作为前体的传统方法，成本显著下降。 5、GSH 的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和 E. coli 的自耦合 ATP 再生系统均可生产 GSH。前 者的 ATP 再生能力虽然较强，但 GSH 合成活性不高；而后者利用乙酸激酶反应再生 ATP， 所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。Murata 利用 S. cerevisiae 和 E. coli，构建了一个生产 GSH 的 种间耦合系统，其中 S. cerevisiae 作为提供 ATP 的酶源。这一系统可以有两种形式，即共固 定化系统(S. cerevisiae 和 E. coli 细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系 统(S. cerevisiae 和 E. coli 分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使 ATP 能够在 两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中，必须加入腺嘌呤。实验结果表明，混 合固定化系统的 GSH 产量略低于共固定化系统，可能是在分别固定化的 S. cerevisiae 和 E
coli的颗粒中ADP和ATP的扩散存在屏障。韩国仁荷大学Koo等也在研究生产GSH的混 合固定化系统,其中E.co经过重组DNA技术提高了GSH合成活性,具有高发酵活力的 S. cerevisiae则作为AIP供体。研究结果尚未发表 (四)ATP再生系统存在的问题 用微生物细胞本身作为酶源构建AP再生系统还有几个问题尚未解决。问题之一,除 了合成产物所需的关键酶以外,细胞内还有许多种酶,其中一些具有分解活性,能将反应的 底物和预定的产物转化为副产物。问题之二,微生物细胞具有很强的自我保护功能,作为渗 透屏障的细胞膜可防止胞内物质滲出。但当细胞用作酶源时,这种屏障就会阻碍底物和产物 进出细胞。因此有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法 1、抑制副反应的方法 对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶,可通过选育缺失该酶活性的突变株,或 优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度。如在GSH生产中应设法降低y-谷氨酰转 肽酶的活性以避免GSH降解为L半胱氨酰甘氨酸 2、提高膜通透性的方法 目前,多采用酵母或细菌以碳水化合物为基质和能源进行AIP再生。一般地,干燥细 胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性。但从工业观点看,前两种方 法均存在问题,因为干燥细胞需要大型设备,而大量使用溶剂又会受到消防要求的制约。在 这种形势下,使用表面活性剂的方法无论在经济性、安全性上都可能是最具优势的。 Fujio 硏究发现,聚氧乙烯硬脂酰胺( POESA)对提高细胞膜透性较为适宜。 采用ATP再生系统来生产GMP、IMP、AIP、GSH和CDP胆碱的过程已有很多研究报 道。其中除GSH已通过固定化实现连续生产以外,多数是在悬浮培养体系中构建ATP再生 系统。实际上,从工业观点看,固定化微生物细胞进行有用物质的生产,具有以下优势:① 不需要提取和纯化酶的过程:②细胞可以重复使用:③可以实现连续操作:;④反应器占地小 ⑤反应控制容易:⑥要处理的液体体积小:⑦可以获得高纯度产品:⑨工厂污染减轻。因此, 虽然固定化操作较为繁琐,研究由固定化细胞组成的ATP再生系统生产有用物质的过程, 仍是这一领域今后的发展方向 如果一个需要ATP的生物合成系统包括多步反应,确定哪一种酶是合成途径中最关键 的酶就显得至关重要,因为重组DNA技术并不能无限制地提高所有酶的活性。例如,CDP 胆碱的生产过程需要经过三个步骤,简单地将三种基因导入质粒并不能使之获得充分的表 达,这可能是因为CDP胆碱原本不存在于细菌中的缘故。发展多酶反应系统生产有用物质 的重要性是毋庸置疑的,但确定哪一个是酶反应的关键步骤还有待于进一步探究。此外,虽 然基因重组也很难提高ATP生物合成系统的整体活性,但一旦ATP生物合成系统得以强化, 生产率就可大大提高。从另一个角度说,ATP生物合成系统的活性是目前限制ATP再生系 统推广应用的瓶颈问题 二、ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 谷胱甘肽(GSH由于具有解毒、抗衰老和抗氧化等重要的生理功能,故而在医药和食品 工业中的应用前景十分广阔。虽然日本利用酵母发酵生产的GSH早在1985年就取得了中国 卫生部的原料药进口许可文号,但由于GSH是酵母胞内产物,提取工艺繁琐及提取成本过 高,使得GSH的价格居高不下,从而限制了它的推广应用
