第八章聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节聚羟基烷酸酯发酵概述 、PHAs的结构、物理化学性质和应用 PHAs的生物合成 三、本章主要内容 第二节真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究 引言 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化….….… 1112899947 、PHB发酵过程中理论产率的计算 第三节真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸. 、引言 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究 21 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数…… 第四节聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化. 、前言 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响 2222 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响 四、PHB分批发酵过程分析和控制 五、PHB分批发酵动力学 六、PHB分批发酵过程动力学的分析 第五节聚羟基丁酸流加发酵条件研究 、前言 氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响.40 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响….43 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响 第六节聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略 、引言 455 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究 第七节羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化 、引言 666 二、PHBⅤ摇瓶发酵条件研究 三、2L罐中PHBⅤ流加发酵过程的准优化控制
第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化...................................................................................1 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述...................................................................................1 一、PHAs的结构、物理化学性质和应用 ................................................................1 二、PHAs的生物合成 ............................................................................................2 三、本章主要内容 .................................................................................................8 第二节 真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究....................................................9 一、引言 ...............................................................................................................9 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化..................................................................9 三、PHB发酵过程中理论产率的计算....................................................................14 第三节 真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸...............17 一、引言 .............................................................................................................17 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学................................................................17 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究.............................................................21 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数...................25 第四节 聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化..................................................26 一、前言 .............................................................................................................26 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响.............................................................27 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响.............................................................29 四、PHB分批发酵过程分析和控制.......................................................................33 五、PHB分批发酵动力学.....................................................................................34 六、PHB分批发酵过程动力学的分析....................................................................38 第五节 聚羟基丁酸流加发酵条件研究.......................................................................40 一、前言 .............................................................................................................40 二、氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响.40 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 ....43 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响..................................................45 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响...............................................46 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响........................................48 第六节 聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略..................................................54 一、引言 .............................................................................................................54 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究.............................................................54 第七节 羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化..................................................67 一、引言 .............................................................................................................67 二、PHBV摇瓶发酵条件研究...............................................................................67 三、2 L罐中PHBV流加发酵过程的准优化控制 .....................................................73
