第六章透明质酸发酵过程优化 第一节透明质酸发酵概述 、透明质酸的分布、结构、性质与应用 透明质酸( Hyaluronic acid,简称透明质酸),又名玻璃酸,是 Meyer和 Palmer于1934年 首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。 balazs于1960年将透明质酸用于复杂的视网 膜脱离手术取得理想疗效后,透明质酸开始作为生化药物得到应用。透明质酸在日化工业(特 别是化妆品工业)中也有广阔的应用前景。据报道,透明质酸在国际市场上的价格为 2,000-100,000美元/kg。1985年透明质酸在国际市场上的总销售额为1亿美元,到1990年已 达2亿多美元。国外已有多家公司生产透明质酸药品,如美国的 Hyvisc,前苏联的 Luronitel, 澳大利亚的 Etamycin及瑞士的 Healon等。 (一)透明质酸的分布、结构和性质 透明质酸为白色、无定形固体,是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡萄糖( GIcNAc)以 β-1,3和β-1,4糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成的丝状高分子聚合物,其结构如图6-1-1 所示。透明质酸具有许多天然粘多糖共同的物理性质,无嗅无味,溶于水,不溶于有机溶剂, 水溶液的比旋光度为-70~-80°。 COoH CH2 OH 图6-1-1透明质酸结构示意图 自然界中,透明质酸广泛地存在于动物的各种组织内,如结缔组织、脐带、皮肤、人血 清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中 以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中透明质酸产量最高。在这些组织中,透明质酸常与 蛋白质结合,并与其它粘多糖共存,以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中,而以凝胶形式存 在于鸡冠和脐带中。 透明质酸的分子量在数十万到数百万之间。分子量为4×10Da的分子,链长约为10um 由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型,半径为200 nm,柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性:透明质酸在溶液中可亲和约为其自身重量1000倍 的水分。这些水在螺旋柱内固定不动,不易流失 透明质酸除具有强烈的亲水性外,其溶液还有着独特的流变学特性。透明质酸水溶液是 一种非牛顿流体,有着良好的粘弹性和应变性。这些性质主要取决于其分子量的大小和溶液 浓度与酸度的高低。一般来说,浓度高、分子量大,则溶液粘度也高。 Gibbs发现低浓度的透 明质酸溶液主要表现为粘性,而高浓度溶液则主要显示出弹性。在粘性与弹性之间有一个明 确的临界浓度转变点,这个点与溶液的pH值有着很大的关系 (二)透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能,如润滑关节,调节蛋白质、水、电解质 的扩散和运转,促进创伤愈合等,因此其在临床医学上有着巨大用途,例如:透明质酸已成 为现代眼科“粘性手术”的必备药物:利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病
1 第六章 透明质酸发酵过程优化 第一节 透明质酸发酵概述 一、透明质酸的分布、结构、性质与应用 透明质酸(Hyaluronic acid，简称透明质酸)，又名玻璃酸，是 Meyer 和 Palmer 于 1934 年 首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。Balazs 于 1960 年将透明质酸用于复杂的视网 膜脱离手术取得理想疗效后，透明质酸开始作为生化药物得到应用。透明质酸在日化工业(特 别是化妆品工业)中也有广阔的应用前景。据报道，透明质酸在国际市场上的价格为 2,000~100,000 美元/kg。1985 年透明质酸在国际市场上的总销售额为 1 亿美元，到 1990 年已 达 2 亿多美元。国外已有多家公司生产透明质酸药品，如美国的 Hyvisc，前苏联的 Luronitel， 澳大利亚的 Etamucin 及瑞士的 Healon 等。 (一)透明质酸的分布、结构和性质 透明质酸为白色、无定形固体，是由葡萄糖醛酸(GlcA)和 N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以 -1,3 和-1,4 糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成的丝状高分子聚合物，其结构如图 6-1-1 所示。透明质酸具有许多天然粘多糖共同的物理性质，无嗅无味，溶于水，不溶于有机溶剂， 水溶液的比旋光度为-70~ -80。 n n>1000 图 6-1-1 透明质酸结构示意图 自然界中，透明质酸广泛地存在于动物的各种组织内，如结缔组织、脐带、皮肤、人血 清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中 以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中透明质酸产量最高。在这些组织中，透明质酸常与 蛋白质结合，并与其它粘多糖共存，以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中，而以凝胶形式存 在于鸡冠和脐带中。 透明质酸的分子量在数十万到数百万之间。分子量为 4106 Da 的分子，链长约为 10 m。 由于直链链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，半径为 200 nm，柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性∶透明质酸在溶液中可亲和约为其自身重量 1000 倍 的水分。这些水在螺旋柱内固定不动，不易流失。 透明质酸除具有强烈的亲水性外，其溶液还有着独特的流变学特性。透明质酸水溶液是 一种非牛顿流体，有着良好的粘弹性和应变性。这些性质主要取决于其分子量的大小和溶液 浓度与酸度的高低。一般来说，浓度高、分子量大，则溶液粘度也高。Gibbs 发现低浓度的透 明质酸溶液主要表现为粘性，而高浓度溶液则主要显示出弹性。在粘性与弹性之间有一个明 确的临界浓度转变点，这个点与溶液的 pH 值有着很大的关系。 (二)透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能，如润滑关节，调节蛋白质、水、电解质 的扩散和运转，促进创伤愈合等，因此其在临床医学上有着巨大用途，例如∶透明质酸已成 为现代眼科“粘性手术”的必备药物；利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病；
促进伤口的愈合;作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医 学医药应用见表6-1-1。 表6-1-1透明质酸在医学医药上的应用 应用领域 主要功能和作用 眼科玻璃体的替代品,舒适的滴眼药,眼科手术中的优良粘合剂。 矫型外科增强骨骼关节间的滑动,用于矫型手术 外科手术用于耳鼻喉科手术,用作腹部、手部的抗粘连接剂。 骨关节术有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。 伤口愈合促进组织再生、重塑和愈合,其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤 口愈 临床诊断用作肝、肿瘤的诊断指标 此外,透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水6Lg,因而是 种理想的天然保湿因子( Natural moisturing Factor,简称NMF)。它可以改善皮肤的营养代谢 使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认 为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”,许多国家在竞相研究开发。表6-1-2列出透明质酸结 构、性能对皮肤的影响 表6-1-2透明质酸结构、性能对皮肤的影响 结构中代表性基团相应表现的特征 羧酸基( COONa) 亲水性湿性 显性 湿润效果 羟基,氧基(-OHO) 配糖苷(1,3- Glycoside)紧密结构一弹性 能与皮肤相亲和 酰胺基NCO)与蛋白质亲和一一亲肤性保持皮肤光洁 生物相容大分子结构成膜性 较少皮肤渗透性,无刺激阻挡外来因素对皮肤毒害 、透明质酸的生物合成 (一)透明质酸的生物合成途径 1937年, Kendal等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸后 陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机 制还不是很清楚,但根据现有的工作以及关于透明质酸两种UDP前体的研究,可以确定透明 质酸的合成途径如图6-1-2所示。透明质酸是UDP葡萄糖醛酸(UDP-GlA)和UDPN-乙酰葡 萄糖胺( UDP-GICNAc)在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlA是糖醛酸途径的中间产物 与UDP- GIcNAc一样,它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。 Oregan通过同位素标记实验证实, 只有5~7%的葡萄糖能转化成透明质酸,其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受 UDP-GICNAc反 馈抑制。因此,要增加透明质酸的合成,必须克服这种反馈调节机制
