《发酵工程》课程教学资源（讲义）第七章 谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化

第七章谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化 第一节谷氨酰胺转胺酶发酵概述 新型蛋白食品与谷氨酰胺转胺酶 蛋白质作为食物中最重要的成分之一,一直受到人们的重视。目前,无论发达国家还 是发展中国家都迫切要求新型蛋白食品的问世。对于发达国家的人们来说,动物蛋白质的 过多摄入严重损害了人体的健康(如高血压、心脑血管病患者人数增多);而对发展中国家 的人们来说,则由于动物蛋白质摄入的贫乏,造成人们营养普遍不良。全球耕地的不断减 少,而人口却与日俱增,因而对新型营养蛋白食品的需求量日益增大。我国人口占世界人 口的20%,而耕地面积仅占世界的10%左右,这种需求就尤为突出 许多食品蛋白质,由于氨基酸组成不理想,或缺乏适当的结构和构像,因而使得这些 蛋白质缺乏良好的功能性质,且本身的营养价值也不高。由此可见,寻求用一种简单高效 的方法生产新型蛋白食品,来替代部分传统的功能性质较差的食品显得非常迫切。人们只 要摄入一定量的此类蛋白食品就能满足自身的营养要求。此类新型蛋白食品应具备以下品 质:营养价值高、质构合理、外型美观、安全卫生、货架期长、口感好且抗过敏等 对这些蛋白质进行化学修饰来改善它们的功能性质,人们曾经做过广泛的研究,但考 虑到化学试剂的安全性问题及其对食品营养可能造成的不良影响,这些方法最终未能被人 们普遍接受和应用。酶法修饰由于其具有安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏的特 点,而越来越得到人们的认可。至今,用酶法对蛋白质进行修饰的研究,大量集中在利用 些蛋白水解酶类对蛋白质进行局部水解,以改善它们的溶解性和发泡性。而实际上,仅 仅改善这些性质还远不能达到人们对食品品质的要求 谷氨酰胺转胺酶(蛋白质谷氨酸-γ谷氨酰胺转移酶, Transglutaminase,EC2.32.13, IG),又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽--谷氨酰胺酰基转移酶,可以催化蛋白质分子内 的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的 水解,从而可进一步改善蛋白质功能性质,提高蛋白质的营养价值。因此,TG被认为是 种可生产出满足人们需求的新型蛋白食品的重要酶制剂。目前,日本味之素公司已生产 出TG并已投放市场 二、谷氨酰胺转胺酶的功能性质 (一)谷氨酰胺转胺酶的来源、主要结构、组成及性质 谷氨酰胺转胺酶存在于动物、植物和微生物中。动物体中的谷氨酰胺转胺酶 ( Guinea-pig transglutaminase,简称GTG)及微生物生产的谷氨酰胺转胺酶( Microbial transglutaminase,简称MIG)的主要来源、结构、组成及理化性质均不同。不同来源的酶 对底物的专一性有所不同。对分子中有Lys或Lys二肽的底物,MTG表现出更强的催化能力, 这是由于MG较强的热稳定性。但当底物为 CBz-GIn-Gy-Oet, CBz-GIn-Gn-Gly CBz-Gly-Gln-Gly-Gly时,MIG酶活则低于GTG活性。GTG分子量约为MTG的2倍,且活性 依赖于Ca2+,而MIG的活性则不依赖于Ca2+,但二者活性中心均包括Cys残基 MIG是一种胞外酶,分子量在40kD左右,活性中心包含一个游离的Cys巯基,与 GTG相比,MIG表现出很多优势: (1)对钙离子的非依赖性 (2)对热和pH的稳定性;

1 第七章 谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化 第一节 谷氨酰胺转胺酶发酵概述 一、新型蛋白食品与谷氨酰胺转胺酶 蛋白质作为食物中最重要的成分之一，一直受到人们的重视。目前，无论发达国家还 是发展中国家都迫切要求新型蛋白食品的问世。对于发达国家的人们来说，动物蛋白质的 过多摄入严重损害了人体的健康(如高血压、心脑血管病患者人数增多)；而对发展中国家 的人们来说，则由于动物蛋白质摄入的贫乏，造成人们营养普遍不良。全球耕地的不断减 少，而人口却与日俱增，因而对新型营养蛋白食品的需求量日益增大。我国人口占世界人 口的 20%，而耕地面积仅占世界的 10%左右，这种需求就尤为突出。 许多食品蛋白质，由于氨基酸组成不理想，或缺乏适当的结构和构像，因而使得这些 蛋白质缺乏良好的功能性质，且本身的营养价值也不高。由此可见，寻求用一种简单高效 的方法生产新型蛋白食品，来替代部分传统的功能性质较差的食品显得非常迫切。人们只 要摄入一定量的此类蛋白食品就能满足自身的营养要求。此类新型蛋白食品应具备以下品 质：营养价值高、质构合理、外型美观、安全卫生、货架期长、口感好且抗过敏等。 对这些蛋白质进行化学修饰来改善它们的功能性质，人们曾经做过广泛的研究，但考 虑到化学试剂的安全性问题及其对食品营养可能造成的不良影响，这些方法最终未能被人 们普遍接受和应用。酶法修饰由于其具有安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏的特 点，而越来越得到人们的认可。至今，用酶法对蛋白质进行修饰的研究，大量集中在利用 一些蛋白水解酶类对蛋白质进行局部水解，以改善它们的溶解性和发泡性。而实际上，仅 仅改善这些性质还远不能达到人们对食品品质的要求。 谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸--谷氨酰胺转移酶，Transglutaminase，EC 2.3.2.13， TG)，又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽--谷氨酰胺酰基转移酶，可以催化蛋白质分子内 的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的 水解，从而可进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值。因此，TG 被认为是 一种可生产出满足人们需求的新型蛋白食品的重要酶制剂。目前，日本味之素公司已生产 出 TG 并已投放市场。 二、谷氨酰胺转胺酶的功能性质 (一)谷氨酰胺转胺酶的来源、主要结构、组成及性质 谷氨酰胺转胺酶存在于动物、植物和微生物中。动物体中的谷氨酰胺转胺酶 (Guinea-pig transglutaminase，简 称GTG) 及微 生物生产的 谷氨酰胺转 胺酶(Microbial transglutaminase， 简称MTG)的主要来源、结构、组成及理化性质均不同。不同来源的酶 对底物的专一性有所不同。对分子中有Lys或Lys二肽的底物，MTG表现出更强的催化能力， 这是由于MTG较强的热稳定 性。但当底物为 CBz-Gln-Gly-Oet，CBz-Gln-Gln-Gly， CBz-Gly-Gln-Gly-Gly时，MTG酶活则低于GTG活性。GTG分子量约为MTG的2倍，且活性 依赖于Ca2+，而MTG的活性则不依赖于Ca2+，但二者活性中心均包括Cys残基。 MTG 是一种胞外酶，分子量在 40 kD 左右，活性中心包含一个游离的 Cys 巯基，与 GTG 相比，MTG 表现出很多优势： (1)对钙离子的非依赖性； (2)对热和 pH 的稳定性；