第八章聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节聚羟基烷酸酯发酵概述 、PHAs的结构、物理化学性质和应用 聚羟基烷酸酯( Polyhydroxyalkoates,简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中 聚β羟基丁酸(简称PHB)及3羟基丁酸与3羟基戊酸的共聚物(简称P3HB-co-3HV)或PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯,除具有高分子 化合物的基本特性,如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外,更重要的是其还具有生 物可降解性和生物可相容性。已有研究表明,采用PHAs制作的香波瓶,在自然环境中9个月后 可基本上被完全降解,而用合成塑料制作的同样物品,完全降解的时间约需100年。因此研究 和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料,使之成为同类用途的石化合成塑料最 有潜力的替代品,对避免或减少塑料废物对环境的污染,具有深远的环境意义 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低 溶解性和高分子量,它在胞内的积累不会引起滲透压的增加,因而,它们是一类理想的胞内 贮藏物,比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成: R O O-CH-CH=C 式中R多为不同链长的正烷基,也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基。R为甲基 时,其聚合物为聚B羟基丁酸(PHB,R为乙基时,其聚合物为聚B-羟基戊酸(PHV),其它依 此类推。此外,在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物,其典型代表是3HB和3HV 组成的共聚物P(3HB-co3HV 至今为止发现的PHAs几乎都是线状的β-羟基烷酸的聚酯。β-碳原子的手性决定了这些多 聚物具有光学活性,所有的组成单位仅以R型存在。采用溶剂法从不同细菌中提取的多聚物 有些多聚物的分子量可高达2×10,对应聚合度约为2000,其理化性质和机械性能(如韧度 脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等)与单体的组成有密切的关系。例如,在PHBV共聚物 中增加β-羟基戊酸的组分可使熔点从180℃(PHB均聚物)降至75℃(PHBⅤ共聚物中HV组分为 30-40mol%)。再如,从食油假单孢菌( P oleovorans)中提取的中长链PHAs可溶于丙酮或乙醚 而PHB不能溶解。 目前大多数关于PHAs理化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是 100%立体专一性的,所有的不对称碳原子都是D(-)构型,因而PHB是高度结晶的晶体,结晶 度的范围在55~80%,其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似,例如熔点、玻璃态 温度、结晶度、抗张强度等,而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿 性和压电性等则是PHB的优点(表8-1-1)
1 第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述 一、PHAs 的结构、物理化学性质和应用 聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中 聚--羟基丁酸(简称PHB)及3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物(简称P(3HB-co-3HV)或PHBV)是 PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子 化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，更重要的是其还具有生 物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然环境中9个月后， 可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需100年。因此研究 和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料，使之成为同类用途的石化合成塑料最 有潜力的替代品，对避免或减少塑料废物对环境的污染，具有深远的环境意义。 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低 溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，因而，它们是一类理想的胞内 贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成： 2 _ _ _ R C __ O n ___ O CH CH 式中R多为不同链长的正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基。R为甲基 时，其聚合物为聚--羟基丁酸(PHB)，R为乙基时，其聚合物为聚--羟基戊酸(PHV)，其它依 此类推。此外，在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV 组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。 至今为止发现的PHAs几乎都是线状的-羟基烷酸的聚酯。-碳原子的手性决定了这些多 聚物具有光学活性，所有的组成单位仅以R型存在。采用溶剂法从不同细菌中提取的多聚物， 有些多聚物的分子量可高达2×106，对应聚合度约为20,000，其理化性质和机械性能(如韧度、 脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等)与单体的组成有密切的关系。例如，在PHBV共聚物 中增加-羟基戊酸的组分可使熔点从180 ℃(PHB均聚物)降至75 ℃(PHBV共聚物中HV组分为 30-40 mol %)。再如，从食油假单孢菌(P. oleovorans)中提取的中长链PHAs可溶于丙酮或乙醚， 而PHB不能溶解。 目前大多数关于PHAs理化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是 100 %立体专一性的，所有的不对称碳原子都是D-(-)构型，因而PHB是高度结晶的晶体，结晶 度的范围在55～80 %，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似，例如熔点、玻璃态 温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿 性和压电性等则是PHB的优点(表8-1-1)
表8-1-1PHAs和聚丙烯(PP)的性质比较 性 PHB P(3HB-Co-3HV) P(3HB-CO-4HB) P(4HB) mol%HV 25mol%HV 10mol%HB 64mol%HB 点Tm/℃ 171~186171~182162 玻璃态温度Ts/℃ 155~10 结晶度/% 65~7065~80 比重/gcm 0.905 1.24 分子量Mw/105 1-8 分子量分布 5~12 弯曲模量/GPa 3.5~4 149 抗张强度/MPa 37 断裂伸长/% 抗紫外线照射 90差好 46好差 抗溶剂 透氧率cmm2 atm"d-I17 生物降解性 不可降解可降解可降解可降解可降解可降解可降解 从表8-1-1中可见,PHB的机械性能包括弯曲模量(3.5~4GPa)和抗张强度(40MPa)与聚丙 烯相仿,但其断裂伸长仅为5%,比聚丙烯的值(400%)要低得多,因而PHB较脆和发硬,但这 可通过与适量HⅣⅤ共聚而补偿。随着PHBⅴ中HV组分的增加,聚合物的脆度降低而韧性增加 且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低,热加工性能提高。此外,单体4HIB的聚合物或3HB 与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体,且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快 PHB的工业化应用主要存在两个缺点:一是PHB的熔化稳定性较差。其分解温度约为 200℃,与其熔点相近(约175℃):二是在环境条件下贮存数日后,PHB易发脆。对第一个缺 点,可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用 来解决;而对于第二个缺点,最近的研究发现,可通过简单的退火处理来改善PHB的脆性问题 PHAs的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。