第二章发酵过程优化原理 第一节发酵过程优化的微生物反应原理 概述 二、微生物生长反应 第二节发酵过程数量化方法 、数量化方法的基础 发酵过程的速度 、化学计量学和热力学 第三节微生物反应动力学 微生物生长的非结构动力学模型 二、微生物产物形成动力学模型 三、多底物动力学 第四节微生物反应优化的一般原理 30 、发酵过程优化的一般步骤 二、分批微生物反应过程的优化
第二章 发酵过程优化原理...............................................................................................1 第一节 发酵过程优化的微生物反应原理...................................................................1 一、概述 .............................................................................................................1 二、微生物生长反应............................................................................................1 第二节 发酵过程数量化方法................................................................................... 11 一、数量化方法的基础 ...................................................................................... 11 二、发酵过程的速度.......................................................................................... 13 三、化学计量学和热力学................................................................................... 15 第三节 微生物反应动力学...................................................................................... 21 一、微生物生长的非结构动力学模型 ................................................................. 22 二、微生物产物形成动力学模型 ........................................................................ 27 三、多底物动力学 ............................................................................................. 28 第四节 微生物反应优化的一般原理........................................................................ 30 一、发酵过程优化的一般步骤............................................................................ 30 二、分批微生物反应过程的优化 ........................................................................ 30
第二章发酵过程优化原理 第一节发酵过程优化的微生物反应原理 、概述 微生物是发酵工业的灵魂,对微生物控制的发酵过程进行优化,首先要了解微生物的生 长反应特性。微生物细胞生长是细胞个体内许多化学反应的综合结果。这些反应包括合成提 供其它反应需要的吉布斯自由能;利用底物合成结构单元,再聚合成大分子物质,供合成细 胞所需等。正常情况下,微生物细胞为了确保有序和高效生长,必须将这些反应有机地结合 在一起,经济地分配胞内各代谢途径的通量。 大肠杆菌是发酵研究中用得最多的微生物。在大肠杆菌生长过程中前人已观察到下列现 象 (1)在大肠杆菌快速生长期间,生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中,结构单元(氨 基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致; (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。