2 促进伤口的愈合；作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医 学医药应用见表 6-1-1。 表 6-1-1 透明质酸在医学医药上的应用 应用领域 主要功能和作用 眼科 玻璃体的替代品，舒适的滴眼药，眼科手术中的优良粘合剂。 矫型外科 增强骨骼关节间的滑动，用于矫型手术。 外科手术 用于耳鼻喉科手术，用作腹部、手部的抗粘连接剂。 骨关节术 有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。 伤口愈合 促进组织再生、重塑和愈合，其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤 口愈合。 临床诊断 用作肝、肿瘤的诊断指标。 此外，透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水 6 L/g，因而是 一种理想的天然保湿因子(Natural Moisturing Factor，简称 NMF)。它可以改善皮肤的营养代谢， 使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认 为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”，许多国家在竞相研究开发。表 6-1-2 列出透明质酸结 构、性能对皮肤的影响。 表 6-1-2 透明质酸结构、性能对皮肤的影响 结构中代表性基团 相应表现的特征 显示作用 羧酸基(-COONa) 吸湿性 羟基，氧基(-OH, -O) 保湿性 配糖苷(1,3-Glycoside) 紧密结构—弹性 能与皮肤相亲和 酰胺基(-NHCO-) 与蛋白质亲和——亲肤性 成膜性 较少皮肤渗透性，无刺激 阻挡外来因素对皮肤毒害 亲水性 生物相容大分子结构 保持皮肤光洁 湿润效果 二、透明质酸的生物合成 (一)透明质酸的生物合成途径 1937 年，Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 可以合成透明质酸后， 陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机 制还不是很清楚，但根据现有的工作以及关于透明质酸两种 UDP 前体的研究，可以确定透明 质酸的合成途径如图 6-1-2 所示。透明质酸是 UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和 UDP-N-乙酰葡 萄糖胺(UDP-GlcNAc)在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlcA 是糖醛酸途径的中间产物， 与 UDP-GlcNAc 一样，它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。O'regan 通过同位素标记实验证实， 只有 5~7%的葡萄糖能转化成透明质酸，其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受 UDP-GlcNAc 反 馈抑制。因此，要增加透明质酸的合成，必须克服这种反馈调节机制
glucose-6-Phosphase glucose-6-P glucosaminine-6-P synthase UDP-glucos glucosaminine-1-P phorylase) UDP-glucose glucosaminine-1-P UDP-N-acty -(pyrophosphorylase hyaluronic acid 图6-1-2透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶 hyaluronan synthase)是透明质酸合成途径中的关键 酶,但并不是说在透明质酸合成酶的作用下 UDP-GIcA和 UDP-GICNAc就能够合成透明质酸。 在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和 运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为42kDa的膜蛋白。 Stoolmiller和 Dorfman等对A群链球菌的酶制备液进行研究,发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质 酸的非还原端进行的,在Mg2+存在的条件下,仅以 UDP-GIcA和 UDP-GICNAc为底物即可合 成透明质酸。合成时将 UDP-GICA和 UDP-GICNAc交替连接在透明质酸链上,反应进行非常 快,每分钟约100个糖单位。 Van de rijn发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关,在 对数生长期可以很高的速率(大约为430~954mol(hg蛋白)合成透明质酸;但在静止期,其 膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。 Van de rijn推测这可能是由于膜形态的改变, 造成合成机制的改变,或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara等用无细胞体系进行研究,发现合成的透明质酸可以分成两部分,即可溶于三氯 乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明,不溶部分是可溶部分的前体,但 这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参 加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测,但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后, 在细胞膜上的透明质酸酶的作用下,将胞内透明质酸降解到一定程度后,分泌到胞外。产生 透明质酸酶的微生物有很多,不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。 Van de rijn 发现C族链球菌D181的胞内透明质酸分子量为10×10°Da,而胞外的仅2×10°Da,约为胞 内的20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶,可以将透明质酸彻底降解, (二)透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty和 Van de rijn对A群链球菌研究发现,从透明质酸前体的合成到透明质酸的 合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为hasA的基因,编 码着A群 Streptococci的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性,氨基酸序列同 系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。 Dougherty等同时确定了其DNA序列和hasA 转录起始点。用Tn916作为插入子插入hasA基因中,除透明质酸合成酶失去活性外,UDP 葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明,编码透明质酸合成酶基因和UDP·葡萄糖醛酸 脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater和 Van de rijn对has操纵子进行了进一步的研究,发现has操纵子上有三个基因
3 glucose glucose-6-P glucose-1-P UDP-glucose UDP-glucuronic acid fructose-6-P glucosaminine-6-P glucosaminine-1-P N-actylglucosaminine-1-P UDP-N-actylglucosaminine hexokinase mutase glucosaminine-1-P actyl transferase N-actyl-glucosaminine 1-P-uridyl transferase (pyrophosphorylase) phospho glucomutase UDP-glucose 1-P-uridyl transferase (pyrophosphorylase) UDP-glucose dehydrogenase hyaluronic acid hyaluronan synthase glucose-6-Phosphase isomerase glucosaminine-6-P synthase 图 6-1-2 透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)是透明质酸合成途径中的关键 酶，但并不是说在透明质酸合成酶的作用下 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 就能够合成透明质酸。 在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和 运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为 42 kDa 的膜蛋白。Stoolmiller 和 Dorfman 等对 A 群链球菌的酶制备液进行研究，发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质 酸的非还原端进行的，在 Mg2+存在的条件下，仅以 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 为底物即可合 成透明质酸。