(3)易贮存性。发酵液经离心和过滤后的滤液在20℃下可以贮存几个月,而酶活性仅 损失10%。经过纯化的酶则更加稳定 (二)谷氨酰胺转胺酶的作用机理 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶,其作用特点如图7-1-1所示 R一Gu-CO-NH2+NH2-R→R-Gu-CO-NH-R+NH R-Gu-CO-NH2+ NH2-Lys-R)R-Gu-CO-NH-Lys-R+Nh: R-Glu-CO-NH2+H.OH-R-Glu-CO-OH+NH 图7 TG的作用特点 TG以肽链中谷氨酰胺残基的y-羧酰胺基作为酰基供体,而酰基受体可以是: (1)伯胺基。形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接(图7-1-1a,利用该反应可以将 一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值 (2)多肽链中赖氨酸残基的g氨基。形成蛋白质分子内和分子间的εγ-谷氨酰)赖氨酸异 肽键(图7-1-1b),使蛋白质分子发生交联,从而改变食物的质地和结构,改善蛋白质的溶 解性、起泡性、乳化性等许多物理性质; (3)水。当不存在伯胺时,水会成为酰基受体,其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷 氨酸残基(图7-1-lc),该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 利用这些催化反应,在各种蛋白质分子之间或者内部引起共价交联,就可以对各种食 品蛋白质进行改性。 三、谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用 TG不仅可以催化同种蛋白质之间的交联,还能催化不同蛋白质之间的交联。由于各种 蛋白质的氨基酸组成互不相同,因而不同的蛋白质中的限制性氨基酸不一定相同,通过TG 将它们连接起来,可以实现优势互补,提高蛋白质的营养价值。除此之外,TG作用于蛋白 质后,还会明显改善蛋白质的溶解性、对酸稳定性、发泡性、乳化性和乳化稳定性等性质 另外,在蛋白质食品体系中,TG的耐热稳定性可大大提高,在一般的食品加工过程中,它 不会因为热处理而迅速失活。TG在食品加工中的作用主要有 (1)保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应; (2)提高蛋白质的营养性 (3)包埋脂类或脂溶性物质; (4)形成耐热耐水性的膜 (5)提高食品的弹性和持水能力等 目前,TG已广泛应用于食品工业,其主要应用如表7-1-1所示

2 (3)易贮存性。发酵液经离心和过滤后的滤液在-20℃下可以贮存几个月，而酶活性仅 损失 10%。经过纯化的酶则更加稳定。 (二)谷氨酰胺转胺酶的作用机理 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，其作用特点如图7-1-1所示。 a: R Glu CO NH NH R R Glu CO NH R NH b: R Glu CO NH NH Lys R R Glu CO NH Lys R NH c: R Glu CO NH H OH R Glu CO OH NH 2 2 ' ' 3 2 2 ' ' 3 2 3 − − − + − → − − − − + − − − + − − → − − − − − + − − − + • → − − − + 图7-1-1 TG的作用特点 TG 以肽链中谷氨酰胺残基的-羧酰胺基作为酰基供体，而酰基受体可以是： (1)伯胺基。形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接(图 7-1-1a)，利用该反应可以将 一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值； (2)多肽链中赖氨酸残基的-氨基。形成蛋白质分子内和分子间的-(-谷氨酰)赖氨酸异 肽键(图 7-1-1b)，使蛋白质分子发生交联，从而改变食物的质地和结构，改善蛋白质的溶 解性、起泡性、乳化性等许多物理性质； (3)水。当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷 氨酸残基(图 7-1-1c)，该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 利用这些催化反应，在各种蛋白质分子之间或者内部引起共价交联，就可以对各种食 品蛋白质进行改性。 三、谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用 TG不仅可以催化同种蛋白质之间的交联，还能催化不同蛋白质之间的交联。由于各种 蛋白质的氨基酸组成互不相同，因而不同的蛋白质中的限制性氨基酸不一定相同，通过TG 将它们连接起来，可以实现优势互补，提高蛋白质的营养价值。除此之外，TG作用于蛋白 质后，还会明显改善蛋白质的溶解性、对酸稳定性、发泡性、乳化性和乳化稳定性等性质。 另外，在蛋白质食品体系中，TG的耐热稳定性可大大提高，在一般的食品加工过程中，它 不会因为热处理而迅速失活。TG在食品加工中的作用主要有： (1)保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应； (2)提高蛋白质的营养性； (3)包埋脂类或脂溶性物质； (4)形成耐热耐水性的膜； (5)提高食品的弹性和持水能力等。 目前，TG 已广泛应用于食品工业，其主要应用如表 7-1-1 所示