PHAs这类热塑性聚酯 能纺丝、压膜或注塑,在工业上可用作各类包装材料等。在医药方面,由于其生物相容性, PHAs可作外科缝线、伤口敷料、血管替代品、长效药物的生物降解载体,骨骼代用品或骨板 等。农药工业上,PHAs可用于合成长效除莠剂、抗真菌剂或杀虫剂。PHAs还可作为合成手性 化合物的前体原料,用于合成药物和昆虫信息素等物质。 、PHAs的生物合成 (一)合成PHAs的主要微生物和基质 PHB最初是由 Lemoine于192年首先发现的,随后他从巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium) 中分离并鉴定了该物质,并阐明了该菌形成孢子时形成PHB。20世纪50年代末研究了生长条件 对PHB代谢的影响,发现PHB生成的量随着生长培养基中糖铵比的增加而增加,即PHB的积累 是在某种营养物受限制的不平衡生长条件下发生的,这是一个重要的发现。1974年,Wale 和 Rohwedder报道了从活性污泥的氯仿萃取液中测定到含3HB和其他3-羟酰基单体的杂聚物的 存在,使研究领域由PHB扩展到PHAs1983年有专利报道了微生物合成PHBV共聚物,而且 它较PHB均聚物有某些更好的特性。此后,有关PHAs的研究报道越来越多。 能产生PHAs的微生物分布极广,包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生 物。积累有PHAs的微生物能很容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的有:
2 表8-1-1 PHAs和聚丙烯(PP)的性质比较 性 质 PP PHB P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-4HB) P(4HB) 9mol%HV 25mol%HV 10mol%HB 64mol%HB 熔 点 Tm / ℃ 171～186 171～182 162 137 159 50 53 玻璃态温度Tg / ℃ -15 5～10 / / / / / 结晶度 / % 65～70 65～80 / / / / / 比重/ gcm-3 0.905 1.24 / / / / / 分子量Mw / 105 2.2～7 1-8 / / / / / 分子量分布 5～12 2.2～3 / / / / / 弯曲模量/ GPa 1.7 3.5～4 1.9 0.7 / 30 149 抗张强度/ MPa 39 40 37 30 24 17 104 断裂伸长/ % 400 6-8 / / 242 591 1000 抗紫外线照射 差 好 / / / / / 抗溶剂 好 差 / / / / / 透氧率/cm3m -2 atm-1 d -1 1700 45 / / / / / 生物降解性 不可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 从表8-1-1中可见，PHB的机械性能包括弯曲模量(3.5～4 GPa)和抗张强度(40 MPa)与聚丙 烯相仿，但其断裂伸长仅为5 %，比聚丙烯的值(400 %)要低得多，因而PHB较脆和发硬，但这 可通过与适量HV共聚而补偿。随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的脆度降低而韧性增加， 且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，热加工性能提高。此外，单体4HB的聚合物或3HB 与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。 PHB的工业化应用主要存在两个缺点：一是PHB的熔化稳定性较差。其分解温度约为 200 ℃，与其熔点相近(约175 ℃)；二是在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。对第一个缺 点，可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用 来解决；而对于第二个缺点，最近的研究发现，可通过简单的退火处理来改善PHB的脆性问题。 PHAs的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。PHAs这类热塑性聚酯 能纺丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等。在医药方面，由于其生物相容性， PHAs可作外科缝线、伤口敷料、血管替代品、长效药物的生物降解载体，骨骼代用品或骨板 等。农药工业上，PHAs可用于合成长效除莠剂、抗真菌剂或杀虫剂。PHAs还可作为合成手性 化合物的前体原料，用于合成药物和昆虫信息素等物质。 二、PHAs 的生物合成 (一)合成 PHAs 的主要微生物和基质 PHB最初是由Lemoigne于1925年首先发现的，随后他从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 中分离并鉴定了该物质，并阐明了该菌形成孢子时形成PHB。20世纪50年代末研究了生长条件 对PHB代谢的影响，发现PHB生成的量随着生长培养基中糖铵比的增加而增加，即PHB的积累 是在某种营养物受限制的不平衡生长条件下发生的，这是一个重要的发现。1974年，Wallen 和Rohwedder报道了从活性污泥的氯仿萃取液中测定到含3HB和其他3-羟酰基单体的杂聚物的 存在，使研究领域由PHB扩展到PHAs。1983年有专利报道了微生物合成PHBV共聚物，而且 它较PHB均聚物有某些更好的特性。此后，有关PHAs的研究报道越来越多。 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生 物。积累有PHAs的微生物能很容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的有：
产碱杆菌属( Ralstonia),假单胞菌属( Pseudonomas),甲基营养菌( Methylotrophs),固氮菌属 ( Azotobacter)和红螺菌属( Rhodospirillum)等,它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAs 早期研究真养产碱杆菌(R. eutrophus)中PHB代谢的主要目的在于将PHB消除以便利用该 菌生产单细胞蛋白,后来才转向PHAs的生物合成和积累的研究。兼性化能自养型细菌在一定 的条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上,也能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HBco-3HV) 近来的研究发现改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去,形成4HB或5HV单体 与3HB的共聚物。 在多数情况下微生物是利用糖加丙酸或戊酸产生PHBV的,并可通过改变二者的配比控制 共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸价格较高,且对细菌有毒,因而在培养液中的浓度必 须控制很低,导致产率及转化率都不高,这些都是生产上的不利因素。90年代后发现,在分 类上属于红球菌属( Rhodococcus)、诺卡氏菌属( nocardia)和棒杆菌属( Corynebacterium中的 些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含HV和HB的PHAs。例如红球菌 NCIMB40126以葡萄 糖为碳源时,PHAs积累量可达31%,其HV与HB的摩尔比为7624;极端嗜盐菌Halo/erax mediterranei利用淀粉为唯一碳源可产生含75~17.7%HV的PHBV。此外,真养产碱杆菌H16 的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从果糖或葡萄糖酸等碳源产生PHBV,以果糖为碳源时,共聚物 占细胞干重的47%,HV与HB的摩尔比为793。这些发现不仅给PHAs生物合成和调节机制的研 究增加新的内容,而且开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产PHBV的新路 各种微生物利用不同碳源产生PHAs的发酵水平比较见表8-1- 表8-1-2各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较 使用菌种 碳源 规模时间 菌浓PHB含量 alstonia eutrophus N9A 果糖 摇瓶 Azotobacter beijerinckii 葡萄糖 摇瓶 70.4 Methylocystis paras OBBP|甲烷 摇瓶170-180 Rhodobacter sphaeroides17023乙酸 摇瓶 36 Thiocustis violacea 2311 乙酸 摇瓶 Haloferax mediterranei 7.5~17%HV Rhodococcus sp NCIMB40126葡萄糖 含76%HV Pseudomonas acidovorans l,4丁二酸摇瓶 含99%4HB omobacterium violacein戊酸 1.2-1445-65 HV同聚物 E.cOb重组菌 XLI Blue 葡萄糖 2.5L 1166 Pseudomonas oleovorans 辛酸 葡萄糖+戊酸25L38-40 16 mol%HV otobacter vinelandii UWD蜜+戊酸 8.5~23 2.5L38-4019-2259-71 mol%HV Protomonas extorquens 75L1 通纯氧 气升罐 Ralstonia eutrophus变异株葡萄糖 220m310-120大于10070-80通用搅拌罐 Ralstonia latus变异株 蔗糖 15m3 76 PHB>60 g/L Erwinia sp.重组菌 蔗糖 PHB生产强度 10L 064g/Lh) (二)PHAs的代谢途径与调控