合成时将 UDP-GlcA 和 UDP-GlcNAc 交替连接在透明质酸链上，反应进行非常 快，每分钟约 100 个糖单位。Van de Rijn 发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关，在 对数生长期可以很高的速率(大约为 430~954 nmol/(hg 蛋白))合成透明质酸；但在静止期，其 膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。Van de Rijn 推测这可能是由于膜形态的改变， 造成合成机制的改变，或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara 等用无细胞体系进行研究，发现合成的透明质酸可以分成两部分，即可溶于三氯 乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明，不溶部分是可溶部分的前体，但 这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参 加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测，但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后， 在细胞膜上的透明质酸酶的作用下，将胞内透明质酸降解到一定程度后，分泌到胞外。产生 透明质酸酶的微生物有很多，不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。Van de Rijn 发现 C 族链球菌 D181 的胞内透明质酸分子量为 10×106 Da，而胞外的仅 2×106 Da，约为胞 内的 20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶，可以将透明质酸彻底降解。 (二)透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty 和 Van de Rijn 对 A 群链球菌研究发现，从透明质酸前体的合成到透明质酸的 合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为 hasA 的基因，编 码着 A 群 Streptococci 的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性，氨基酸序列同 系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。Dougherty 等同时确定了其 DNA 序列和 hasA 转录起始点。用 Tn916 作为插入子插入 hasA 基因中，除透明质酸合成酶失去活性外，UDP- 葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明，编码透明质酸合成酶基因和 UDP-葡萄糖醛酸 脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater 和 Van de Rijn 对 has 操纵子进行了进一步的研究，发现 has 操纵子上有三个基因
hasA、hasB、hasC,分别编码着透明质酸合成酶、UDP葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化 酶。has操纵子的表达是 Streptococci(A群)合成透明质酸荚膜所必须的。 Streptococci(A群)荚 膜细菌和非荚膜细菌,以及 Streptococci(C型)荚膜菌都具有has操纵子。荚膜表型可以说明膜 上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA分析也表明失去荚膜的 Streptococci (A群)菌会失去has操纵子所转录的mRNA,微生物生理状态的变化规律与所获得的has操纵 子的启动子所表现的一致,这些都说明A群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制 、透明质酸的生产 (一)动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取,原料涉及前述的大部分含透明质酸 的动物组织,表6-1-3为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因,鸡冠、牛眼是 最常用的提取原料 表6-1-3各种组织(液)中透明质酸的含量 原料浓度/ mgL-(mg.kg)原料浓度/mgL(/mgkg) 公鸡冠 人玻璃体 40~380 牛鼻软骨 人表皮 兔脑 65 人淋巴液 5~18 兔肌肉 人尿 0.1~0.5 人脐带 4100 人血清 0.01~0.1 人关节滑液 1240~3600 从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于60万,粘度较高,保湿性能也较 好,占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂 Healon,目前仍然采用这种方法所制得。从动物 组织中提取的一般方法如下:先将组织打成匀浆,再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵 盐(如氯化十六烷基吡啶)沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液,用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化 时,可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理,也可通过凝胶和或离子交换色谱的方法精制。1kg 新鲜公鸡冠一般可制得4g纯透明质酸。 (二)发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏,无论是鸡冠、还是牛 眼都非常稀少,并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低(表6-1-3):其次由于动物组织中 透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合,使得透明质酸提取和精制的成本很高:再者动物来源 的透明质酸可能受到不同程度的污染,因此其使用受到许多严格规定的限制:更为重要的原 因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下,研究 人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸,随后英美等国相继报道采用微生物 发酵生产透明质酸的方法,大大拓宽了透明质酸来源,推动了透明质酸的研究和应用。微生 物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展,不仅可 以降低透明质酸生产成本,而且透明质酸的质量提高,品质稳定。发酵法生产透明质酸和提 取法生产透明质酸的比较如表6-1-4。同其它产物的发酵一样,透明质酸的发酵生产同样也追 求高产率和高转化率,同时还要保证透明质酸产品的高分子量,因为其分子量的高低直接影 响其质量的高低。此外,透明质酸作为一种医药产品,其安全性也是需要考虑的一个重要问
4 hasA、hasB、hasC，分别编码着透明质酸合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和 UDP-葡萄糖焦磷酸化 酶。has 操纵子的表达是 Streptococci (A 群)合成透明质酸荚膜所必须的。Streptococci (A 群)荚 膜细菌和非荚膜细菌，以及 Streptococci (C 型)荚膜菌都具有 has 操纵子。荚膜表型可以说明膜 上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA 分析也表明失去荚膜的 Streptococci (A 群)菌会失去 has 操纵子所转录的 mRNA，微生物生理状态的变化规律与所获得的 has 操纵 子的启动子所表现的一致，这些都说明 A 群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制 的。 三、透明质酸的生产 (一)动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取，原料涉及前述的大部分含透明质酸 的动物组织，表 6-1-3 为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因，鸡冠、牛眼是 最常用的提取原料。 表 6-1-3 各种组织(液)中透明质酸的含量 原料 浓度 /mgL -1 (mgkg-1 ) 原料 浓度 /mgL -1 (/mgkg-1 ) 公鸡冠 7500 人玻璃体 140~380 牛鼻软骨 1200 人表皮 200 兔脑 65 人淋巴液 8.5~18 兔肌肉 27 人尿 0.1~0.5 人脐带 4100 人血清 0.01~0.1 人关节滑液 1240~3600 从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于 60 万，粘度较高，保湿性能也较 好，占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂 Healon，目前仍然采用这种方法所制得。从动物 组织中提取的一般方法如下：先将组织打成匀浆，再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵 盐(如氯化十六烷基吡啶)沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液，用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化 时，可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理，也可通过凝胶和/或离子交换色谱的方法精制。