表7-1-1TG在食品工业中的应用概览 产品 作用 肉 肉包 提高弹性、质地、口味及风味 罐装肉 良好的质地和外观 冻肉 改善质地,降低成本 模型肉 对肉进行改型再塑造 浸渍肉 改善肉的风味以及使贮藏期增长 鱼肉泥 提高质地和外观 碎鱼产品 明显增加凝胶强度 Krill Kri肉泥 改善质地 骨胶原 鱼翅模拟 美味食品模拟 小麦 焙烤食品 改善质地,增大体积 大豆 麻婆豆腐 贮藏期增长 煎豆腐 改善质地,贮藏期增长 蔬菜水果矿物质吸收促进剂改善肠道中矿物质吸收 胶 交联蛋白质 降低过敏性 甜食 良好质地、弹性和低热量 化妆品、药物 良好的凝胶性质及粘性 脂肪、油、蛋白质固体脂肪 良好的质地、口味、风味的猪肉替代物 植物蛋白 蛋白粉 形成具有良好质地及口味的冻胶 调味品 调味品 改善口味和风味 蛋白质冻胶蛋白质冻胶 改善强度 米 粘米饭 增加粘度并在贮藏中保持原有口味和质地 牛奶蛋白 牛奶 粘性增加 脆性甜点 脆性甜点 防止软化 四、谷氨酰胺转胺酶的生 生产TG的方法主要有:(1)从动植物组织中提取,(2)微生物发酵法生产。不同来源的 谷氨酰胺转胺酶的生产过程如图7-1-2所示。 (一)从动植物组织中提取谷氨酰胺转胺酶 Folk等人在动植物组织中发现谷氨酰胺转胺酶,并通过离子交换、过滤、层析等分离 纯化过程得到纯化了230倍的谷氨酰胺转胺酶。此后,不少研究者对来自动物体(主要是豚 鼠肝脏)的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。豚鼠肝脏是近三十 年来商用谷氨酰胺转胺酶的唯一来源,由于酶的来源稀有、分离纯化工艺复杂,导致酶的 售价较高(大约每个酶单位80USD)。来自植物依豌豆种子、羽扇豆种子)的TG的分离纯化 工艺则还不成熟。由此可见,来自动物、植物中的TG很难应用于食品工业

3 表7-1-1 TG在食品工业中的应用概览 来源 产品 作用 肉 肉包 罐装肉 冻肉 模型肉 浸渍肉 提高弹性、质地、口味及风味 良好的质地和外观 改善质地，降低成本 对肉进行改型再塑造 改善肉的风味以及使贮藏期增长 鱼 鱼肉泥 碎鱼产品 提高质地和外观 明显增加凝胶强度 Krill Krill肉泥 改善质地 骨胶原 小麦 鱼翅模拟 焙烤食品 美味食品模拟 改善质地，增大体积 大豆 麻婆豆腐 煎豆腐 贮藏期增长 改善质地，贮藏期增长 蔬菜.水果 矿物质吸收促进剂 改善肠道中矿物质吸收 胶 交联蛋白质 甜食 化妆品、药物 降低过敏性 良好质地、弹性和低热量 良好的凝胶性质及粘性 脂肪、油、蛋白质 固体脂肪 良好的质地、口味、风味的猪肉替代物 植物蛋白 蛋白粉 形成具有良好质地及口味的冻胶 调味品 调味品 改善口味和风味 蛋白质冻胶 蛋白质冻胶 改善强度 米 粘米饭 增加粘度并在贮藏中保持原有口味和质地 牛奶蛋白 牛奶 粘性增加 脆性甜点 脆性甜点 防止软化 四、谷氨酰胺转胺酶的生产 生产TG的方法主要有：(1)从动植物组织中提取，(2)微生物发酵法生产。不同来源的 谷氨酰胺转胺酶的生产过程如图7-1-2所示。 (一)从动植物组织中提取谷氨酰胺转胺酶 Folk等人在动植物组织中发现谷氨酰胺转胺酶，并通过离子交换、过滤、层析等分离 纯化过程得到纯化了230倍的谷氨酰胺转胺酶。此后，不少研究者对来自动物体(主要是豚 鼠肝脏)的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。豚鼠肝脏是近三十 年来商用谷氨酰胺转胺酶的唯一来源，由于酶的来源稀有、分离纯化工艺复杂，导致酶的 售价较高(大约每个酶单位80 USD)。来自植物体(豌豆种子、羽扇豆种子)的TG的分离纯化 工艺则还不成熟。由此可见，来自动物、植物中的TG很难应用于食品工业

豚鼠肝脏植物组织鱼组织 微生物组织 离心 第二次离心层析 离子交 过滤转谷氨酰胶酶 透析 转谷氨酰胺酶离子交换 ( Falcone等人,199)层析 季铵乙基一交联 ( Gerber等人199凝胶过滤 葡聚糖,离子交换 透析 层析 转谷氨酰胺酶 羟基磷灰石 (Ando等人1989) 转谷氨酰胺酶 等人1994) 亲和力层析 转谷氨酰胺酶 Brookhart等人,1983) 图7-1-2来源不同的TG的生产过程 (二)微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶 1989年,Ando和 Motoki等人报道了用微生物发酵法生产出TG。他们筛选了5000株菌 株,经过大量实验与分析发现 Streptoverticillium griseocaneun,S. cInnamonen和S. mobargense 能够分泌这种酶。生产τG的发酵过程在原理上和通常的微生物发酵法一样,以葡萄糖、蔗 糖、淀粉等为碳源,以无机或有机氮为氮源:辅之以适量的矿物质与微量元素及非离子型 表面活性剂。整个发酵过程为好氧发酵,因此必须通氧并进行适当的搅拌。微生物生长和 产物形成的温度在25~35℃之间,发酵时间则由培养条件及TG达到的最高酶活所决定, 般在2~4 do ando和 Motoki等人生产MIG的过程是:先将微生物接种在100mL培养基中 pH7.0,30℃下培养48h,然后将种子液接入20L的新鲜发酵培养基中,通气量为10Lmin 转速为250r/min,30℃下培养3d,发酵液酶活可达到0.28~250u/mL。吴解温等人筛选 出菌株S. ladakanun,在25~28℃,100~150r/min的培养条件下,接入103~104 cfu/mL的 种子,培养4d后,MIG酶活达到最高。若加入2mg/的抗生素 Colistin,则产率可以提高 30%,MIG酶活达到2.1umL。除了上面介绍的两种方法外, Washizu等人和 Takehana等人 还利用基因克隆的方法生产出TG。用这种方法生产的TG,在分子量大小和免疫性方面与 MIG相似,但其酶活较低 (三MIG的分离纯化 MIG是一种胞外酶,因此,分离纯化工艺与其它胞外酶的提取过程相似。发酵结束 后,先对发酵液进行离心分离,除去菌体,然后对上清液进行处理,则可得到酶制剂产品 应用于其它酶处理过程的技术,如离子交换、色谱、纸层析、超滤等也可用于TG的处理纯 化