3 产碱杆菌属(Ralstonia)，假单胞菌属(Pseudonomas)，甲基营养菌(Methylotrophs)，固氮菌属 (Azotobacter)和红螺菌属(Rhodospirilum)等，它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAs。 早期研究真养产碱杆菌(R. eutrophus)中PHB代谢的主要目的在于将PHB消除以便利用该 菌生产单细胞蛋白，后来才转向PHAs的生物合成和积累的研究。兼性化能自养型细菌在一定 的条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上，也能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV)。 近来的研究发现改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去，形成4HB或5HV单体 与3HB的共聚物。 在多数情况下微生物是利用糖加丙酸或戊酸产生PHBV的，并可通过改变二者的配比控制 共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸价格较高，且对细菌有毒，因而在培养液中的浓度必 须控制很低，导致产率及转化率都不高，这些都是生产上的不利因素。90年代后发现，在分 类上属于红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和棒杆菌属(Corynebacterium)中的一 些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含HV和HB的PHAs。例如红球菌NCIMB40126以葡萄 糖为碳源时，PHAs积累量可达31%，其HV与HB的摩尔比为76:24；极端嗜盐菌Haloferax mediteerranei 利用淀粉为唯一碳源可产生含7.5～17.7%HV的PHBV。此外，真养产碱杆菌H16 的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从果糖或葡萄糖酸等碳源产生PHBV，以果糖为碳源时，共聚物 占细胞干重的47%，HV与HB的摩尔比为7:93。这些发现不仅给PHAs生物合成和调节机制的研 究增加新的内容，而且开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产PHBV的新路。 各种微生物利用不同碳源产生PHAs的发酵水平比较见表8-1-2。 表8-1-2 各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较 使用菌种 碳源 规模 时间/ h 菌浓 / gL -1 PHB含量 / % 备注 Ralstonia eutrophus N9A 果糖 摇瓶 70 96 Azotobacter beijerinckii 葡萄糖 摇瓶 70.4 Methylocystis parvas OBBP 甲烷 摇瓶 170-180 70 Rhodobacter sphaeroides 17023 乙酸 摇瓶 36 69.9 Thiocystis violacea 2311 乙酸 摇瓶 36 83.0 Haloferax mediterranei 淀粉 摇瓶 67 7.5～17 %HV Rhodococcus sp. NCIMB 40126 葡萄糖 摇瓶 24 31 含76 %HV Pseudomonas acidovorans 1,4-丁二酸 摇瓶 96 4.3 18 含99 %4HB Chromobacterium violaceum 戊酸 摇瓶 72 1.2-1.4 45-65 HV同聚物 E. coli 重组菌XL1 Blue 葡萄糖 2.5 L 42 116.6 76 Pseudomonas oleovorans 辛酸 12 L 48 1.5 41 Azotobacter vinelandii UWD 葡萄糖+戊酸 糖蜜+戊酸 2.5 L 2.5 L 38-40 38-40 6.8 19-22 78 59-71 16 mol%HV 8.5～23 mol%HV Protomonas extorquens 甲醇 0.75L 170 223 64 通纯氧 Ralstonia eutrophus 变异株 葡萄糖 35 m 3 220m3 110-120 大于100 70-80 气升罐 通用搅拌罐 Ralstonia latus 变异株 蔗糖 15 m 3 76 PHB＞60 g/L Erwinia sp. 重组菌 蔗糖 5 L 35 28 68 Hyphomicrobium zavarzinii subsp. chengduense nov. 甲醇 10 L 40-59 PHB生产强度 0.64 g/(Lh) (二)PHAs 的代谢途径与调控
研究表明,许多微生物在碳源过量而其它某种营养成份如氮、磷、镁或氧不足时,能在 胞内大量积累PHAs以作为碳源和能源的贮存物。当限制性营养物再次被提供时,PHAs能被胞 内酶降解后作为碳源和能源利用。由于所用微生物种类和生长条件不同,多聚体的分子量 般在2×105~3×106之间。细胞中积累的PHAs以单个粒子的形态存在,在 R. eutrophus中,每 个细胞含有8-10个颗粒,每个颗粒直径大小为02至0.5μm,这些颗粒在活细胞体内以非晶体形 式存在。在电子或相差显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性。颗粒外面包裹着一层 膜,该膜没有通常的生物膜那样的典型双层结构,膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。有关 真养产碱杆菌中可溶性PHAs聚合酶的研究表明,当培养状态过渡到限氮条件时该酶与PHAs 颗粒相连 不同微生物合成PHAs的途径不同,基质不同其合成途径也有差异,这正是微生物代谢多 样性的一种表现。图8-1-1为一些微生物利用不同基质合成PHAs的主要代谢途径。 烷、醇和脂肪酸 糖 (3)(4) (1)2)5)(6) COASH CoASH I/ ATP AMP+pp 脂酰CoA 乙酰CoA 丙酰CoA FADH 乙酰CoA 乙酰乙酰CoA NADH+H 烯酰CoA β氧化 3-酮酰CoA L什+)-羟丁酰 CoACt NADPH+H/NADPH+H 丁烯酰CoA NADP NADP L什+B-羟酰CoA D-)3-羟酰 CoA D-)3-羟丁酰CoA 羟戊酰CoA CoAsH COASH COASH ASH 图8-1-1不同微生物中从不同基质合成PHAs的主要途径 (1)真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB (2)深红红螺菌从糖合成PHB (3)食油假单胞菌等从中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs (4)一株产碱杆菌从长链偶碳数脂肪酸合成PHB (5)铜绿假单胞菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs (6)真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV 在真养产碱杆菌、拜氏固氮菌以及许多微生物中,PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成 的。一是由生物合成的β-酮基硫酯酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶,EC2.3.1.9)催化两个乙酰辅酶A 的C-C结合;二是由依赖 NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(羟基丁酰辅酶A脱氢酶,EC1.1.1.36) 催化立体选择性的反应,从乙酰乙酰辅酶A产生D(-)-3-羟基丁酰辅酶A:三是由PHB聚合酶将 D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A连接到PHB正在增长的链上 PHB生物合成途径中的前两个酶,即β-酮基硫酯酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶,已被在数种 细菌中进行了详细的研究。在真养产碱杆菌中,β-酮基硫酯酶作为PHB生物合成途径中的第 个酶,以辅酶A为关键调节因子来控制PHB的合成。在该菌中检测到两个具有不同基质专一性 的βB-酮基硫酯酶,任一个酶在PHB合成中都可起作用。在真养产碱杆菌中还检测到两个不同的 乙酰乙酰辅酶A还原酶,它们在基质和辅酶的专一性方面不同,依赖于 NADPH的还原酶才参