1 kg 新鲜公鸡冠一般可制得 4 g 纯透明质酸。 (二)发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏，无论是鸡冠、还是牛 眼都非常稀少，并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低(表 6-1-3)；其次由于动物组织中 透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合，使得透明质酸提取和精制的成本很高；再者动物来源 的透明质酸可能受到不同程度的污染，因此其使用受到许多严格规定的限制；更为重要的原 因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下，研究 人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983 年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸，随后英美等国相继报道采用微生物 发酵生产透明质酸的方法，大大拓宽了透明质酸来源，推动了透明质酸的研究和应用。微生 物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展，不仅可 以降低透明质酸生产成本，而且透明质酸的质量提高，品质稳定。发酵法生产透明质酸和提 取法生产透明质酸的比较如表 6-1-4。同其它产物的发酵一样，透明质酸的发酵生产同样也追 求高产率和高转化率，同时还要保证透明质酸产品的高分子量，因为其分子量的高低直接影 响其质量的高低。此外，透明质酸作为一种医药产品，其安全性也是需要考虑的一个重要问
表6-1-4发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较 提取法 发酵法 原料 来源有限 原料很广 提取工艺透明质酸在原料中与蛋白质和其它多透明质酸在发酵液中游离存在,分离 糖形成复合体,分离纯化工艺复杂纯化容易 分子量 180万 性质 不同来源差异较大 分子量高、粘度大、保湿力强 质量与产量质量不稳定,取决于动物组织来源,产品质量稳定,产量大,产品成本明 产量较小,产品成本高 显低于提取法 1.环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止,实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。 影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为 0.3~1.0g几,而在通风搅拌的情况下,可以达到4-6g。 Johns等研究了搅拌转速对透明质酸 生产的影响,发现在厌氧培养时,较高的搅拌转速下透明质酸产量更高,而菌体的生长速率 和转化率不受影响:降低转速会使透明质酸产量降低,同时副产物增加。这是因为透明质酸 溶液是一种假塑性流体,髙的搅拌(剪切)速率可以降低溶液粘度,増加营养的供给,消除细胞 周围富集的副产物对细胞的毒害,同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养 基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。 Clery和 larkin认为透明质酸可 作为一种抵抗O渗透的屏障,防止分子氧对细胞的毒害,因此通风可以促进透明质酸的产生: Swan等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度,可以获得更高的透明质酸转化率。然 而 Bracke等发现培养基中丰富的CO2可以促进透明质酸的合成。 Johns等发现,与厌氧培养 相比,通风培养可以获得更高的透明质酸浓度和转化率。另外,厌氧培养的产物单一,而通 风培养时大大增加了其它副产物及CO2的产生 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或 过低时都不能得到好的发酵结果,当初始葡萄糖浓度为15g,发酵过程中控制培养液中葡萄 糖含量低于15gL可获得最高的透明质酸产量。此外,发酵方式也影响透明质酸的生产。高 山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在200cps以下可使得透明质酸产率、转化率 大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100~-400mⅤ使透明质酸产量提高的报道 2.环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大影响,而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条 件下透明质酸的重均分子量为07×10Da或更低,有氧条件下分子量则高于2×10°Da。在一 定的条件下,胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制pH对透明质酸 的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到40gL透明质酸的实验是在通 气搅拌、pH7的情况下进行的。当pH在80-89的范围内,透明质酸分子量可以达到25×10 Da。特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物,透明质酸的分 子量可以达2.5×10Da左右;森田裕等通过添加表面活性剂,获得了高纯度高分子量的透明 质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响,也受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使
5 题。 表 6-1-4 发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较 提取法 发酵法 原料 来源有限 原料很广 提取工艺 透明质酸在原料中与蛋白质和其它多 糖形成复合体，分离纯化工艺复杂 透明质酸在发酵液中游离存在，分离 纯化容易 分子量 180 万 性质 不同来源差异较大 分子量高、粘度大、保湿力强 质量与产量 质量不稳定，取决于动物组织来源， 产量较小，产品成本高 产品质量稳定，产量大，产品成本明 显低于提取法 1．环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止，实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。 影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为 0.3~1.0 g/L，而在通风搅拌的情况下，可以达到 4~6 g/L。Johns 等研究了搅拌转速对透明质酸 生产的影响，发现在厌氧培养时，较高的搅拌转速下透明质酸产量更高，而菌体的生长速率 和转化率不受影响；降低转速会使透明质酸产量降低，同时副产物增加。这是因为透明质酸 溶液是一种假塑性流体，高的搅拌(剪切)速率可以降低溶液粘度，增加营养的供给，消除细胞 周围富集的副产物对细胞的毒害，同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养 基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。Clery 和 larkin 认为透明质酸可 作为一种抵抗 O2 渗透的屏障，防止分子氧对细胞的毒害，因此通风可以促进透明质酸的产生； Swann 等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度，可以获得更高的透明质酸转化率。然 而 Bracke 等发现培养基中丰富的 CO2 可以促进透明质酸的合成。Johns 等发现，与厌氧培养 相比，通风培养可以获得更高的透明质酸浓度和转化率。另外，厌氧培养的产物单一，而通 风培养时大大增加了其它副产物及 CO2 的产生。 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或 过低时都不能得到好的发酵结果，当初始葡萄糖浓度为 15 g/L，发酵过程中控制培养液中葡萄 糖含量低于 15 g/L 可获得最高的透明质酸产量。此外，发酵方式也影响透明质酸的生产。高 山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在 200 cps 以下可使得透明质酸产率、转化率 大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100~-400 mV 使透明质酸产量提高的报道。 2．环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大影响，而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条 件下透明质酸的重均分子量为 0.7×106 Da 或更低，有氧条件下分子量则高于 2×106 Da。在一 定的条件下，胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制 pH 对透明质酸 的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到 4.0 g/L 透明质酸的实验是在通 气搅拌、pH 7 的情况下进行的。当 pH 在 8.0~8.9 的范围内，透明质酸分子量可以达到 2.5×106 Da。特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物，透明质酸的分 子量可以达 2.5×106 Da 左右；森田裕等通过添加表面活性剂，获得了高纯度高分子量的透明 质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响，也受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使