4 豚鼠肝脏 均化 离心 第二次离心 过滤 季铵乙基-交联 葡聚糖,离子交换 羟基磷灰石 吸咐 亲和力层析 转谷氨酰胺酶 (Brokhart 等人,1983) 植物组织 抽提 离心 层析 (Falcone 等人,1993) 鱼组织 均化 离心 过滤 层析 转谷氨酰胺酶 透析 层析 透析 层析 转谷氨酰胺酶 (Yasueda 等人1994) 微生物组织 发酵 离心 离子交换 超滤 凝胶过滤 离子交换 转谷氨酰胺酶 (Ando 等人1989) (Gerber等人1994) 转谷氨酰胺酶 过滤 过滤 图7-1-2 来源不同的TG的生产过程 (二)微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶 1989年，Ando和Motoki等人报道了用微生物发酵法生产出TG。他们筛选了5000株菌 株，经过大量实验与分析发现Streptoverticillium griseocaneun，S. cinnamonen和S. mobaraense 能够分泌这种酶。生产TG的发酵过程在原理上和通常的微生物发酵法一样，以葡萄糖、蔗 糖、淀粉等为碳源，以无机或有机氮为氮源；辅之以适量的矿物质与微量元素及非离子型 表面活性剂。整个发酵过程为好氧发酵，因此必须通氧并进行适当的搅拌。微生物生长和 产物形成的温度在25～35℃之间，发酵时间则由培养条件及TG达到的最高酶活所决定，一 般在2～4 d。Ando和Motoki等人生产MTG的过程是∶先将微生物接种在100 mL 培养基中， pH 7.0，30 ℃下培养48 h，然后将种子液接入20 L的新鲜发酵培养基中，通气量为10 L/min， 转速为250 r/min，30℃下培养3 d，发酵液酶活可达到 0.28～2.50 u/mL。吴解温等人筛选 出菌株S. ladakanum，在25～28℃，100～150 r/min的培养条件下，接入103～104 cfu/mL 的 种子，培养4 d后，MTG酶活达到最高。若加入2 mg/L的抗生素Colistin，则产率可以提高 30%，MTG酶活达到2.1 u/mL。除了上面介绍的两种方法外，Washizu等人和Takehana等人 还利用基因克隆的方法生产出TG。用这种方法生产的TG，在分子量大小和免疫性方面与 MTG相似，但其酶活较低。 (三)MTG 的分离纯化 MTG是一种胞外酶，因此，分离纯化工艺与其它胞外酶的提取过程相似。发酵结束 后，先对发酵液进行离心分离，除去菌体，然后对上清液进行处理，则可得到酶制剂产品。 应用于其它酶处理过程的技术，如离子交换、色谱、纸层析、超滤等也可用于TG的处理纯 化

五、谷氨酰胺转胺酶生产过程中存在的问题 如前所述,为解决发展中国家人们由于缺乏蛋白质而造成的营养不良问题以及发达国 家人们由于摄入动物蛋白质过多而引起的营养过剩问题,用酶特别是谷氨酰胺转胺酶对蛋 白质进行改性成为最有希望和前途的方法之一。商业用TG价格较为昂贵,而MIG则是 从廉价的底物进行发酵生产获得,因此越来越引起人们的重视。但由于发酵法生产MIC 的发展历史较短,到目前为止,对发酵法生产MTrG的过程优化及控制的研究报道较少 报道的MIG酶活也较低(<3.0umL),因此,尚存在如下一些问题需要解决 (1)原料。由于原料成本是生产成本的重要部分,开发可以利用价格低廉的原料(包括 各级放大种子所用的原料)是一个重要的应用研究课题 (2)发酵过程操作与发酵环境条件。pH值和温度是两个重要的环境条件,对细胞的生 长繁殖以及发酵产酶都有密切关系。在不同的阶段,细胞生长繁殖和发酵产酶的最适pH 值和温度并不相同,pH值和温度如何影响MIG发酵的过程和结果,已有的研究并没有关 于这方面的报道。因此,为了获得较高的MIG酶活及生产强度,有必要对pH值和温度 进行较为细致的探讨。 (3)发酵过程的搅拌及溶氧浓度。对于丝状菌发酵来说,搅拌在发酵过程中主要有以下 作用:一为混合作用,维持发酵液中有足够的溶氧,并使发酵液中的各营养基质混合均匀, 有利于细胞的吸收和利用;二为剪切作用:一方面搅拌能减少气泡周围及菌丝表面的液膜 厚度,有利于氧的传递,加速营养基质和溶氧进入菌球内部的速率,另一方面搅拌还可以 避免菌丝结成较大的团块。发酵过程中的搅拌作用对菌丝球尺寸的影响,会间接地影响菌 球内氧及基质的消耗,从而影响酶的合成,MrG发酵液具有较强的拟塑性流体特征,搅 拌及溶氧浓度对MIG发酵过程有何种影响尚未见报道。 4)菌丝球形成过程及工程特性研究。霉菌、放线菌是生产抗生素,酶制剂、有机酸等 发酵产品的十分有用的菌群。采用这些菌进行液体通风培养时,常常会出现有些菌除了产 生菌丝状(pulp)形态外,还会产生一种菌球体状(pelt)的形态。最近国内外报道黑曲霉的柠 檬酸发酵,土曲霉的衣康酸发酵等都是以菌球体方式进行的,并且发现发酵过程中形成的 菌球体越多,越小,产量越高。S. mobargense是一种丝状菌,在MIG发酵过程中,实验 观察到发酵液中也存在菌丝状及菌球体状形态,且菌球的大小直接影响MTG酶活。因此 有必要研究菌球大小与产酶水平之间的关系。 (5)MTG合成氨基酸的代谢流分析。MIG是由31个氨基酸残基构成的单多肽链 中各种氨基酸的组成差异较大,在酶合成过程中对各种氨基酸的需求也不一样。研 究S. mobargense发酵合成MrG过程中的氨基酸代谢流分布,尤其是对氨基酸的变化原因 进行较详细的分析,可望找出MTG合成过程中关键的控制点,从根本上提高MIG酶活。 六、本章主要内容 (1)以茂原链轮丝菌( Streptoverticillium mobaraense )WSH-Z2为生产菌株,对影响S mobargens菌体生长和MTG合成的一些重要环境因子进行定量的考察,确定微生物的生 理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系; (2)在小型发酵罐上考察控制不同pH值及温度对MTG发酵的影响,通过对细胞比生 长速率、MIG比合成速率的变化进行研究,得出最适pH值及温度控制策略;用统计热力 学理论对pH值影响细胞生长及产酶进行理论分析,建立p影响细胞生长及产酶的模型