细胞以高比生长速率生长时对蛋白 质的需求很高,因此相对于低的比生长速率来说,蛋白质合成系统(PSS)在细胞中占有很大比 例。在低比生长速率下,PSS的利用率很低,其合成和维护对微生物来说是无用的代谢负担 (3)一旦生长培养基中的结构单元足够,细胞就不再合成这些物质 (4)特定的代谢途径代谢特定的底物,只有底物存在时,细胞才合成相应的酶。例如,只 有当乳糖存在时,大肠杆菌才合成β-半乳糖苷酶将乳糖降解成半乳糖和葡萄糖 (5)若两个不同的底物同时存在于培养基中,细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速 率生长的酶系,当这种底物消耗完毕,再合成利用另一底物的酶。如大肠杆菌在含有葡萄糖 和乳糖的培养基中生长,首先代谢葡萄糖,此生长阶段不产生β-半乳糖苷酶,不能代谢乳糖 当葡萄糖浓度变得很低时,系统合成β-半乳糖苷酶并利用乳糖继续生长 以上观测结果对其它微生物也具有一定的适用性。由于微生物胞内代谢途径紧密结合 因此,对全部过程进行建模(如对特定微生物的生长和产物形成),并不需要描述所有独立的 反应。如对微生物生长建模时,可以将所有的代谢途径混合起来用几个单一反应来表示,有 时甚至用一个反应式就可描述全部的生长过程。本节主要讨论微生物生长反应的基本原理 二、微生物生长反应 细胞生长过程可分为三个步骤:(1)底物传递进入细胞:(2)通过胞内反应,将底物转变为 细胞质和代谢产物:(3)代谢产物排泄进入非生物相,即胞外培养基。 培养基中存在的底物都是化学物质,可以被细胞摄入并代谢掉,或转化为其它细胞生长 所需要的物质。有些代谢产物还可以作为二次底物被细胞利用,所以很难说这些物质到底是 底物还是产物。如酿酒酵母的二次生长现象,当酵母以葡萄糖为底物生长的同时会产生乙醇, 葡萄糖耗尽后,细胞能继续以乙醇为底物生长。根据在大肠杄菌生长过程中观察到的五种情 况类推,当培养基中存在葡萄糖时,细胞不产生代谢乙醇的酶。因此,在利用葡萄糖生长和 利用乙醇生长之间有一个滞后的阶段。在本书中,认为底物是最初存在于培养基中的底物 如上所述,葡萄糖是底物,而乙醇则是代谢产物。代谢产物是那些形成于胞内,能够穿过细 胞膜的物质,它们可以被排泄进入非生物相。因此,代谢产物既可以是底物经过多步反应形 成的小分子物质,也可以是细胞产生的大分子物质,如胞外蛋白酶。细胞质成分则是由底物 形成的、不能穿过细胞膜的物质。众所周知的细胞质成分有蛋白质、RNA和DNA,一些小
1 第二章 发酵过程优化原理 第一节 发酵过程优化的微生物反应原理 一、概述 微生物是发酵工业的灵魂，对微生物控制的发酵过程进行优化，首先要了解微生物的生 长反应特性。微生物细胞生长是细胞个体内许多化学反应的综合结果。这些反应包括合成提 供其它反应需要的吉布斯自由能；利用底物合成结构单元，再聚合成大分子物质，供合成细 胞所需等。正常情况下，微生物细胞为了确保有序和高效生长，必须将这些反应有机地结合 在一起，经济地分配胞内各代谢途径的通量。 大肠杆菌是发酵研究中用得最多的微生物。在大肠杆菌生长过程中前人已观察到下列现 象∶ (1)在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中，结构单元(氨 基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致； (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。细胞以高比生长速率生长时对蛋白 质的需求很高，因此相对于低的比生长速率来说，蛋白质合成系统(PSS)在细胞中占有很大比 例。在低比生长速率下，PSS 的利用率很低，其合成和维护对微生物来说是无用的代谢负担； (3)一旦生长培养基中的结构单元足够，细胞就不再合成这些物质； (4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶。例如，只 有当乳糖存在时，大肠杆菌才合成-半乳糖苷酶将乳糖降解成半乳糖和葡萄糖； (5)若两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速 率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。如大肠杆菌在含有葡萄糖 和乳糖的培养基中生长，首先代谢葡萄糖，此生长阶段不产生-半乳糖苷酶，不能代谢乳糖。 当葡萄糖浓度变得很低时，系统合成-半乳糖苷酶并利用乳糖继续生长。 