4 研究表明，许多微生物在碳源过量而其它某种营养成份如氮、磷、镁或氧不足时，能在 胞内大量积累PHAs以作为碳源和能源的贮存物。当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞 内酶降解后作为碳源和能源利用。由于所用微生物种类和生长条件不同，多聚体的分子量一 般在2×105～3×106之间。细胞中积累的PHAs以单个粒子的形态存在，在R. eutrophus中，每 个细胞含有8-10个颗粒，每个颗粒直径大小为0.2至0.5 m，这些颗粒在活细胞体内以非晶体形 式存在。在电子或相差显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性。颗粒外面包裹着一层 膜，该膜没有通常的生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。有关 真养产碱杆菌中可溶性PHAs聚合酶的研究表明，当培养状态过渡到限氮条件时该酶与PHAs 颗粒相连。 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径也有差异，这正是微生物代谢多 样性的一种表现。图8-1-1为一些微生物利用不同基质合成PHAs的主要代谢途径。 NADP+ NADP H+H+ NADP+ NADP H+H+ 烷、醇和脂肪酸 CoASH ATP AMP +ppi D(－)3－羟酰CoA P HA D(－)3－羟丁酰CoA CoASH P HB 乙酰CoA FDA FADH2 NADH+H+ 2 NAD+ H O 乙酰CoA 乙酰乙酰CoA CoASH NADH+H+ 丁烯酰CoA L(+)3－羟丁酰CoA NAD+ 2 H O 2 H O 糖 丙酰CoA D(－)3－羟戊酰CoA CoASH P HBV 丙酸 CoASH ATP AMP +ppi CoASH CoASH CoASH 烯酰CoA 3－酮酰CoA 脂酰CoA L(+)3-羟酰CoA 2 H O β-氧化 (3)(4) (5) (6) (4) (1)(6) (2) (1)(2)(5)(6) (6) 图8-1-1 不同微生物中从不同基质合成PHAs的主要途径 (1)真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB (2)深红红螺菌从糖合成PHB (3)食油假单胞菌等从中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs (4)一株产碱杆菌从长链偶碳数脂肪酸合成PHB (5)铜绿假单胞菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs (6)真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV 在真养产碱杆菌、拜氏固氮菌以及许多微生物中，PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成 的。一是由生物合成的-酮基硫酯酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶，EC2.3.1.9)催化两个乙酰辅酶A 的C-C结合；二是由依赖NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(羟基丁酰辅酶A脱氢酶，EC1.1.1.36) 催化立体选择性的反应，从乙酰乙酰辅酶A产生D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A；三是由PHB聚合酶将 D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A连接到PHB正在增长的链上。 PHB生物合成途径中的前两个酶，即-酮基硫酯酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶，已被在数种 细菌中进行了详细的研究。在真养产碱杆菌中，-酮基硫酯酶作为PHB生物合成途径中的第一 个酶，以辅酶A为关键调节因子来控制PHB的合成。在该菌中检测到两个具有不同基质专一性 的-酮基硫酯酶，任一个酶在PHB合成中都可起作用。在真养产碱杆菌中还检测到两个不同的 乙酰乙酰辅酶A还原酶，它们在基质和辅酶的专一性方面不同，依赖于NADPH的还原酶才参
与PHB的生物合成。由于纯化方面的困难,直到最近才对PHAs聚合酶进行详细的研究。在真 养产碱杆菌中,PHAs聚合酶仅对含C3Cs单位的D(-)-羟基烷酰辅酶A具有专一性。PHAs聚合 酶催化的聚合系统类似于脂肪酸合成系统,即増长链在一个半胱氨酸硫醇和一个磷酸泛酰巯 基乙胺之间进行填充和伸长的交替循环。 在微生物体内,PHAs的生物合成和降解是同时存在的,图8-1-2是真养产碱杆菌中典型的 PHB生物合成和降解途径。近来的研究表明,用作真养产碱杆菌这三个酶的基质不仅有乙酰辅 酶A、乙酰乙酰辅酶A或D(-)-3-.羟基丁酰辅酶A,而且还有丙酰辅酶A、D(-)-3-酮基戊酰辅酶 A或D(-)-3羟基戊酰辅酶A Acety I-CoA+ Acety I-CoA CoA Acetoacety l-CoA Acetoacety I-CoA Acetoacetate NADPH Reductase AMP ATP NADP NADPH D(r-hy droxy butyry l-CoA +_D()-3-hy rate NADP dehy drogenase P(3HB)nPHA synthase P(HB) PHA depolvmerase-DC-3-hy droxy butyrate 图8-1-2真养产碱杆菌中PHB的生物合成和降解的代谢途径 在属于rRNA同源组Ⅰ的大多数假单胞菌中,存在着利用中等链长的烷烃、烷醇和烷酸合 成由中等链长的3-羟基烷酸组成的聚酯的途径。例如,食油假单胞菌用烷烃或烷酸作碳源培养 时,存在着由脂肪酸β-氧化的中间产物3-羟基烷酰辅酶A至PHAs的合成途径,这一途径称为P leovorans phAs生物合成途径;另外,这一组中除食油假单胞菌以外的几乎所有成员还存在 另一条从乙酰辅酶A经脂肪酸的生物合成途径,这一途径称为 Pseudomonas aeruginosa的PHAs 生物合成途径。然而PHAs合成酶的合成产物的步骤还不很清楚。最近有关 P. putida脂肪酸代 谢途径的CNMR研究表明,在PHAs生物合成中β氧化和 do novo脂肪酸生物作用无关。此外 株产碱杆菌能从长链偶碳数脂肪酸(≤C2)合成PHB,而从奇碳数酸(≤C19)合成PHBV。应 当说明,目前对不同途径了解的程度还很不一样。例如在从脂肪酸合成PHAs的过程中如何从 B-氧化的中间产物L-(+)-3-羟基脂酰辅酶A转变成PHA的D(-)型前体就需进一步探索 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合成PHB。来自于多种细菌的PHAs生 物合成酶PHAs生物合成途径的关键酶,已被在分子水平进行了详细的研究,它们的PHAs生 物合成酶基因已被克隆成功。三个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因 phb4、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达,研究发现,在真养产碱杆菌中,PHAs合成酶的 结构基因排列在称为phbC-4-B的一个操纵子上,分别编码PHAs合成酶、β ketothiolase和依赖 于 NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(图8-1-3) PHA synthase B-Ketothiolase NADPH-reductase TTGACA-AACAAT phbC(1767 bp)2- phbA(1179bp) phbB(738 bp 18b 314bp 图8-1-3真养产碱杆菌中聚羟基烷酸生物合成操纵子的排列顺序 从分子水平上来分析PHAs的生物合成途径,最令人感兴趣的是PHAs合成酶。细菌利用不 同代谢途径将中心代谢中间产物转变成羟基脂酰辅酶A,它可能是所有PHAs合成酶的底物, 在不同的细菌中通过不同的途径合成D(-)-羟基丁酰辅酶A或其他的羟基脂酰辅酶A
5 与PHB的生物合成。由于纯化方面的困难，直到最近才对PHAs聚合酶进行详细的研究。在真 养产碱杆菌中，PHAs聚合酶仅对含C3-C5单位的D-(-)-羟基烷酰辅酶A具有专一性。PHAs聚合 酶催化的聚合系统类似于脂肪酸合成系统，即增长链在一个半胱氨酸硫醇和一个磷酸泛酰巯 基乙胺之间进行填充和伸长的交替循环。 在微生物体内，PHAs的生物合成和降解是同时存在的，图8-1-2是真养产碱杆菌中典型的 PHB生物合成和降解途径。近来的研究表明，用作真养产碱杆菌这三个酶的基质不仅有乙酰辅 酶A、乙酰乙酰辅酶A或D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A，而且还有丙酰辅酶A、D-(-)-3-酮基戊酰辅酶 A或D-(-)-3-羟基戊酰辅酶A。 Acetyl-CoA+Acetyl-CoA β-Ketothiolase CoA Acetoacetyl-CoA Reductase NADPH NADP + D(-)-hydroxybutyryl-CoA P(3HB) n PHA synthase P(3HB) n +1 PHA depolymerase D(-)-3-hydroxybutyrate NADP + NADPH D(-)-3-hydroxybutyrate dehydrogenase Acetoacetate Acetoacetyl-CoA Synthetase ATP CoA AMP 图8-1-2 真养产碱杆菌中PHB的生物合成和降解的代谢途径 在属于rRNA同源组Ⅰ的大多数假单胞菌中，存在着利用中等链长的烷烃、烷醇和烷酸合 成由中等链长的3-羟基烷酸组成的聚酯的途径。例如，食油假单胞菌用烷烃或烷酸作碳源培养 时，存在着由脂肪酸-氧化的中间产物3-羟基烷酰辅酶A至PHAs的合成途径，这一途径称为P. oleovorans PHAs生物合成途径；另外，这一组中除食油假单胞菌以外的几乎所有成员还存在 另一条从乙酰辅酶A经脂肪酸的生物合成途径，这一途径称为Pseudomonas aeruginosa的PHAs 生物合成途径。然而PHAs合成酶的合成产物的步骤还不很清楚。最近有关P. putida 脂肪酸代 谢途径的13C-NMR研究表明，在PHAs生物合成中-氧化和do novo 脂肪酸生物作用无关。此外， 一株产碱杆菌能从长链偶碳数脂肪酸(≤C22)合成PHB，而从奇碳数酸(≤C19)合成PHBV。应 当说明，目前对不同途径了解的程度还很不一样。例如在从脂肪酸合成PHAs的过程中如何从 -氧化的中间产物L-(+)-3-羟基脂酰辅酶A转变成PHA的D-(-)型前体就需进一步探索。 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合成PHB。来自于多种细菌的PHAs生 物合成酶-PHAs生物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研究，它们的PHAs生 物合成酶基因已被克隆成功。三个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因 phbA、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达，研究发现，在真养产碱杆菌中，PHAs合成酶的 结构基因排列在称为phbC-A-B的一个操纵子上，分别编码PHAs合成酶、-ketothiolase 和依赖 于NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(图8-1-3)。 TTGACA--AACAAT------ phbC (1767 bp) phbA (1179 bp) phbB (738 bp) PHA synthase β－Ketothiolase NADPH－reductase 18 bp 314 bp 84 bp 74 bp -35 -10 图8-1-3 真养产碱杆菌中聚羟基烷酸生物合成操纵子的排列顺序 从分子水平上来分析PHAs的生物合成途径，最令人感兴趣的是PHAs合成酶。细菌利用不 同代谢途径将中心代谢中间产物转变成羟基脂酰辅酶A，它可能是所有PHAs合成酶的底物， 在不同的细菌中通过不同的途径合成D-(-)-羟基丁酰辅酶A或其他的羟基脂酰辅酶A