5 五、谷氨酰胺转胺酶生产过程中存在的问题 如前所述，为解决发展中国家人们由于缺乏蛋白质而造成的营养不良问题以及发达国 家人们由于摄入动物蛋白质过多而引起的营养过剩问题，用酶特别是谷氨酰胺转胺酶对蛋 白质进行改性成为最有希望和前途的方法之一。商业用 TG 价格较为昂贵，而 MTG 则是 从廉价的底物进行发酵生产获得，因此越来越引起人们的重视。但由于发酵法生产 MTG 的发展历史较短，到目前为止，对发酵法生产 MTG 的过程优化及控制的研究报道较少， 报道的 MTG 酶活也较低(<3.0 u/mL)，因此，尚存在如下一些问题需要解决。 (1)原料。由于原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉的原料(包括 各级放大种子所用的原料)是一个重要的应用研究课题。 (2)发酵过程操作与发酵环境条件。pH 值和温度是两个重要的环境条件，对细胞的生 长繁殖以及发酵产酶都有密切关系。在不同的阶段，细胞生长繁殖和发酵产酶的最适 pH 值和温度并不相同，pH 值和温度如何影响 MTG 发酵的过程和结果，已有的研究并没有关 于这方面的报道。因此，为了获得较高的 MTG 酶活及生产强度，有必要对 pH 值和温度 进行较为细致的探讨。 (3)发酵过程的搅拌及溶氧浓度。对于丝状菌发酵来说，搅拌在发酵过程中主要有以下 作用：一为混合作用，维持发酵液中有足够的溶氧，并使发酵液中的各营养基质混合均匀， 有利于细胞的吸收和利用；二为剪切作用∶一方面搅拌能减少气泡周围及菌丝表面的液膜 厚度，有利于氧的传递，加速营养基质和溶氧进入菌球内部的速率，另一方面搅拌还可以 避免菌丝结成较大的团块。发酵过程中的搅拌作用对菌丝球尺寸的影响，会间接地影响菌 球内氧及基质的消耗，从而影响酶的合成，MTG 发酵液具有较强的拟塑性流体特征，搅 拌及溶氧浓度对 MTG 发酵过程有何种影响尚未见报道。 (4)菌丝球形成过程及工程特性研究。霉菌、放线菌是生产抗生素，酶制剂、有机酸等 发酵产品的十分有用的菌群。采用这些菌进行液体通风培养时，常常会出现有些菌除了产 生菌丝状(pulp)形态外，还会产生一种菌球体状(pellet)的形态。最近国内外报道黑曲霉的柠 檬酸发酵，土曲霉的衣康酸发酵等都是以菌球体方式进行的，并且发现发酵过程中形成的 菌球体越多，越小，产量越高。S. mobaraense 是一种丝状菌，在 MTG 发酵过程中，实验 观察到发酵液中也存在菌丝状及菌球体状形态，且菌球的大小直接影响 MTG 酶活。因此 有必要研究菌球大小与产酶水平之间的关系。 (5)MTG 合成氨基酸的代谢流分析。MTG 是由 331 个氨基酸残基构成的单多肽链， MTG 中各种氨基酸的组成差异较大，在酶合成过程中对各种氨基酸的需求也不一样。研 究 S. mobaraense 发酵合成 MTG 过程中的氨基酸代谢流分布，尤其是对氨基酸的变化原因 进行较详细的分析，可望找出 MTG 合成过程中关键的控制点，从根本上提高 MTG 酶活。 六、本章主要内容 (1)以茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)WSH-Z2 为生产菌株，对影响 S. mobaraens 菌体生长和 MTG 合成的一些重要环境因子进行定量的考察，确定微生物的生 理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系； (2)在小型发酵罐上考察控制不同 pH 值及温度对 MTG 发酵的影响，通过对细胞比生 长速率、MTG 比合成速率的变化进行研究，得出最适 pH 值及温度控制策略；用统计热力 学理论对 pH 值影响细胞生长及产酶进行理论分析，建立 pH 影响细胞生长及产酶的模型