以上观测结果对其它微生物也具有一定的适用性。由于微生物胞内代谢途径紧密结合， 因此，对全部过程进行建模(如对特定微生物的生长和产物形成)，并不需要描述所有独立的 反应。如对微生物生长建模时，可以将所有的代谢途径混合起来用几个单一反应来表示，有 时甚至用一个反应式就可描述全部的生长过程。本节主要讨论微生物生长反应的基本原理。 二、微生物生长反应 细胞生长过程可分为三个步骤：(1)底物传递进入细胞；(2)通过胞内反应，将底物转变为 细胞质和代谢产物；(3)代谢产物排泄进入非生物相，即胞外培养基。 培养基中存在的底物都是化学物质，可以被细胞摄入并代谢掉，或转化为其它细胞生长 所需要的物质。有些代谢产物还可以作为二次底物被细胞利用，所以很难说这些物质到底是 底物还是产物。如酿酒酵母的二次生长现象，当酵母以葡萄糖为底物生长的同时会产生乙醇， 葡萄糖耗尽后，细胞能继续以乙醇为底物生长。根据在大肠杆菌生长过程中观察到的五种情 况类推，当培养基中存在葡萄糖时，细胞不产生代谢乙醇的酶。因此，在利用葡萄糖生长和 利用乙醇生长之间有一个滞后的阶段。在本书中，认为底物是最初存在于培养基中的底物。 如上所述，葡萄糖是底物，而乙醇则是代谢产物。代谢产物是那些形成于胞内，能够穿过细 胞膜的物质，它们可以被排泄进入非生物相。因此，代谢产物既可以是底物经过多步反应形 成的小分子物质，也可以是细胞产生的大分子物质，如胞外蛋白酶。细胞质成分则是由底物 形成的、不能穿过细胞膜的物质。众所周知的细胞质成分有蛋白质、RNA 和 DNA，一些小
分子如ATP、NADH以及 NADPH也可以归为细胞质成分 基于以上的讨论,本书对底物、代谢产物和细胞质成分的定义为:底物是一种存在于初 始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物:代谢产物是一种作为代谢物产生于某代 谢途径进入非生物相的化合物;细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物 以下分别讨论运输过程(底物的摄入和产物的分泌)和胞内反应过程 (一)运输过程 大多数细胞的细胞质外有两种结构:细胞壁和细胞膜。这些结构是细胞的屏障,其化学 成分决定了物质能否在非生物相和细胞质之间运输。细胞壁是一种由交联肽聚糖构成的坚固 结构,其主要功能是为了防止因胞内高的渗透压而引起细胞破裂。细胞膜主要由磷脂组成, 在细胞生长过程中,具有变化的流动结构。大部分小分子很容易通过细胞壁,因此运输过程 主要决定于细胞膜。大分子物质只有在细胞具有特定的排泄机制时才可以通过细胞壁运输。 革兰氏阳性菌(如乳酸杆菌)的细胞壁厚度大约为35mm,比革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)薄 2nm左右。但是革兰氏阴性菌具有两层磷脂分子膜,其中一层位于细胞壁外。胞外的膜含有 蛋白质,能形成孔径足够大的通道,确保分子量800~900的分子能够自由进出。小的亲水 分子可以通过这些充满水的通道快速扩散,而大分子物质只有在一些特殊的情况下,才能由 转运蛋白运输到细胞内部。因此对于革兰氏阴性菌来说,其细胞膜的特性决定着物质进出细 胞的运输过程。 细胞膜由于胞内的渗透压而紧挨着细胞壁,但是革兰氏阴性菌和酵母细胞的细胞膜和细 胞壁之间通常还有一层,即周质空间。该层含有多种蛋白质,如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶 等水解酶,支持着20~40%的细胞质量。在周质空间可发生许多反应,这使得从胞外培养基 到细胞质的运输过程变得非常复杂。周质空间最主要的功能就是以所谓的“结合蛋白”的形 式富集底物,因此,非生物相和周质体空间的底物浓度不一定相同,在对运输过程建模时必 须考虑这些因素。 由于细胞膜是胞内和胞外环境的重要屏障,所以在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关 心的内容。日前的研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制:(1)自由扩散:(2)协助扩散 (3)主动运输。前两种机制是沿着浓度梯度进行运输,是被动的过程,在运输过程中不需要提 供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输,需要输入一定的吉布斯自由能。表2-1-1 总结了一些底物和代谢产物在细菌和真菌中的运输过程。可以发现大多数底物在这两种微生 物中以相同的方式进行运输。以下分别介绍三种运输过程的特征 表2-1-1微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程 化合物 细菌 真菌 氨基酸 动运输 主动运输 葡萄糖 主动运输 协助扩散和主动运输 乳糖 主动运输 协助扩散和主动运输 甘油 自由扩散,协助扩散自由扩散,协助扩散 乙醇 自由扩散 自由扩散 乳酸主动运输和自由扩散 自由扩散 乙酸 自由扩散 自由扩散 二氧化碳 自由扩散 自由扩散