提取得率降低,而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作,透明质酸分子 可能会发生断裂。目前世界上有4个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究,发现 控制合适的pH、温度,分别将蛋白质、核酸等杂质去除,既能获得高纯度透明质酸产品,又 不会在提取过程中降低透明质酸分子量 3.环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌 株,既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害,也可大大降低后提取过程的成本。 一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除,然后再进行培养研究。 Ellwood、 高山健一郎等采用连续培养的方法,既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入 静止期后,细胞开始产生不同的毒素,同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶,各种细胞 成分释放到培养基中,使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养,可以大大减少 这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低,而细胞壁成分与透明质酸分离 困难,因此这是一个优点。 四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品,透明质酸的 质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近 年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展,但由于发酵法生产透明质酸的发展历史较短, 尚存在如下不足和需要解决的问题: 原料。原料成本是生产成本的重要部分,开发可以利用价格低廉和较粗放原料(包括各 级放大的种子所用的原料)的菌种是一个重要的应用研究方向 2.发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础,对其进行研究,可以了解发 酵过程的规律,对生产过程进行优化和控制,以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前 为止,关于透明质酸的发酵过程动力学,还没有相关的研究报道 3.发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性,其发酵体系有着与一般体 系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道,主要集中于研究 些简单的发酵条件,对透明质酸发酵过程中的特殊现象没有进行深入的考察。如,搅拌、 氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果,氧在发酵过程中所起的作用等 4.工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短,仅采用单一的分批操作模式不一定 能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵,虽然已有报道阐述连续培养生产 透明质酸的优点,但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5.发酵机理的探讨。已有研究表明仅10‰%左右的底物可以转化为透明质酸,但其原因何 在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生 物合成机制的研究已进行到分子水平,但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的 报道 五、本章主要内容 本章以兽疫链球菌( Streptococcus〓 zooepidemicus)H23为生产菌株,采用摇瓶和小型发酵罐 对该菌株的发酵条件进行研究,并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵 过程的动力学模型:通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究,深入探 讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用,提出搅拌溶氧控制策略并实验验证;对多种发酵模式进 行研究,采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化,并将多种发酵模式进行组合操作,提
6 提取得率降低，而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作，透明质酸分子 可能会发生断裂。目前世界上有 4 个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究，发现 控制合适的 pH、温度，分别将蛋白质、核酸等杂质去除，既能获得高纯度透明质酸产品，又 不会在提取过程中降低透明质酸分子量。 3．环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌 株，既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害，也可大大降低后提取过程的成本。 一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除，然后再进行培养研究。Ellwood、 高山健一郎等采用连续培养的方法，既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入 静止期后，细胞开始产生不同的毒素，同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶，各种细胞 成分释放到培养基中，使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养，可以大大减少 这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低，而细胞壁成分与透明质酸分离 困难，因此这是一个优点。 四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品，透明质酸的 质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近 年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展，但由于发酵法生产透明质酸的发展历史较短， 尚存在如下不足和需要解决的问题： 1．原料。原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉和较粗放原料(包括各 级放大的种子所用的原料)的菌种是一个重要的应用研究方向。 2．发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础，对其进行研究，可以了解发 酵过程的规律，对生产过程进行优化和控制，以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前 为止，关于透明质酸的发酵过程动力学，还没有相关的研究报道。 3．发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性，其发酵体系有着与一般体 系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道，主要集中于研究一 些简单的发酵条件，对透明质酸发酵过程中的特殊现象没有进行深入的考察。如，搅拌、溶 氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果，氧在发酵过程中所起的作用等。 4．工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短，仅采用单一的分批操作模式不一定 能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵，虽然已有报道阐述连续培养生产 透明质酸的优点，但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5．发酵机理的探讨。已有研究表明仅 10%左右的底物可以转化为透明质酸，但其原因何 在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生 物合成机制的研究已进行到分子水平，但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的 报道。 五、本章主要内容 本章以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)H23 为生产菌株，采用摇瓶和小型发酵罐 对该菌株的发酵条件进行研究，并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵 过程的动力学模型；通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究，深入探 讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用，提出搅拌溶氧控制策略并实验验证；对多种发酵模式进 行研究，采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化，并将多种发酵模式进行组合操作，提