并就温度对细胞生长及产酶影响开展模型化研究 (3)探讨MTG发酵过程的搅拌及溶氧浓度对细胞生长及产酶的影响,并考察MTG发 酵体系的流变学特性、搅拌功率的计算、混合和传氧系数等,为MIG工业化生产时反应 器的设计选型提供依据,最后提出MIG发酵生产的搅拌及溶氧浓度控制策略 (4考察MG发酵过程中影响菌丝球增殖形态的诸多因素,深入探讨菌丝球増殖形态 与产酶之间的关系,确定产酶的最适菌丝球大小,并提出控制最适菌丝球大小的策略。进 而提出菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论,把菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的 理论应用于实际生产过程中; (5)根据MIG的合成途径,通过质、能衡算和解析,计算主要物质的代谢流分布,确 定S. mobargense细胞培养过程的营养要求;通过对MrG的组成氨基酸水平的跟踪检测, 确定MIG发酵过程中的关键控制点,为补料优化控制提供重要依据 (6考察生产菌种对廉价底物的利用能力,并在小罐中研究淀粉的预处理对MrG发酵 结果的影响,然后根据体积传氧系数相等的准则,将MTG发酵由5L罐逐级放大到300L 罐,为实现发酵法生产MIG的工业化奠定基础

6 并就温度对细胞生长及产酶影响开展模型化研究； (3)探讨 MTG 发酵过程的搅拌及溶氧浓度对细胞生长及产酶的影响，并考察 MTG 发 酵体系的流变学特性、搅拌功率的计算、混合和传氧系数等，为 MTG 工业化生产时反应 器的设计选型提供依据，最后提出 MTG 发酵生产的搅拌及溶氧浓度控制策略； (4)考察 MTG 发酵过程中影响菌丝球增殖形态的诸多因素，深入探讨菌丝球增殖形态 与产酶之间的关系，确定产酶的最适菌丝球大小，并提出控制最适菌丝球大小的策略。进 而提出菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论，把菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的 理论应用于实际生产过程中； (5)根据 MTG 的合成途径，通过质、能衡算和解析，计算主要物质的代谢流分布，确 定 S. mobaraense 细胞培养过程的营养要求；通过对 MTG 的组成氨基酸水平的跟踪检测， 确定 MTG 发酵过程中的关键控制点，为补料优化控制提供重要依据； (6)考察生产菌种对廉价底物的利用能力，并在小罐中研究淀粉的预处理对 MTG 发酵 结果的影响，然后根据体积传氧系数相等的准则，将 MTG 发酵由 5L 罐逐级放大到 300 L 罐，为实现发酵法生产 MTG 的工业化奠定基础

第二节谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 引言 20世纪80年代末,Ando和 Motoki等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺 转胺酶的方法,其中Ando等人从5000株左右的菌株中发现S. mobargense等能够生产这 种酶。近年来,国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究,并使之应用于食品 工业,而国内有关这方面的研究报道目前还比较少 影响细胞产酶的因素不是孤立的,而是互相联系,相互制约的。通常,菌种的生长与 产酶未必同步,产酶量也并不完全与微生物生长的程度成正比。为了使菌体最大限度地产 酶,除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的培养基外,还应当为菌种在各个生理时期创 造不同的培养环境,如pH值,温度,溶氧等。因此,首先考察了部分环境及营养条件对 MIG摇瓶发酵的影响。 、种子生长过程曲线及种龄的确定 种子生长过程曲线如图72-1所示。可以看出,20h后细胞生长速率明显加快,在44h 后细胞干重开始下降,表明S. mobargense对数生长期为20~44h 16 图7-2-1茂原链轮丝菌的种子生长过程曲线 为了获得最佳的种龄,采用不同种龄的种子进行摇瓶发酵试验,结果如表7-2-1所示 可以看出,用40h种龄的种子进行发酵所获得菌体干重及酶活均达到最大。镜检发现,此 时的种子菌丝粗壮,且无自溶,表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40h 表7-2-1种龄对MIG发酵的影响 种龄/h 36 40 MTG酶活/umL 1.501.841.64 细胞干重/g 12.612.912.6 剩余淀粉浓度/gL 三、环境条件对MTIG摇瓶发酵过程的影响 (一)初始pH值对菌体生长和MG合成的影响 如表7-22所示。在初始pH值为7.0时,细胞干重和MTG酶活均达到了最大值,分别为 12.3g/L和160umL

7 第二节 谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 一、引言 20 世纪 80 年代末，Ando 和 Motoki 等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺 转胺酶的方法，其中 Ando 等人从 5000 株左右的菌株中发现 S. mobaraense 等能够生产这 种酶。近年来，国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究，并使之应用于食品 工业，而国内有关这方面的研究报道目前还比较少。 影响细胞产酶的因素不是孤立的，而是互相联系，相互制约的。通常，菌种的生长与 产酶未必同步，产酶量也并不完全与微生物生长的程度成正比。为了使菌体最大限度地产 酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创 造不同的培养环境，如pH值，温度，溶氧等。因此，首先考察了部分环境及营养条件对 MTG摇瓶发酵的影响。 二、种子生长过程曲线及种龄的确定 种子生长过程曲线如图7-2-1所示。可以看出，20 h后细胞生长速率明显加快，在44 h 后细胞干重开始下降，表明S. mobaraense的对数生长期为2044 h。 t/h (DCW)/g L-1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 图7-2-1 茂原链轮丝菌的种子生长过程曲线 为了获得最佳的种龄，采用不同种龄的种子进行摇瓶发酵试验，结果如表7-2-1所示。 可以看出，用40 h种龄的种子进行发酵所获得菌体干重及酶活均达到最大。镜检发现，此 时的种子菌丝粗壮，且无自溶，表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40 h。 表 7-2-1 种龄对 MTG 发酵的影响 种龄 / h 36 40 44 MTG酶活/ umL-1 1.50 1.84 1.64 细胞干重 / gL -1 12.6 12.9 12.6 剩余淀粉浓度 / gL -1 3.9 4.7 5.3 三、环境条件对 MTG 摇瓶发酵过程的影响 (一)初始 pH 值对菌体生长和 MTG 合成的影响 如表7-2-2所示。在初始pH值为7.0时，细胞干重和MTG酶活均达到了最大值，分别为 12.3 g/L和1.60 u/mL