10 coli 的颗粒中 ADP 和 ATP 的扩散存在屏障。韩国仁荷大学 Koo 等也在研究生产 GSH 的混 合固定化系统，其中 E. coli 经过重组 DNA 技术提高了 GSH 合成活性，具有高发酵活力的 S. cerevisiae 则作为 ATP 供体。研究结果尚未发表。 (四)ATP 再生系统存在的问题 用微生物细胞本身作为酶源构建 ATP 再生系统还有几个问题尚未解决。问题之一，除 了合成产物所需的关键酶以外，细胞内还有许多种酶，其中一些具有分解活性，能将反应的 底物和预定的产物转化为副产物。问题之二，微生物细胞具有很强的自我保护功能，作为渗 透屏障的细胞膜可防止胞内物质渗出。但当细胞用作酶源时，这种屏障就会阻碍底物和产物 进出细胞。因此有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法。 1、抑制副反应的方法 对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶，可通过选育缺失该酶活性的突变株，或 优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度。如在 GSH 生产中应设法降低-谷氨酰转 肽酶的活性以避免 GSH 降解为 L-半胱氨酰甘氨酸。 2、提高膜通透性的方法 目前，多采用酵母或细菌以碳水化合物为基质和能源进行 ATP 再生。一般地，干燥细 胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性。但从工业观点看，前两种方 法均存在问题，因为干燥细胞需要大型设备，而大量使用溶剂又会受到消防要求的制约。在 这种形势下，使用表面活性剂的方法无论在经济性、安全性上都可能是最具优势的。Fujio 研究发现，聚氧乙烯硬脂酰胺(POESA)对提高细胞膜透性较为适宜。 采用 ATP 再生系统来生产 GMP、IMP、ATP、GSH 和 CDP 胆碱的过程已有很多研究报 道。其中除 GSH 已通过固定化实现连续生产以外，多数是在悬浮培养体系中构建 ATP 再生 系统。实际上，从工业观点看，固定化微生物细胞进行有用物质的生产，具有以下优势∶① 不需要提取和纯化酶的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现连续操作；④反应器占地小； ⑤反应控制容易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高纯度产品；⑨工厂污染减轻。因此， 虽然固定化操作较为繁琐，研究由固定化细胞组成的 ATP 再生系统生产有用物质的过程， 仍是这一领域今后的发展方向。 如果一个需要 ATP 的生物合成系统包括多步反应，确定哪一种酶是合成途径中最关键 的酶就显得至关重要，因为重组 DNA 技术并不能无限制地提高所有酶的活性。例如，CDP 胆碱的生产过程需要经过三个步骤，简单地将三种基因导入质粒并不能使之获得充分的表 达，这可能是因为 CDP 胆碱原本不存在于细菌中的缘故。发展多酶反应系统生产有用物质 的重要性是毋庸置疑的，但确定哪一个是酶反应的关键步骤还有待于进一步探究。此外，虽 然基因重组也很难提高 ATP 生物合成系统的整体活性，但一旦 ATP 生物合成系统得以强化， 生产率就可大大提高。从另一个角度说，ATP 生物合成系统的活性是目前限制 ATP 再生系 统推广应用的瓶颈问题。 二、ATP 再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 谷胱甘肽(GSH)由于具有解毒、抗衰老和抗氧化等重要的生理功能，故而在医药和食品 工业中的应用前景十分广阔。虽然日本利用酵母发酵生产的 GSH 早在 1985 年就取得了中国 卫生部的原料药进口许可文号，但由于 GSH 是酵母胞内产物，提取工艺繁琐及提取成本过 高，使得 GSH 的价格居高不下，从而限制了它的推广应用