前面介绍过,食油假单胞菌可利用烷烃或烷酸产生中等链长的羟基烷酸多聚物。近来已 将真养产碱杆菌的PHB生物合成基因在其中克隆,得到的重组菌株能表达真养产碱杆菌的PHB 合成基因,因而体内具有两种PHAs生物合成体系:一是外来的、从乙酰辅酶A合成PHB的体 系;二是自身的从脂肪酸β-氧化的中间产物合成PHAs的体系。例如重组食油假单胞菌 VK101 ppl可利用葡萄糖合成并积累PHB。如果用中等链长的烷酸作碳源,在生长受到限制 的条件下,除形成能直接反映所利用的碳源种类的那些聚羟基烷酸外,羟基丁酸也可被结合 到聚酯中。用辛酸培养时积累PHAs达细胞干重的765%,该聚合物由468mol%3HB,4.5 mol%3-羟基已酸3HHx),48.2mol%3HO以及07mol%3HD组成,而亲株在同样的条件下 只积累了3-HHx(62mol%)、3-HO93.0mol%和3HD-(0.3mol%)的聚酯。 通过对PHAs产生菌的生物学和遗传学的研究和探讨,有助于进一步了解PHAs的代谢途 径,可为更好地控制PHAs的生物合成过程打下良好的基础 (三)PHAs的发酵生产 阻碍PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本问题。英国帝国化学公司(C1)曾 就工业规模生产PHB的技术和经济问题进行了评估,考虑的因素包括产物的产率、技术的复杂 性、投资以及产物分离的难易程度等。影响PHAs生产成本的主要因素有:菌种、原料、操作 方式以及提取方法等。因而要降低PHAs的生产成本主要可从以下几个方面来进行:①采用廉 价基质(如CO、H和O2,甲醇,乙醇,葡萄糖及来自农业废物的有机酸等),提高产物对基质 的产率系数,以降低发酵原材料的成本;②提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵 生产方式等),以降低操作成本;③改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化 操作等),以降低提取成本。 选择什么样的菌种和原材料对PHAs的生产成本影响很大。考虑的因素主要包括:细胞利 用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在胞内最大积累多聚物的程度。ⅠCI公司 分别对固氮菌、甲基营养菌和真养产碱杄菌进行了考察。他们放弃了固氮菌,因为它还会产 生多糖,从而降低了PHB的比产率并会带来一些技术问题:他们也否定了甲基营养菌,主要因 为该菌的PHB产率不高,最终胞内PHB含量仅约65%左右,会增加提取费用。尽管甲醇的价格 仅为葡萄糖的45%,但其转化系数却很低,因而ICI虽然具有以甲醇为唯一碳源、在1500m3 反应器规模上生产单细胞蛋白的丰富经验,但该公司最终选择了真养产碱杆菌(R. eutrophus) 作为PHAs的生产菌株,因为该菌生长快、易培养、胞内PHB含量高、聚合物的分子量大以及 能利用各种较经济的碳源。 确定了合适的生产菌种,要进一步降低PHAs的生产成本,关键在于采用合适的发酵方式, 以获得高的产物对基质的转化率、高的PHA生产强度和高的产物浓度(产物浓度的提高同时也 可相应降低提取成本) 在PHAs的生产中,通常所采用的发酵方式有分批发酵法和流加发酵法,有时还可采用连 续培养法来获得高的生产强度。由于R. eutrophus只有在某种营养成份缺乏而碳源过量的不平 衡生长条件下才能大量积累PHAs,因而在PHAs的发酵生产中,一般可将发酵过程分成两个阶 段来进行控制。第一阶段为菌体细胞的形成阶段。在此阶段微生物利用基质形成大量菌体, 而PHAs的积累量很少:第二阶段为多聚体形成阶段。当培养基中某种营养耗尽时,细胞进入 PHAs形成阶段,在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。 在简单分批培养过程中,由于微生物菌体的生长受到所用培养基中营养物质初始浓度的 限制,当菌体生长进行到一定浓度时,培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为菌体细
6 前面介绍过，食油假单胞菌可利用烷烃或烷酸产生中等链长的羟基烷酸多聚物。近来已 将真养产碱杆菌的PHB生物合成基因在其中克隆，得到的重组菌株能表达真养产碱杆菌的PHB 合成基因，因而体内具有两种PHAs生物合成体系：一是外来的、从乙酰辅酶A合成PHB的体 系；二是自身的从脂肪酸-氧化的中间产物合成PHAs的体系。例如重组食油假单胞菌 pVK101:pp1可利用葡萄糖合成并积累PHB。如果用中等链长的烷酸作碳源，在生长受到限制 的条件下，除形成能直接反映所利用的碳源种类的那些聚羟基烷酸外，羟基丁酸也可被结合 到聚酯中。用辛酸培养时积累PHAs达细胞干重的76.5 %，该聚合物由46.8 mol % 3-HB，4.5 mol % 3-羟基已酸(3HHx)，48.2 mol % 3-HO以及0.7 mol % 3HD组成，而亲株在同样的条件下 只积累了3-HHx(6.2 mol %)、3-HO(93.0 mol %)和3HD-(0.3 mol %)的聚酯。 通过对PHAs产生菌的生物学和遗传学的研究和探讨，有助于进一步了解PHAs的代谢途 径，可为更好地控制PHAs的生物合成过程打下良好的基础。 (三)PHAs 的发酵生产 阻碍PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本问题。英国帝国化学公司(ICI)曾 就工业规模生产PHB的技术和经济问题进行了评估，考虑的因素包括产物的产率、技术的复杂 性、投资以及产物分离的难易程度等。影响PHAs生产成本的主要因素有：菌种、原料、操作 方式以及提取方法等。因而要降低PHAs的生产成本主要可从以下几个方面来进行：①采用廉 价基质(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡萄糖及来自农业废物的有机酸等)，提高产物对基质 的产率系数，以降低发酵原材料的成本；②提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵 生产方式等)，以降低操作成本；③改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化 操作等)，以降低提取成本。 选择什么样的菌种和原材料对PHAs的生产成本影响很大。考虑的因素主要包括∶细胞利 用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在胞内最大积累多聚物的程度。ICI公司 分别对固氮菌、甲基营养菌和真养产碱杆菌进行了考察。他们放弃了固氮菌，因为它还会产 生多糖，从而降低了PHB的比产率并会带来一些技术问题；他们也否定了甲基营养菌，主要因 为该菌的PHB产率不高，最终胞内PHB含量仅约65 %左右，会增加提取费用。尽管甲醇的价格 仅为葡萄糖的45 %，但其转化系数却很低，因而ICI虽然具有以甲醇为唯一碳源、在1500 m3 反应器规模上生产单细胞蛋白的丰富经验，但该公司最终选择了真养产碱杆菌(R. eutrophus) 作为PHAs的生产菌株，因为该菌生长快、易培养、胞内PHB含量高、聚合物的分子量大以及 能利用各种较经济的碳源。 确定了合适的生产菌种，要进一步降低PHAs的生产成本，关键在于采用合适的发酵方式， 以获得高的产物对基质的转化率、高的PHAs生产强度和高的产物浓度(产物浓度的提高同时也 可相应降低提取成本)。 在PHAs的生产中，通常所采用的发酵方式有分批发酵法和流加发酵法，有时还可采用连 续培养法来获得高的生产强度。由于R. eutrophus只有在某种营养成份缺乏而碳源过量的不平 衡生长条件下才能大量积累PHAs，因而在PHAs的发酵生产中，一般可将发酵过程分成两个阶 段来进行控制。第一阶段为菌体细胞的形成阶段。在此阶段微生物利用基质形成大量菌体， 而PHAs的积累量很少；第二阶段为多聚体形成阶段。当培养基中某种营养耗尽时，细胞进入 PHAs形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。 在简单分批培养过程中，由于微生物菌体的生长受到所用培养基中营养物质初始浓度的 限制，当菌体生长进行到一定浓度时，培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为菌体细