表7-2-2pH对菌体生长和MIG酶活的影响 初始pH细胞干重剩余淀粉浓度MG酶活 /g 10.6 6.3 l13 147 12.0 19 6.7 l1.6 1.8 158 7.0 2.0 1.60 1.0 143 (二)温度对菌体生长及MIG酶活的影响 见表7-2-3。可以看出,当温度为30℃时,最适合于细胞生长和产酶,此时细胞干重及 MIG酶活均最高,达到13.2g/L及1.72u/mL 表7-2-3温度对菌体生长和MIG酶活的影响 温度细胞干重剩余淀粉浓度MIG酶活 /gL /gL 10.6 14 1.26 1.08 (三)接种量对菌体生长和MG合成的影响 接种量对细胞生长和MG合成的影响见表7-2-4。较适宜的接种量为5-20%(v/) 表7-2-4接种量对菌体生长和MIG酶活的影响 接种量细胞干重剩余淀粉浓度MIG酶活 /%(V/v)/gL1 /g L /u. mL-I 11.0 116 1.8 13.3 13 (四)装液量对MIG合成的影响 500mL三角瓶中不同装液量对MTG发酵的影响如表7-2-5所示。装液量从30mL提高到 100mL后,酶活增加了35%装液量为100mL时,酶活最高为187u/mL,也比装液量为140 mL时的酶活高出30%。由此可见,500mL三角瓶较适宜的装液量为100mL 表7-2-5装液量对MTG发酵的影响 体积/mL 100140 MTG酶活/umL11.371.541681.871.40 细胞干重/gL 2.812.012412.812 剩余淀粉浓度/gL4048464952 四、营养条件对MTrG发酵过程的影响

8 表 7-2-2 pH 对菌体生长和 MTG 酶活的影响 初始pH 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 6.0 10.6 2.4 1.36 6.3 11.3 1.5 1.47 6.5 12.0 1.9 1.55 6.7 11.6 1.8 1.58 7.0 12.3 2.0 1.60 7.3 11.0 1.7 1.43 (二)温度对菌体生长及 MTG 酶活的影响 见表7-2-3。可以看出，当温度为30℃时，最适合于细胞生长和产酶，此时细胞干重及 MTG酶活均最高，达到13.2 g/L及1.72 u/mL。 表 7-2-3 温度对菌体生长和 MTG 酶活的影响 温度 /℃ 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 25 8.2 3.5 0.82 28 10.6 2.8 1.14 30 13.2 1.4 1.72 32 12.4 2.0 1.26 35 11.6 2.7 1.08 (三)接种量对菌体生长和 MTG 合成的影响 接种量对细胞生长和MTG合成的影响见表7-2-4。较适宜的接种量为520%(v/v)。 表 7-2-4 接种量对菌体生长和 MTG 酶活的影响 接种量 / %(v/v) 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 2 10.2 2.5 0.82 5 11.0 2.1 1.45 10 11.6 1.8 1.54 15 12.5 1.7 1.59 20 13.3 1.3 1.68 (四)装液量对 MTG 合成的影响 500 mL三角瓶中不同装液量对MTG发酵的影响如表7-2-5所示。装液量从30 mL提高到 100 mL后，酶活增加了35%。装液量为100 mL时，酶活最高为1.87 u/mL，也比装液量为140 mL时的酶活高出30%。由此可见，500 mL三角瓶较适宜的装液量为100 mL。 表 7-2-5 装液量对 MTG 发酵的影响 体积 / mL 30 50 80 100 140 MTG酶活/ umL-1 1.37 1.54 1.68 1.87 1.40 细胞干重/gL -1 12.8 12.0 12.4 12.8 12.1 剩余淀粉浓度/gL -1 4.0 4.8 4.6 4.9 5.2 四、营养条件对 MTG 发酵过程的影响

(一)不同碳源种类对MIG发酵的影响 分别采用可溶性淀粉、葡萄糖、变性淀粉进行MrG的摇瓶发酵,结果如表7-2-6所示 可以看出,可溶性淀粉为合适的碳源 表7-2-6碳源种类对MTG发酵的影响 细胞干重剩余淀粉浓度MTG酶活 碳源 /g L 可溶性淀粉 12.9 4.7 葡萄糖 12.4 变性淙料乙酰基马铃薯淀粉 11.5 羟丙基淀粉 9.7 0.72 (二)初始淀粉浓度对MIG发酵的影响 以可溶性淀粉为碳源,比较了不同初始淀粉浓度对MIG发酵过程中菌体生长和产物 合成的影响(表7-2-7)。初始淀粉浓度20gL较为适宜。 表7-2-7初始淀粉浓度对菌体生长和MIG酶活的影响 初始淀粉浓度细胞干重剩余淀粉浓度 MTG酶活 /gL- /g-L- /umL- 12.3 1.9 43.0 0.75 (三)蛋白胨种类对MTG发酵的影响 蛋白胨是提供MTG发酵过程中菌体生长和产物合成所需氨基酸的重要有机氮源。由于 蛋白胨处理工艺的不同可能会影响其氨基酸组成,进而影响MTG发酵,因此,考察了不同 种类的蛋白胨对MIG发酵的影响(表7-2-8)。 表7-2-8蛋白胨种类对MTG发酵的影响 蛋白胨 蛋白胨 类型 (细菌F403)(生化试剂胰蛋白胨 细胞干重/gL 12.6 剩余淀粉浓度/gL 3.9 4.7 5.3 MIG酶活/mL1 00 78 04 从表7-2-8中可以看出,不同种类的蛋白胨对菌体生长影响不大,但对酶活影响显著 相对而言,生化试剂蛋白胨比较适于合成MTG (四)蛋白胨浓度对MIG发酵的影响 以生化试剂蛋白胨为氮源,考察了蛋白胨浓度对MTG发酵的影响,结果见表7-2-9。 可以看出其适宜用量为20gL