高透明质酸生产效率,为工业化生产打下基础;最后对Sz0 epidemicus的代谢网络进行了分 析,根据理论计算结果,采用营养增强型培养基,实现透明质酸的高效生产。具体内容如下 1.以兽疫链球菌( Streptococcus zooepidemicus)H23为生产菌株,采用无血清、无BH(心 脑浸液)种子培养基及较为简单的发酵培养基,进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上,采用小型发酵罐进行S.〓00 epidemicus H23培养的研究,并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析,扩展功能单元理论,提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型,为补料培养及其优化控制提供理论基础 2.采用模拟体系,对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究,建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下,考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响,从流变学角度 探讨发酵机制,为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础,对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析,探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理,提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3.根据分批发酵动力学模型,对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论 以透明质酸最大产量为目标,对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究,并以最大生产强度为目标硏究多种模式的组合操作的可行性,优化操 作过程,为工业化生产打下了基础。 4.采用代谢网络分析方法对 S. Zooepidemicus代谢网络通量进行研究,建立不同发酵条件 下的代谢网络模型,确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性,并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础,通过实验确定S.〓0 epidemicus H23合成透明质酸的关键因子,并采用营养增强型培养基培养S.〓 zooepidemicus H23,减轻透 明质酸合成途径的抑制,提高透明质酸产量和对底物的转化率 第二节透明质酸摇瓶发酵条件的研究 、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物,以多糖为主要成分。1937年, Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜,其 后,又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜,使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌,已报道的有多种溶血性链球菌(A型)、兽疫链球菌C型)、马链球菌(C型)、粪马链球 菌(C型)、缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等。其中A型为人体致病菌,C型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸,并且在1983年,日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法,但由于其具有巨大的商业价值,除专利 外,关于发酵法生产透明质酸的报道并不多 微生物的培养条件,对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长,而且可以提高微生物对底物的利用能力,使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus对营养要求极为苛刻,已有的报道都表明,对其进行培养需要 以血清或BH( Brain heart Infusion)为培养基主要成分,特别是在种子培养阶段。为此,本节以 株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23为研究菌株,首先对种子培养基组成进 行了考察硏究,得到了无血清种子培养基;以此为基础采用摇瓶发酵的方式,对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究,得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件。 7
7 高透明质酸生产效率，为工业化生产打下基础；最后对 S. zooepidemicus 的代谢网络进行了分 析，根据理论计算结果，采用营养增强型培养基，实现透明质酸的高效生产。具体内容如下∶ 1．以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus) H23 为生产菌株，采用无血清、无 BHI(心 脑浸液)的种子培养基及较为简单的发酵培养基，进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条 件研究。在此基础上，采用小型发酵罐进行 S. zooepidemicus H23 培养的研究，并对过程进行 优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析，扩展功能单元理论，提出透明质酸分批发 酵过程动力学数学模型，为补料培养及其优化控制提供理论基础。 2．采用模拟体系，对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究，建立发酵过程流变学模 型。在一定环境条件下，考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响，从流变学角度 探讨发酵机制，为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础，对溶氧和搅拌在透明质 酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析，探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作 用机理，提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3．根据分批发酵动力学模型，对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论， 以透明质酸最大产量为目标，对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生 产透明质酸进行研究，并以最大生产强度为目标研究多种模式的组合操作的可行性，优化操 作过程，为工业化生产打下了基础。 4．采用代谢网络分析方法对 S. zooepidemicus 代谢网络通量进行研究，建立不同发酵条件 下的代谢网络模型，确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性，并对能量和 还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础，通过实验确定 S. zooepidemicus H23 合成透明质酸的关键因子，并采用营养增强型培养基培养 S. zooepidemicus H23，减轻透 明质酸合成途径的抑制，提高透明质酸产量和对底物的转化率。 第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究 一、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物，以多糖为主要成分。1937 年，Kendall 等发现溶血性链球菌 Streptococcus haemolyticus 可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜，其 后，又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多 糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的 C 型)成为研究得最多的透明质酸 生产菌，已报道的有多种溶血性链球菌(A 型)、兽疫链球菌(C 型)、马链球菌(C 型)、粪马链球 菌(C 型)、缺乳链球菌(C 型)以及鸡霍乱杆菌(C 型)等。其中 A 型为人体致病菌，C 型则只能感 染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸，并且在 1983 年，日本资生堂率 先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法，但由于其具有巨大的商业价值，除专利 外，关于发酵法生产透明质酸的报道并不多。 微生物的培养条件，对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的 生长，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由 于 Streptococcus zooepidemicus 对营养要求极为苛刻，已有的报道都表明，对其进行培养需要 以血清或 BHI(Brain Heart Infusion)为培养基主要成分，特别是在种子培养阶段。为此，本节以 一株能产透明质酸的 Streptococcus zooepidemicus H23 为研究菌株，首先对种子培养基组成进 行了考察研究，得到了无血清种子培养基；以此为基础采用摇瓶发酵的方式，对培养条件(培 养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究，得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件