胞进一步繁殖的限制因素,而简单地增加该种营养物质的初始浓度,不一定能导致菌生长量 的相应增加,相反某些成份在较高浓度时还会对细胞产生毒害作用,或者可能形成沉淀,因 此,采用分批发酵不可能获得很高的细胞干重以及高的产物浓度和生产强度 采用流加发酵法进行PHAs的生产时,可以在某些必需的营养成份成为生长限制因素之前 对其进行定量流加,延长细胞的对数生长期,从而获得较高的菌体浓度,另外,为了避免菌 体细胞在生长阶段积累多聚体,也需通过流加法来控制培养液中铵离子浓度不低于200mgL, 否则会降低共聚体的最终产率。在多聚体形成阶段,尽管限制氮源能刺激细胞积累PHAs,但 氮源的完全缺乏又会极大地损害微生物细胞的合成活性,所以将在PHAs合成阶段以较低的速 率限量流加氮源的情况与分批发酵中氮源完全缺乏的情况相比较,可以看出,前者胞内PHB 含量增加更快,表明采用流加发酵法不仅可以得到高的产物浓度和生产强度,通过控制发酵 过程中PHB合成所需基质的浓度,还可以提高产品的质量。 从文献报道的研究结果来看,采用分批发酵所能获得的细胞干重和PHAs浓度都比较低(细 胞干重大多小于20g1);而采用流加发酵法,往往可以达到很高的细胞干重和PHAs浓度 Suzuki等人以甲醇为碳源,培养甲基营养型菌 Protomonas extorquens合成PHB,在075L的反应 器中,通过在线检测并控制甲醇的浓度在0.5g左右,在通纯氧条件下培养170h,细胞密度 达到233g/L,PHB浓度达149gL,这是到目前为止所获得的最高细胞干重和PHB浓度,但由 于发酵时间较长,所以PHB的生产强度仅为0.88g/(Lh),最终胞内PHB含量(64%)也较低。Kim 报道了克隆了真养产碱杆菌PHB生物合成基因的重组大肠杆菌 XLIBlue在2.5L罐中发酵的结 果。该重组菌流加培养42h后,细胞干重达116.6g/L,PHB浓度为88g/L,生产强度可达2.1 g/(Lh),充分显示了重组DNA技术应用于生物合成PHB领域的潜力,但该菌的所需的培养基成 份复杂,且在培养过程中需通纯氧才能满足菌体生长和产物合成对氧的需求,成本较高,不 易放大。 在共聚物PHBV的生产过程中,流加发酵法也比分批发酵法具有明显优势。丙酸或戊酸是 合成PHBV中HV组分所必需的前体物质,由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性(0.1%的 丙酸浓度就会对产生抑制作用),故采用简单分批发酵不可能获得高产。采用流加发酵法,可 避免由于培养基中一次加入的有机酸过高而使细胞活力受到的损害,从而达到提高PHBV产率 的目的。 尽管有关PHB或PHBV生产的流加发酵技术的报道很多,但对底物流加方式的控制大多是 凭经验来实施的。而在PHB或PHBV的发酵过程中,根据菌体生长和产物合成阶段的不同特点 来控制基质适宜的流加速率相当重要。例如在PHB或PHBV合成阶段,只有进行氮源的限量流 加,才能促使细胞有效地积累多聚物;氮源的过量流加不仅会导致已积累的PHB降解,还会降 低微生物细胞的PHB合成能力。对于在多聚物合成阶段采用何种流加方式来控制氮源浓度在有 利于多聚物大量积累的范围内,还未见报道。另外,对于在流加发酵中如何采取适当的控制 策略来获得高的产物对基质的转化率这一问题,相关文献提及很少。因而为了在多聚物发酵 过程中获得高的生产强度、高的转化率和高的产物浓度,必须对其流加发酵过程实行优化控 制。实现PHB或PHBV流加发酵的优化控制,必须建立在对发酵过程的菌体生长和产物形成的 动力学充分研究和了解的基础上,应根据发酵过程中不同阶段的特点,优化底物的流加方式 提高多聚物的生产强度、转化率和产物浓度,降低生产成本,为最终实现其工业化生产打下 良好的基础
7 胞进一步繁殖的限制因素，而简单地增加该种营养物质的初始浓度，不一定能导致菌生长量 的相应增加，相反某些成份在较高浓度时还会对细胞产生毒害作用，或者可能形成沉淀，因 此，采用分批发酵不可能获得很高的细胞干重以及高的产物浓度和生产强度。 采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些必需的营养成份成为生长限制因素之前， 对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而获得较高的菌体浓度，另外，为了避免菌 体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制培养液中铵离子浓度不低于200 mg/L， 否则会降低共聚体的最终产率。在多聚体形成阶段，尽管限制氮源能刺激细胞积累PHAs，但 氮源的完全缺乏又会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以将在PHAs合成阶段以较低的速 率限量流加氮源的情况与分批发酵中氮源完全缺乏的情况相比较，可以看出，前者胞内PHB 含量增加更快，表明采用流加发酵法不仅可以得到高的产物浓度和生产强度，通过控制发酵 过程中PHB合成所需基质的浓度，还可以提高产品的质量。 从文献报道的研究结果来看，采用分批发酵所能获得的细胞干重和PHAs浓度都比较低(细 胞干重大多小于20 g/L)；而采用流加发酵法，往往可以达到很高的细胞干重和PHAs浓度。 Suzuki等人以甲醇为碳源，培养甲基营养型菌Protomonas extorquens合成PHB，在0.75 L的反应 器中，通过在线检测并控制甲醇的浓度在0.5 g/L左右，在通纯氧条件下培养170 h，细胞密度 达到233 g/L，PHB浓度达149 g/L，这是到目前为止所获得的最高细胞干重和PHB浓度，但由 于发酵时间较长，所以PHB的生产强度仅为0.88 g/(Lh)，最终胞内PHB含量(64 %)也较低。Kim 报道了克隆了真养产碱杆菌PHB生物合成基因的重组大肠杆菌xL1Blue在2.5 L罐中发酵的结 果。该重组菌流加培养42 h后，细胞干重达116.6 g/L，PHB浓度为88.8 g/L，生产强度可达2.11 g/(Lh)，充分显示了重组DNA技术应用于生物合成PHB领域的潜力，但该菌的所需的培养基成 份复杂，且在培养过程中需通纯氧才能满足菌体生长和产物合成对氧的需求，成本较高，不 易放大。 在共聚物PHBV的生产过程中，流加发酵法也比分批发酵法具有明显优势。丙酸或戊酸是 合成PHBV中HV组分所必需的前体物质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性(0.1 %的 丙酸浓度就会对产生抑制作用)，故采用简单分批发酵不可能获得高产。采用流加发酵法，可 避免由于培养基中一次加入的有机酸过高而使细胞活力受到的损害，从而达到提高PHBV产率 的目的。 尽管有关PHB或PHBV生产的流加发酵技术的报道很多，但对底物流加方式的控制大多是 凭经验来实施的。而在PHB或PHBV的发酵过程中，根据菌体生长和产物合成阶段的不同特点 来控制基质适宜的流加速率相当重要。例如在PHB或PHBV合成阶段，只有进行氮源的限量流 加，才能促使细胞有效地积累多聚物；氮源的过量流加不仅会导致已积累的PHB降解，还会降 低微生物细胞的PHB合成能力。对于在多聚物合成阶段采用何种流加方式来控制氮源浓度在有 利于多聚物大量积累的范围内，还未见报道。另外，对于在流加发酵中如何采取适当的控制 策略来获得高的产物对基质的转化率这一问题，相关文献提及很少。因而为了在多聚物发酵 过程中获得高的生产强度、高的转化率和高的产物浓度，必须对其流加发酵过程实行优化控 制。实现PHB或PHBV流加发酵的优化控制，必须建立在对发酵过程的菌体生长和产物形成的 动力学充分研究和了解的基础上，应根据发酵过程中不同阶段的特点，优化底物的流加方式， 提高多聚物的生产强度、转化率和产物浓度，降低生产成本，为最终实现其工业化生产打下 良好的基础
PHAs作为一种生物可降解的热塑性材料,早在六十年代就已引起了人们的广泛关注,在 过去几十年中,有数家公司一直在探索PHB工业生产的可能性。80年代初,ICI和奥地利生物 技术有限公司等将微生物合成PHAs的研究推向试生产阶段。1982年,lCI使用真养产碱杆菌突 变株为生产菌种,以葡萄糖为唯一碳源,在35m3气升环流反应器及200m3机械搅拌反应罐内 试生产PHB成功,并以葡萄糖加丙酸为碳源生产出力学性能更好的PHBV,当时的年产量为 000吨,计划在九十年代末达到数千吨。用该产品做成的瓶子进入欧洲市场,当时的售价为 $15/b,但ICI宣称扩大投产量后的售价预计下降到$1b经过许多研究者的不断努力与探索, PHB的价格已从最初的$15b下降至$558/kg左右,但与聚丙烯的价格($l/kg)相比仍高出许 多,缺乏市场竞争力。由此可见,PHAs若要作为塑料部分替代化工合成塑料,不仅需要政府 环保立法的支持,在技术方面还有许多工作尚待开展 20世纪90年代以来,见诸报道的文献多系涉及寻求生产PHAs的新方法和开发其新的应用 领域。由于商业竞争的原因,有关PHAs发酵生产的关键技术的研究报道非常少见。1990年 Bita等人预言,只有发酵时间小于70h,PHAs含量大于80%的生产工艺,在商业上才是可以接 受的。迄今为止的文献中,以葡萄糖为碳源培养R. eutrophus所得的PHAs含量最高为77% 国内对于采用微生物发酵法生产生物可降解塑料的研究起步于80年代的中后期,我国政 府对PHAs的研究和开发工作很重视,已在“九五”期间完成中试。从所报道的资料来看,国 内目前从事PHAs研究的单位主要有中科院微生物研究所、清华大学、山东大学、北京农业大 学等高校,研究水平见表8-1-3。总的说来,国内对PHAs的研究起步较迟,研究水平与国外相 比也有较大的差距,对PHAs产生菌的细胞生长和产物合成的动力学还缺乏全面的研究,对 PHAs的发酵过程还缺乏有效的控制策略。 表8-1-3国内进行PHAs研究的水平 菌种 碳源发酵时间规模细胞干重PHAs含量备注 R 葡萄糖 72 2L罐 R. eutrophus葡萄糖+丙酸652L罐35 60以上62%HV R eutrophus 丁酸 33L罐 7.5 R.ephs高果糖浆(HFS) 2L罐164 46.3 自养黄杆菌 葡萄糖 5L罐 34.9 73.0 24%HV 本章主要内容 本章选择真养产碱杄菌作为PHB和PHBⅴ的生产菌株,在摇瓶和小型发酵罐上对该菌的细 胞生长和产物合成的动力学特性进行详细的研究,在此基础上,提出以最大化PHB生产强度和 PHB对葡萄糖的产率系数为目标函数的PHB流加发酵优化策略,以及以PHBV的最大生产强度 和较适宜HV组分含量为目标函数的PHBV流加优化策略,具体研究内容包括 (1)以葡萄糖为碳源,进行R.ε tophus菌体生长和PHB积累的摇瓶发酵条件研究。然后根 据PHB的合成途径,通过定量的质、能衡算和解析,得出PHB的理论转化率,并与R. eutrophus 的真实转化率比较,进行R. eutrophus的代谢流分析,得出对工艺有指导作用的一些理论依据 (2)在连续培养中对 R eutrophus的菌体生长、产物形成、基质消耗进行研究,得到一些重 要的动力学参数:并对采用二级连续培养法进行PHB的生产的可行性进行研究