2 分子如 ATP、NADH 以及 NADPH 也可以归为细胞质成分。 基于以上的讨论，本书对底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初 始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物；代谢产物是一种作为代谢物产生于某代 谢途径进入非生物相的化合物；细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物。 以下分别讨论运输过程(底物的摄入和产物的分泌)和胞内反应过程。 (一)运输过程 大多数细胞的细胞质外有两种结构：细胞壁和细胞膜。这些结构是细胞的屏障，其化学 成分决定了物质能否在非生物相和细胞质之间运输。细胞壁是一种由交联肽聚糖构成的坚固 结构，其主要功能是为了防止因胞内高的渗透压而引起细胞破裂。细胞膜主要由磷脂组成， 在细胞生长过程中，具有变化的流动结构。大部分小分子很容易通过细胞壁，因此运输过程 主要决定于细胞膜。大分子物质只有在细胞具有特定的排泄机制时才可以通过细胞壁运输。 革兰氏阳性菌(如乳酸杆菌)的细胞壁厚度大约为 35 nm，比革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)薄 2 nm 左右。但是革兰氏阴性菌具有两层磷脂分子膜，其中一层位于细胞壁外。胞外的膜含有 蛋白质，能形成孔径足够大的通道，确保分子量 800～900 的分子能够自由进出。小的亲水 分子可以通过这些充满水的通道快速扩散，而大分子物质只有在一些特殊的情况下，才能由 转运蛋白运输到细胞内部。因此对于革兰氏阴性菌来说，其细胞膜的特性决定着物质进出细 胞的运输过程。 细胞膜由于胞内的渗透压而紧挨着细胞壁，但是革兰氏阴性菌和酵母细胞的细胞膜和细 胞壁之间通常还有一层，即周质空间。该层含有多种蛋白质，如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶 等水解酶，支持着 20～40%的细胞质量。在周质空间可发生许多反应，这使得从胞外培养基 到细胞质的运输过程变得非常复杂。周质空间最主要的功能就是以所谓的“结合蛋白”的形 式富集底物，因此，非生物相和周质体空间的底物浓度不一定相同，在对运输过程建模时必 须考虑这些因素。 由于细胞膜是胞内和胞外环境的重要屏障，所以在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关 心的内容。目前的研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散；(2)协助扩散； (3)主动运输。前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，是被动的过程，在运输过程中不需要提 供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能。表 2-1-1 总结了一些底物和代谢产物在细菌和真菌中的运输过程。可以发现大多数底物在这两种微生 物中以相同的方式进行运输。以下分别介绍三种运输过程的特征。 表 2-1-1 微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程 化合物 细菌 真菌 氨基酸 葡萄糖 乳糖 甘油 乙醇 乳酸 乙酸 二氧化碳 主动运输 主动运输 主动运输 自由扩散，协助扩散 自由扩散 主动运输和自由扩散 自由扩散 自由扩散 主动运输 协助扩散和主动运输 协助扩散和主动运输 自由扩散，协助扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散