9 (一)不同碳源种类对 MTG 发酵的影响 分别采用可溶性淀粉、葡萄糖、变性淀粉进行MTG的摇瓶发酵，结果如表7-2-6所示。 可以看出，可溶性淀粉为合适的碳源。 表 7-2-6 碳源种类对 MTG 发酵的影响 碳源 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 可溶性淀粉 12.9 4.7 1.84 葡萄糖 12.4 9.0 1.63 变性淀粉 乙酰基马铃薯淀粉 11.5 0.86 5.1 羟丙基淀粉 9.7 0.72 10.4 (二)初始淀粉浓度对 MTG 发酵的影响 以可溶性淀粉为碳源，比较了不同初始淀粉浓度对MTG发酵过程中菌体生长和产物 合成的影响(表7-2-7)。初始淀粉浓度20 g/L较为适宜。 表 7-2-7 初始淀粉浓度对菌体生长和 MTG 酶活的影响 初始淀粉浓度 /gL -1 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 10 6.2 0 0.8 20 12.3 1.9 1.65 30 11.9 12.3 1.58 40 11.3 21.4 1.23 50 10.7 31.7 0.98 60 10.2 43.0 0.75 (三)蛋白胨种类对 MTG 发酵的影响 蛋白胨是提供MTG发酵过程中菌体生长和产物合成所需氨基酸的重要有机氮源。由于 蛋白胨处理工艺的不同可能会影响其氨基酸组成，进而影响MTG发酵，因此，考察了不同 种类的蛋白胨对MTG发酵的影响(表7-2-8)。 表 7-2-8 蛋白胨种类对 MTG 发酵的影响 类型 蛋白胨 (细菌F403) 蛋白胨 (生化试剂) 胰蛋白胨 细胞干重/gL -1 12.6 12.9 12.6 剩余淀粉浓度/gL -1 3.9 4.7 5.3 MTG酶活/umL-1 1.00 1.78 1.04 从表7-2-8中可以看出，不同种类的蛋白胨对菌体生长影响不大，但对酶活影响显著。 相对而言，生化试剂蛋白胨比较适于合成MTG。 (四)蛋白胨浓度对 MTG 发酵的影响 以生化试剂蛋白胨为氮源，考察了蛋白胨浓度对MTG发酵的影响，结果见表7-2-9。 可以看出其适宜用量为20 g/L

表7-2-9蛋白胨用量对MTG发酵的影响 蛋白胨/gL1 20 MIG酶活mL 1.001851.04 细胞干重/gL 12.612.912.0 剩余淀粉浓度/gL3.94753 (五)酵母膏浓度对MIG发酵的影响 如表7-2-10所示。可见,酵母膏用量较低时菌体生长较差:用量较高时,菌体生长较 好,但酶活较低。所以较适宜的酵母膏用量为2g/L,此时MTG酶活最高185umL 表7-2-10酵母膏用量对MIG发酵的影响 酵母膏/gL123 MIG酶活/mL11.071.851.54 细胞干重/gL11.712.913.8 剩余淀粉浓度/gL1424.73.2 (六)产酶促进剂对MIG发酵的影响 产酶促进剂能增加细胞膜的通透性,从而使细胞内的酶容易透过细胞膜分泌出来,提 高酶产量。很多表面活性剂是产酶促进剂,从表72-1可以看出,不同种类的产酶促进剂 均对MTG的酶活水平均有不同程度的促进。其中,聚甘油醚最有利于产酶,MTG酶活最 高达2.12umL,比对照组提高了40%以上。 表7-2-11产酶促进剂对MTG发酵的影响 表面活性剂MIG酶活细胞干重剩余淀粉浓度 /umL- g 对照 4.8 聚山梨醇酯-80 1.75 12.8 3.2 聚甘油醚 2.12 聚乙烯醇124 13.4 6.2 (七)MrG发酵培养基组成的正交试验优化 选择对MIG发酵有较大影响的淀粉、蛋白胨及酵母膏这三个因素进行L34正交试验, 实验结果及方差分析如表72-12,7-2-13所示

10 表 7-2-9 蛋白胨用量对 MTG 发酵的影响 蛋白胨/gL -1 15 20 25 MTG酶活/umL-1 1.00 1.85 1.04 细胞干重/gL -1 12.6 12.9 12.0 剩余淀粉浓度/gL -1 3.9 4.7 5.3 (五)酵母膏浓度对 MTG 发酵的影响 如表7-2-10所示。可见，酵母膏用量较低时菌体生长较差；用量较高时，菌体生长较 好，但酶活较低。所以较适宜的酵母膏用量为2 g/L，此时MTG酶活最高1.85 u/mL。 表 7-2-10 酵母膏用量对 MTG 发酵的影响 酵母膏/gL -1 1 2 3 MTG 酶活/umL-1 1.07 1.85 1.54 细胞干重/gL -1 11.7 12.9 13.8 剩余淀粉浓度/gL -1 4.2 4.7 3.2 (六)产酶促进剂对 MTG 发酵的影响 产酶促进剂能增加细胞膜的通透性，从而使细胞内的酶容易透过细胞膜分泌出来，提 高酶产量。很多表面活性剂是产酶促进剂，从表7-2-11可以看出，不同种类的产酶促进剂 均对MTG的酶活水平均有不同程度的促进。其中，聚甘油醚最有利于产酶，MTG酶活最 高达2.12 u/mL，比对照组提高了40%以上。 表 7-2-11 产酶促进剂对 MTG 发酵的影响 表面活性剂 MTG 酶活 /umL-1 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 对照 1.64 12.0 4.8 聚山梨醇酯-80 1.75 12.8 3.2 聚甘油醚 2.12 13.2 3.7 聚乙烯醇 124 2.02 13.4 6.2 (七)MTG 发酵培养基组成的正交试验优化 选择对 MTG 发酵有较大影响的淀粉、蛋白胨及酵母膏这三个因素进行 L3 4 正交试验， 实验结果及方差分析如表 7-2-12，7-2-13 所示