8 PHAs作为一种生物可降解的热塑性材料，早在六十年代就已引起了人们的广泛关注，在 过去几十年中，有数家公司一直在探索PHB工业生产的可能性。80年代初，ICI和奥地利生物 技术有限公司等将微生物合成PHAs的研究推向试生产阶段。1982年，ICI使用真养产碱杆菌突 变株为生产菌种，以葡萄糖为唯一碳源，在35 m3气升环流反应器及200 m3机械搅拌反应罐内 试生产PHB成功，并以葡萄糖加丙酸为碳源生产出力学性能更好的PHBV，当时的年产量为 1000吨，计划在九十年代末达到数千吨。用该产品做成的瓶子进入欧洲市场，当时的售价为 ＄15/lb，但ICI宣称扩大投产量后的售价预计下降到＄1/lb。经过许多研究者的不断努力与探索， PHB的价格已从最初的＄15/lb下降至＄5.58/kg左右，但与聚丙烯的价格(＄1/kg)相比仍高出许 多，缺乏市场竞争力。由此可见，PHAs若要作为塑料部分替代化工合成塑料，不仅需要政府 环保立法的支持，在技术方面还有许多工作尚待开展。 20世纪90年代以来，见诸报道的文献多系涉及寻求生产PHAs的新方法和开发其新的应用 领域。由于商业竞争的原因，有关PHAs发酵生产的关键技术的研究报道非常少见。1990年， Bital等人预言，只有发酵时间小于70 h，PHAs含量大于80%的生产工艺，在商业上才是可以接 受的。迄今为止的文献中，以葡萄糖为碳源培养R. eutrophus所得的PHAs含量最高为77%。 国内对于采用微生物发酵法生产生物可降解塑料的研究起步于80年代的中后期，我国政 府对PHAs的研究和开发工作很重视，已在“九五”期间完成中试。从所报道的资料来看，国 内目前从事PHAs研究的单位主要有中科院微生物研究所、清华大学、山东大学、北京农业大 学等高校，研究水平见表8-1-3。总的说来，国内对PHAs的研究起步较迟，研究水平与国外相 比也有较大的差距，对PHAs产生菌的细胞生长和产物合成的动力学还缺乏全面的研究，对 PHAs的发酵过程还缺乏有效的控制策略。 表8-1-3 国内进行PHAs研究的水平 菌种 碳源 发酵时间 / h 规模 细胞干重 / gL -1 PHAs含量 / % 备注 R. eutrophus R. eutrophus 葡萄糖 葡萄糖+丙酸 72 65 2 L罐 2 L罐 50 35 77 60以上 6.2%HV R. eutrophus 丁酸 43 3 L罐 7.5 54.1 R. eutrophus 高果糖浆(HFS) 42 2 L罐 16.4 46.3 自养黄杆菌 葡萄糖 42 5 L罐 34.9 73.0 24%HV 三、本章主要内容 本章选择真养产碱杆菌作为PHB和PHBV的生产菌株，在摇瓶和小型发酵罐上对该菌的细 胞生长和产物合成的动力学特性进行详细的研究，在此基础上，提出以最大化PHB生产强度和 PHB对葡萄糖的产率系数为目标函数的PHB流加发酵优化策略，以及以PHBV的最大生产强度 和较适宜HV组分含量为目标函数的PHBV流加优化策略，具体研究内容包括： (1)以葡萄糖为碳源，进行R. eutrophus菌体生长和PHB积累的摇瓶发酵条件研究。然后根 据PHB的合成途径，通过定量的质、能衡算和解析，得出PHB的理论转化率，并与R. eutrophus 的真实转化率比较，进行R. eutrophus的代谢流分析，得出对工艺有指导作用的一些理论依据。 (2)在连续培养中对R. eutrophus的菌体生长、产物形成、基质消耗进行研究，得到一些重 要的动力学参数；并对采用二级连续培养法进行PHB的生产的可行性进行研究
(3)基于摇瓶发酵的研究结果,在小型发酵罐中对影响菌体生长和PHB合成的一些重要的 环境因子进行定量的考察,在对PHB发酵过程动力学进行分析的基础上,建立较为合理的PHB 发酵过程动力学模型。 (4)研究氮源、碳源和氧的限制、缺乏和恢复供应对PHB发酵过程的影响,确定目的微生 物的生理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系:对PHB发酵过程中不同的停氮时 间和PHB合成期不同的硫酸铵流速对PHB发酵的影响进行研究,得出适宜的PHB流加发酵条 件,为PHB的流加发酵准优化研究创造条件。在PHB流加发酵过程动力学研究的基础上,分别 建立R.ε tophus菌体生长期和PHB合成期基质流加的准优化控制策略,确定由指数速率流加 和变速流加组成的基质流加操作方式,得到以PHB的最大生产强度和产率系数为目标的PHB 流加发酵准优化策略 (5)以葡萄糖为碳源,丙酸或戊酸为PHBV中HV组分合成的前体生产PHBV,对前体的不同 流加时间和流加浓度进行研究,在得出前体丙酸适宜流加时间和浓度的基础上,提出以PHBV 的最大生产强度和较适宜HⅤ组分含量为目标函数的PHBV发酵准优化流加策略 第二节真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究 引言 真养产碱杄菌在不平衡的生长条件(碳源过量而其他营养成份如氮、磷或氧等限制)下,能 在胞内积累聚羟基烷酸作碳源和能源的贮藏物。研究表明,培养条件会对PHB发酵的菌体生 长和产物合成过程产生重大的影响,适宜的环境条件不仅有利于菌体的快速生长,还可促进 胞内PHB的大量积累,可以提高包括产物浓度、胞内聚合物的百分含量、生产强度和产率系 数在内的各项发酵指标,实现PHB的高效生产。在摇瓶条件下,易于考察各种营养因素对PHB 发酵过程的影响,选择出适宜的培养基组成和发酵条件,为以后的研究打下良好的基础。为 此,本节研究了摇瓶条件下,接种量、pH值、碳氮源浓度和补料操作等因素对PHB发酵过程 的影响,得出了较佳的PHB摇瓶发酵条件,并结合PHB的代谢途径对其发酵过程的控制进行 了初步分析 、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化 (一)种子生长过程曲线和种龄的确定 真养产碱杆菌wSH3在种子培养基中的生长情况如表8-2-1。可以看出,培养25h以 后,菌体的比生长速率开始下降。因而可以确定,取20~25h的培养物接入发酵液为好 表8-2-1菌株WSH的种子生长过程 时间/h912142225293236 细胞干重/gL11.512.173.336.0084011712401273 InX 0.410.771.201792.232.412.522.54 (二)不同的接种量对PHB合成的影响 适宜的接种量可以缩短发酵阶段的菌体生长的延滞期,从而缩短发酵周期,最终提高发 酵产物的生产强度。将培养至20~25h之间种子培养物按不同的接种量接入发酵培养基中 实验结果见表8-2-2。可以看出,在接种量为8~10%的情况下,可以得到最大的细胞干重和 PHB浓度 表8-2-2不同的接种量对PHB发酵的影响
9 (3)基于摇瓶发酵的研究结果，在小型发酵罐中对影响菌体生长和PHB合成的一些重要的 环境因子进行定量的考察，在对PHB发酵过程动力学进行分析的基础上，建立较为合理的PHB 发酵过程动力学模型。 (4)研究氮源、碳源和氧的限制、缺乏和恢复供应对PHB发酵过程的影响，确定目的微生 物的生理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系；对PHB发酵过程中不同的停氮时 间和PHB合成期不同的硫酸铵流速对PHB发酵的影响进行研究，得出适宜的PHB流加发酵条 件，为PHB的流加发酵准优化研究创造条件。在PHB流加发酵过程动力学研究的基础上，分别 建立R. eutrophus菌体生长期和PHB合成期基质流加的准优化控制策略，确定由指数速率流加 和变速流加组成的基质流加操作方式，得到以PHB的最大生产强度和产率系数为目标的PHB 流加发酵准优化策略。 (5)以葡萄糖为碳源，丙酸或戊酸为PHBV中HV组分合成的前体生产PHBV，对前体的不同 流加时间和流加浓度进行研究，在得出前体丙酸适宜流加时间和浓度的基础上，提出以PHBV 的最大生产强度和较适宜HV组分含量为目标函数的PHBV发酵准优化流加策略。 第二节 真养产碱杆菌生产 PHB 摇瓶发酵条件的研究 一、引言 真养产碱杆菌在不平衡的生长条件(碳源过量而其他营养成份如氮、磷或氧等限制)下，能 在胞内积累聚羟基烷酸作碳源和能源的贮藏物。研究表明，培养条件会对 PHB 发酵的菌体生 长和产物合成过程产生重大的影响，适宜的环境条件不仅有利于菌体的快速生长，还可促进 胞内 PHB 的大量积累，可以提高包括产物浓度、胞内聚合物的百分含量、生产强度和产率系 数在内的各项发酵指标，实现 PHB 的高效生产。在摇瓶条件下，易于考察各种营养因素对 PHB 发酵过程的影响，选择出适宜的培养基组成和发酵条件，为以后的研究打下良好的基础。为 此，本节研究了摇瓶条件下，接种量、pH 值、碳氮源浓度和补料操作等因素对 PHB 发酵过程 的影响，得出了较佳的 PHB 摇瓶发酵条件，并结合 PHB 的代谢途径对其发酵过程的控制进行 了初步分析。 二、PHB 摇瓶发酵条件研究与补料优化 (一)种子生长过程曲线和种龄的确定 真养产碱杆菌 WSH 3 在种子培养基中的生长情况如表 8-2-1。可以看出，培养 25 h 以 后，菌体的比生长速率开始下降。因而可以确定，取 20～25 h 的培养物接入发酵液为好。 表 8-2-1 菌株 WSH3 的种子生长过程 时间 / h 9 12 14 22 25 29 32 36 细胞干重 / gL -1 1.51 2.17 3.33 6.00 8.40 11.17 12.40 12.73 lnX 0.41 0.77 1.20 1.79 2.23 2.41 2.52 2.54 (二)不同的接种量对 PHB 合成的影响 适宜的接种量可以缩短发酵阶段的菌体生长的延滞期，从而缩短发酵周期，最终提高发 酵产物的生产强度。将培养至 20～25 h 之间种子培养物按不同的接种量接入发酵培养基中， 实验结果见表 8-2-2。可以看出，在接种量为 8～10 %的情况下，可以得到最大的细胞干重和 PHB 浓度。 表 8-2-2 不同的接种量对 PHB 发酵的影响