、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 种子是进行发酵的基础,其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种 子应是:(1)生长活力强,移至发酵罐后能迅速生长,延滞期短;(2)生理状态稳定:(3)生物量 浓度能满足大容量发酵罐的要求。 (一)种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表6-2-1。种子液中 细胞生长良好的,发酵培养时不一定能得到好的结果,表明细胞量多、但如果细胞合成透明 质酸的能力并未处于较佳的状态,最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源(NH)SO4 作为种子培养基氮源,接入发酵培养基后透明质酸产量最低,可能是NH·对菌体有着一定的 毒害作用,或者是培养基中缺少一定的生长因子,致使种子生长不好。采用复合有机氮源 接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源,可能是因为不同有机氮源提供的不 同生长因子能够进行互补,利于细胞生长。在复合有机氮源中,牛肉膏和酵母粉各占氮源总 量50%的种子培养基,接入发酵培养基后透明质酸产量最高:牛肉膏和蛋白胨各占氮源50% 的其次;而蛋白胨和酵母粉各占氮源50%的,接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机 氮源的发酵结果几乎相同。 表6-2-1种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(1) 氮源种子),B、P、、BB)()P以ABSQ 种子生物量/gL0.850.871.0 0.86 1.06 0.82 生物量/gLl150 1.38 发酵 透明质酸 0.15 0.14 0.22 /g L 注:BE,牛肉音 beef extract);Pep,蛋白胨( peptone):YE,酵母粉( yeast extract) 在上述实验的基础上,进一步考察了BHI培养基和种子培养基中复合有机氮源的浓度对 透明质酸发酵的影响,结果见表6-2-2。以BH培养基作为种子培养基,接入发酵培养基后透 明质酸产量并不高。因此,种子培养基采用牛肉膏和酵母粉为复合氮源。由于牛肉膏和酵母 粉复合氮源内含有大量的生长因子,可以推测这种复合氮源能够提供血清或BH所能提供的 生长因子,所以不加血清和BH的种子同样可以使细胞较好地生长,使得种子培养基的成本 有所降低 表6-2-2种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(2) YE(5g--)YE(5g- L-)Pep(5g.L- BHI Pep(5g. L") BE(5g.L') BE (5g. L") 透明质酸/gL 0.133 0.178 0.153 注:BE,牛肉膏 (beef extract):Pep,蛋白胨( peptone):YE,酵母粉( yeast extract) 2.氮源浓度的确定 考察由牛肉膏和酵母粉组成的复合氮源浓度对透明质酸发酵的影响,结果如表6-2-3所示 随着氮源浓度的升高,种子液中细胞干重随之升高。当氮源浓度达20g/L时,细胞干重也基 本稳定于最大值。此时透明质酸发酵也处于最佳状态。因此,在以后的硏究中选用酵母粉和 牛肉膏为复合氮源,浓度各为10g/L 表6-2-3种子培养基中氮源的不同浓度对发酵结果的影响
8 二、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 种子是进行发酵的基础，其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种 子应是：(1)生长活力强，移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；(2)生理状态稳定；(3)生物量 浓度能满足大容量发酵罐的要求。 (一)种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表 6-2-1。种子液中 细胞生长良好的，发酵培养时不一定能得到好的结果，表明细胞量多、但如果细胞合成透明 质酸的能力并未处于较佳的状态，最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源(NH4)2SO4 作为种子培养基氮源，接入发酵培养基后透明质酸产量最低，可能是 NH4 +对菌体有着一定的 毒害作用，或者是培养基中缺少一定的生长因子，致使种子生长不好。采用复合有机氮源， 接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源，可能是因为不同有机氮源提供的不 同生长因子能够进行互补，利于细胞生长。在复合有机氮源中，牛肉膏和酵母粉各占氮源总 量 50%的种子培养基，接入发酵培养基后透明质酸产量最高；牛肉膏和蛋白胨各占氮源 50% 的其次；而蛋白胨和酵母粉各占氮源 50%的，接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机 氮源的发酵结果几乎相同。 表 6-2-1 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(1) 氮源(种子) BE (20gL -1 ) Pep (20gL -1 ) YE (20gL -1 ) BE(10gL -1 ) Pep(10gL -1 ) BE(10gL -1 ) YE(10gL -1 ) Pep(10gL -1 ) YE(10gL -1 ) (NH4)2SO4 (20gL -1 ) 种子 生物量 / gL -1 0.85 0.87 1.10 0.86 1.12 1.06 0.82 发酵 生物量 / gL -1 1.50 1.00 1.38 0.98 1.33 1.22 1.10 透明质酸 /gL -1 0.14 0.15 0.14 0.18 0.22 0.16 0.09 注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 在上述实验的基础上，进一步考察了 BHI 培养基和种子培养基中复合有机氮源的浓度对 透明质酸发酵的影响，结果见表 6-2-2。以 BHI 培养基作为种子培养基，接入发酵培养基后透 明质酸产量并不高。因此，种子培养基采用牛肉膏和酵母粉为复合氮源。由于牛肉膏和酵母 粉复合氮源内含有大量的生长因子，可以推测这种复合氮源能够提供血清或 BHI 所能提供的 生长因子，所以不加血清和 BHI 的种子同样可以使细胞较好地生长，使得种子培养基的成本 有所降低。 表 6-2-2 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(2) 氮源 YE (5gL -1 ) Pep (5gL -1 ) YE (5gL -1 ) BE (5gL -1 ) Pep (5gL -1 ) BE (5gL -1 ) BHI 透明质酸 /gL -1 0.133 0.178 0.153 0.138 注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 2．氮源浓度的确定 考察由牛肉膏和酵母粉组成的复合氮源浓度对透明质酸发酵的影响，结果如表6-2-3所示。 随着氮源浓度的升高，种子液中细胞干重随之升高。当氮源浓度达 20 g/L 时，细胞干重也基 本稳定于最大值。此时透明质酸发酵也处于最佳状态。因此，在以后的研究中选用酵母粉和 牛肉膏为复合氮源，浓度各为 10 g/L。 表 6-2-3 种子培养基中氮源的不同浓度对发酵结果的影响
氮源浓度/gL1 生物量/gL 0.780.921.181.201.18 葡萄糖/ 15.711.85 8.2 透明质酸/gL1 0.160.220.260.240.23 透明质酸产率/gg10.00670.00770.00770.00710.0061 (二)种子培养基中碳源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 碳源种类的确定 种子培养基中不同碳源对H23菌株发酵生产透明质酸的影响列于表62-4。采用葡萄糖为 种子培养基的碳源,接入发酵培养基后透明质酸产量最髙,其后依次是蔗糖和麦芽糖。而以 果糖、木糖、半乳糖为种子的碳源,效果较差。 表6-2-4种子培养基中的不同碳源组成对透明质酸发酵结果的影响 碳源种类 葡萄糖果糖蔗糖木糖半乳糖麦芽糖 透明质酸/gL10.220.120.200.110.150.19 2.葡萄糖浓度的确定 如表6-2-5所示,当葡萄糖的浓度为20gL时,种子液中细胞干重最高,但发酵后透明质 酸产量也最大。因此,采用葡萄糖为种子碳源,浓度为20gL。 表6-2-5种子培养基中不同葡萄糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖/gL 14 种子生物量/gL1 1.00 剩余葡萄糖/gL19.7 6.3 78 发酵透明质酸/gl 透明质酸产率/gg10.006300071 0.0069 0.0065 (三)种子培养基中金属离子及浓度对透明质酸发酵的影响 Mg2+的影响 对细胞来说,众多的金属离子当中,Mg2是最为重要的一种,它是许多酶活性中心不可 缺少的一部分。在EMP途径之中,磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下形成烯醇式丙酮 酸和ATP,是EMP途径的一个限速步骤,而Mg2+对于丙酮酸激酶来说是必不可少的。由于 链球菌缺乏一个完整的TCA循环,它的能量主要来自EMP途径,因此需要提供适量的Mg2, 保证H23菌株胞内EMP途径的酶高效运转,使菌体生长良好 表6-2-6MgSO47H2O浓度对发酵的影响 MgSO 7H2O/g L 1.0 2.0 种子 生物量/gLl 1.13 1.21 1.15 剩余葡萄糖/gL11.08 0.62 0.87 发酵 透明质酸/gL 透明质酸产率/ggl0.00740.00750.00830.0076 如表6-2-6所示,随着MgSO47HO添加量的增大,种子液中细胞干重逐渐增大,当 MgSO4ⅦH2O为2.0g/L时,种子液中细胞干重达到最大值,产透明质酸性能也最佳。 2.Mn2浓度的确定 与Mg2+作用相类似,Mm2也是一部分酶活性部位的组成成分。如表6-2-7所示