自由扩散 自由扩散 水 自由扩散 自由扩散 广散 底物自由扩散通过脂膜包括三个步骤:(1)底物从胞外培养基运输到膜相;(2)分子在脂膜 中扩散:(3)从脂相进入细胞质。一般情况下,细胞质具有和胞外培养基相似的物理和化学性 质,因此,步骤(1)和3)相似。相内的过程可认为处于平衡,也就是说这些过程的特征时间要 比分子扩散通过脂膜层的特征时间短得多。界面上脂膜层物质的浓度一般指水相中产物的浓 度,分配系数Kμ就是化合物在脂层的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子扩散的质量 通量遵守Fick第一定律,化合物通过厚度为dmcm的质膜进入细胞的传质速率可以用方程 (2-1-1)表示 J=mem,(c-Ch (2-1-1) nien 式中,Dnm为化合物在质膜中的扩散系数,ca和cb分别为非生物相(胞外培养基)和生物 相(细胞质)中化合物的浓度。 DmemKpaddmem的比率又称渗透系数P,经常用于传质的计算。如 果缺乏渗透系数,可以用式(2-1-2)进行粗略的估计。 =0.028Ko 式中,Mw为化合物的分子量,Km为化合物在橄榄油~水体系中的分配系数,P的单 位为cm/s。通过大量不同化合物的测量,已经得到了它们之间的相互关系式。然而在使用该 关系式时,有些化合物的P值可能会偏离方程预测值。 如果定义ac为细胞的比表面积(m2/g干细胞),那么化合物的比运输速率为 对于球形细胞来说,含水率为w(g/g),细胞密度为p(g/m3),则比表面积为 6 del, (1-w)p 通过自由扩散进行运输的化学物质主要有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等。在电 离状态下,小分子有机酸在脂膜中实际上是不溶的,此时应当用膜两边的非电离有机酸的浓 度来代替方程(2-1-1)中的总浓度ca和cb,这些浓度可通过式(2-1-4)计算得到 (K。10m+1)c (2-1-4) 式中,K为酸的电离常数。可以看到,膜表面水相的pH值对 Ciundiss有影响,由于胞内 外pH一般不同,尽管ca=cb,理论上仍然有可能有一定流量的酸通过膜。此外,尽管有机酸 能迅速达到电离平衡,同时,在水相和脂相中未电离的酸也达到溶解平衡,但水相中靠近脂 膜的地方仍然有可能存在一薄膜层。假如胞内的酸浓度比胞外培养基中高得多,未电离的酸 就会持续转移入脂膜,促使电离平衡向未电离方向移动,多数酸就溶解在脂膜中。在膜的培 养基这边,未电离酸的浓度很高,快速电离促使脂相中的未电离的酸进入水相。这样,我们 可以利用方程(2-1-1)模拟小分子有机酸的情况,只有当假设的膜层不合理时,才需要修正膜 内的pH差异。 为了更好地理解自由扩散的意义,让我们来看一下乳酸的分泌过程。乳酸菌从葡萄糖转
3 氧气 水 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 1、自由扩散 底物自由扩散通过脂膜包括三个步骤：(1)底物从胞外培养基运输到膜相；(2)分子在脂膜 中扩散；(3)从脂相进入细胞质。一般情况下，细胞质具有和胞外培养基相似的物理和化学性 质，因此，步骤(1)和(3)相似。相内的过程可认为处于平衡，也就是说这些过程的特征时间要 比分子扩散通过脂膜层的特征时间短得多。界面上脂膜层物质的浓度一般指水相中产物的浓 度，分配系数 Kpar就是化合物在脂层的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子扩散的质量 通量遵守 Fick 第一定律，化合物通过厚度为 dmem 的质膜进入细胞的传质速率可以用方程 (2-1-1)表示。 ( ) par a b mem mem K c c d D J = − (2-1-1) 式中，Dmem为化合物在质膜中的扩散系数，ca和 cb 分别为非生物相(胞外培养基)和生物 相(细胞质)中化合物的浓度。DmemKpar/dmem的比率又称渗透系数 P，经常用于传质的计算。如 果缺乏渗透系数，可以用式(2-1-2)进行粗略的估计。 oil P Mw 028Kpar = 0. (2-1-2) 式中，Mw 为化合物的分子量， oil Kpar 为化合物在橄榄油～水体系中的分配系数，P 的单 位为 cm/s。通过大量不同化合物的测量，已经得到了它们之间的相互关系式。然而在使用该 关系式时，有些化合物的 P 值可能会偏离方程预测值。 如果定义 acell 为细胞的比表面积(m2 /g 干细胞)，那么化合物的比运输速率为 ( ) cell cell a b r = J a = P a c − c (2-1-3) 对于球形细胞来说，含水率为 w(g/g)，细胞密度为(g/m3 )，则比表面积为 cell cell cell d w a (1 ) 6 − = 通过自由扩散进行运输的化学物质主要有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等。在电 离状态下，小分子有机酸在脂膜中实际上是不溶的，此时应当用膜两边的非电离有机酸的浓 度来代替方程(2-1-1)中的总浓度 ca和 cb，这些浓度可通过式(2-1-4)计算得到∶ i pH i undiss a c K c i 1 , ( 10 1) − = + (2-1-4) 式中，Ka为酸的电离常数。