9 氮源浓度 / gL -1 10 15 20 25 30 生物量 / gL -1 0.78 0.92 1.18 1.20 1.18 葡萄糖 / gL -1 15.7 11.8 5.5 6.2 8.2 透明质酸 / gL -1 0.16 0.22 0.26 0.24 0.23 透明质酸产率 / gg -1 0.0067 0.0077 0.0077 0.0071 0.0061 (二)种子培养基中碳源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．碳源种类的确定 种子培养基中不同碳源对 H23 菌株发酵生产透明质酸的影响列于表 6-2-4。采用葡萄糖为 种子培养基的碳源，接入发酵培养基后透明质酸产量最高，其后依次是蔗糖和麦芽糖。而以 果糖、木糖、半乳糖为种子的碳源，效果较差。 表6-2-4 种子培养基中的不同碳源组成对透明质酸发酵结果的影响 碳源种类 葡萄糖 果糖 蔗糖 木糖 半乳糖 麦芽糖 透明质酸 / gL -1 0.22 0.12 0.20 0.11 0.15 0.19 2．葡萄糖浓度的确定 如表 6-2-5 所示，当葡萄糖的浓度为 20 g/L 时，种子液中细胞干重最高，但发酵后透明质 酸产量也最大。因此，采用葡萄糖为种子碳源，浓度为 20 g/L。 表 6-2-5 种子培养基中不同葡萄糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖 / gL -1 14 20 28 35 种子 生物量 / gL -1 1.00 1.25 1.02 1.15 发酵 剩余葡萄糖 / gL -1 9.7 6.3 7.8 12.8 透明质酸 / gL -1 0.19 0.24 0.22 0.18 透明质酸产率 / gg -1 0.0063 0.0071 0.0069 0.0065 (三)种子培养基中金属离子及浓度对透明质酸发酵的影响 1．Mg2+的影响 对细胞来说，众多的金属离子当中，Mg2+是最为重要的一种，它是许多酶活性中心不可 缺少的一部分。在 EMP 途径之中，磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下形成烯醇式丙酮 酸和 ATP，是 EMP 途径的一个限速步骤，而 Mg2+对于丙酮酸激酶来说是必不可少的。由于 链球菌缺乏一个完整的 TCA 循环，它的能量主要来自 EMP 途径，因此需要提供适量的 Mg2+， 保证 H23 菌株胞内 EMP 途径的酶高效运转，使菌体生长良好。 表 6-2-6 MgSO47H2O 浓度对发酵的影响 MgSO47H2O /gL -1 1.0 1.5 2.0 2.5 种子 生物量 /gL -1 1.02 1.13 1.21 1.15 发酵 剩余葡萄糖 /gL -1 1.08 0.75 0.62 0.87 透明质酸 /gL -1 0.22 0.24 0.28 0.24 透明质酸产率 /gg -1 0.0074 0.0075 0.0083 0.0076 如表 6-2-6 所示，随着 MgSO47H2O 添加量的增大，种子液中细胞干重逐渐增大，当 MgSO47H2O 为 2.0 g/L 时，种子液中细胞干重达到最大值，产透明质酸性能也最佳。 2．Mn2+浓度的确定 与 Mg2+作用相类似，Mn2+也是一部分酶活性部位的组成成分。如表 6-2-7 所示
MnSO·4HO的浓度为0.10g/L时,种子液中细胞干重最大,增大浓度,细胞干重下降,说明 过高的MnSO44H2O浓度会抑制菌体生长。进行发酵试验,发现MnSO4HQO浓度为0.1g/L 的种子,其发酵生产性能也达到最佳状态,透明质酸的产量及产率系数也均为最高,无论增 加或是降低MnSO44H2O的浓度,发酵结果均有较大的下降 表6-2-7种子中MnSO44H2O浓度对发酵的影响 InSO4 4H2O/g L 0.10 Seed 生物量/gL1 0.9181.1310.8540.8490.790 葡萄糖/gL11.080.75093 发酵 透明质酸/gL10.1850.2710.2400.2030.162 透明质酸产率/gg0.00630.00830.00780.007200064 三、种子生长过程曲线和种龄的确定 种子质量的优劣不仅与培养基组成有关,还与种子的生理性状有关。当传代菌种接入种 子瓶(罐)中,要经过延滞期,对数生长期,静止期和死亡期。种龄太低的种子接入发酵罐中, 往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟,甚至造成异常发 酵:种龄过长则会引起菌体过早自溶,导致产物生产能力下降。通常,种龄以菌体处于生命 力极为旺盛的对数生长期后期,且培养液中细胞干重还未达到最高峰时较为合适,这样既可 保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞干重 图621为Sz00 epidemicus H23在种子培养基的生长过程曲线。从图中可以看出,菌种 接入种子培养基3~4h后进入对数生长期,18h左右细胞干重达到最高峰,在此之后,细胞 干重开始下降。因此选择接种种龄为15~16h 05101520230 t/h 图6-2-1透明质酸生产菌株H23的种子生长曲线 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 (一)不同氮源对透明质酸发酵的影响 如表6-2-8所示,当发酵培养基的氮源采用酵母粉时,菌体生长最好,透明质酸产量也最 高,接近03g/。酵母粉和蛋白胨的混合氮源及玉米浆居其次,其余均很低。不加氮源仅利用 种子中带入的氮源也可生长一定量菌体和合成一定的透明质酸。而采用无机氮源(NH4)SO时, 透明质酸产量和细胞干重都是实验组中最低的,说明(NH4)sO4对菌体的代谢有抑制。表6-28 还表明采用不同氮源时,细胞干重高,透明质酸产量也高。很多链球菌对营养要求比较高, 而酵母粉中还含有大量的生长因子,这也是 Streptococcus zooepidemicus H23以酵母粉为氮源时
10 MnSO44H2O 的浓度为 0.10 g/L 时，种子液中细胞干重最大，增大浓度，细胞干重下降，说明 过高的 MnSO44H2O 浓度会抑制菌体生长。进行发酵试验，发现 MnSO44H2O 浓度为 0.1 g/L 的种子，其发酵生产性能也达到最佳状态，透明质酸的产量及产率系数也均为最高，无论增 加或是降低 MnSO44H2O 的浓度，发酵结果均有较大的下降。 表 6-2-7 种子中 MnSO44H2O 浓度对发酵的影响 MnSO44H2O /gL -1 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Seed 生物量 /gL -1 0.918 1.131 0.854 0.849 0.790 发酵 葡萄糖 /gL -1 1.08 0.75 0.93 1.17 1.45 透明质酸 /gL -1 0.185 0.271 0.240 0.203 0.162 透明质酸产率 /gg -1 0.0063 0.0083 0.0078 0.0072 0.0064 三、种子生长过程曲线和种龄的确定 种子质量的优劣不仅与培养基组成有关，还与种子的生理性状有关。当传代菌种接入种 子瓶(罐)中，要经过延滞期，对数生长期，静止期和死亡期。种龄太低的种子接入发酵罐中， 往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至造成异常发 酵；种龄过长则会引起菌体过早自溶，导致产物生产能力下降。通常，种龄以菌体处于生命 力极为旺盛的对数生长期后期，且培养液中细胞干重还未达到最高峰时较为合适，这样既可 保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞干重。 图 6-2-1 为 S. zooepidemicus H23 在种子培养基的生长过程曲线。从图中可以看出，菌种 接入种子培养基 3～4 h 后进入对数生长期，18 h 左右细胞干重达到最高峰，在此之后，细胞 干重开始下降。因此选择接种种龄为 15~16 h。 生物量 /gL-1 t /h 图 6-2-1 透明质酸生产菌株 H23 的种子生长曲线 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 (一)不同氮源对透明质酸发酵的影响 如表6-2-8所示，当发酵培养基的氮源采用酵母粉时，菌体生长最好，透明质酸产量也最 高，接近0.3 g/L。酵母粉和蛋白胨的混合氮源及玉米浆居其次，其余均很低。不加氮源仅利用 种子中带入的氮源也可生长一定量菌体和合成一定的透明质酸。而采用无机氮源(NH4)2SO4时， 透明质酸产量和细胞干重都是实验组中最低的，说明(NH4)2SO4对菌体的代谢有抑制。表6-2-8 还表明采用不同氮源时，细胞干重高，透明质酸产量也高。很多链球菌对营养要求比较高， 而酵母粉中还含有大量的生长因子，这也是Streptococcus zooepidemicus H23以酵母粉为氮源时