可以看到，膜表面水相的 pH 值对 ci,undiss 有影响，由于胞内 外 pH 一般不同，尽管 ca=cb，理论上仍然有可能有一定流量的酸通过膜。此外，尽管有机酸 能迅速达到电离平衡，同时，在水相和脂相中未电离的酸也达到溶解平衡，但水相中靠近脂 膜的地方仍然有可能存在一薄膜层。假如胞内的酸浓度比胞外培养基中高得多，未电离的酸 就会持续转移入脂膜，促使电离平衡向未电离方向移动，多数酸就溶解在脂膜中。在膜的培 养基这边，未电离酸的浓度很高，快速电离促使脂相中的未电离的酸进入水相。这样，我们 可以利用方程(2-1-1)模拟小分子有机酸的情况，只有当假设的膜层不合理时，才需要修正膜 内的 pH 差异。 为了更好地理解自由扩散的意义，让我们来看一下乳酸的分泌过程。乳酸菌从葡萄糖转
变为乳酸的过程中获得吉布斯自由能。为了保持胞内的pH不变,细胞必须将代谢产物乳酸 排泄入非生物相。乳酸的渗透系数大约为1.5×10cm,乳酸菌是直径约为1pm的球形细 胞,含水量80%,细胞的密度10°gm3,细胞的比表面积为30m2g干重,代入方程(2-1-3), 得到 ra=(1.5×106ms1×30m2g干重)cacb) =(45×105m3sl/g干重c-c) 在细胞的快速生长阶段,乳酸的产生速度大约为14mg(g干细胞s)由方程(2-1-5)可知, 当胞外培养基和细胞质之间的浓度小至31g/m3时,扩散过程就可以将产生的乳酸转移出细 乳酸通过脂膜的快速扩散还可以解释许多细菌胞内乳酸及其它小分子有机酸的毒性效 应。胞外乳酸浓度高时,胞内的浓度也很高。由于乳酸的电离常数很小,细胞很难维持胞内 最适pH在7左右。尽管存在乳酸的主动运输系统,但通过细胞膜的快速自由扩散导致乳酸 仍然会连续流入细胞。 2、协助扩散 细胞膜中有许多转运蛋白,允许特定的化合物进行被动运输,但比自由扩散通过细胞又 快得多,这一过程就是协助扩散。真菌中这种运输机制是很典型的,在细菌中则比较少见 文献报道只有甘油是通过协助扩散进入大肠杆菌细胞的。协助扩散与自由扩散相似,因为只 有存在浓度梯度时,由高浓度向低浓度的运输才可能发生。化合物在自由转运物的存在下才 能进入细胞,故运输速率遵循典型的饱和型动力学:如在低浓度下,运输速率与底物浓度呈 级相关,而在高浓度时则呈现零级相关。真菌中通过协助扩散的底物主要有葡萄糖和其它 糖类。 离子可以通过细胞特定蛋白(类似于革兰氏阴性菌细胞外膜的 porIn)形成的孔道而被摄 入。当离子进入到孔道,内部就形成一种电荷,可以防止其它离子进入。离子孔道和转运蛋 白具有相似的功能,研究发现通过离子孔道的运输也遵循饱和型动力学 3、主动运输 主动运输与协助扩散的相似之处在于,两者都以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介 与协助扩散相比,主动运输可以逆着浓度梯度的方向进行运输,因此是一个耗能的过程。运 输过程中需要的自由能可以靠消耗ATP中的高能磷酸键来维持(一级主动运输),或者和其它 沿着浓度梯度方向的运输过程结合在一起(次级主动运输)。对于有些底物存在一种特别的主 动运输过程,即所谓的基团移位,它是指底物在穿过细胞膜时,转变成不可渗透的异构体。 在氧化磷酸化过程中释放质子就是一个重要的一级主动运输过程。原核生物将质子释放 到胞外培养基,例如穿过质膜而泵出体外。而在真核生物中,氧化磷酸化发生在线粒体内 质子穿过线粒体内膜而运输到线粒体内膜和外膜之间。在这两种情况下,质子的泵出是通过 氧化NADH而释放大量的自由能来推动的。质子穿过膜的过程中会产生电化学势,将质子运 输回细胞(或线粒体内),就可以获得吉布斯自由能。质子的内流是由参与了AP合成的ATP 酶传递的,其运输是可逆的,如ATP酶也可以通过消耗AP的方式将质子泵出细胞,这也 是一个一级主动运输过程。质子的运输过程如图2-1-1所示
4 变为乳酸的过程中获得吉布斯自由能。为了保持胞内的 pH 不变，细胞必须将代谢产物乳酸 排泄入非生物相。乳酸的渗透系数大约为 1.5×10-4 cm/s，乳酸菌是直径约为 1 m 的球形细 胞，含水量 80%，细胞的密度 106 g/m3，细胞的比表面积为 30 m2 /g 干重，代入方程(2-1-3)， 得到∶ rlac =(1.5×10-6 ms -1×30 m2 /g 干重)(ca-cb) =(4.5×10-5 m3 s -1 /g 干重)(ca-cb) (2-1-5) 在细胞的快速生长阶段，乳酸的产生速度大约为 1.4 mg/(g 干细胞s)。由方程(2-1-5)可知， 当胞外培养基和细胞质之间的浓度小至 31 g/m3 时，扩散过程就可以将产生的乳酸转移出细 胞。 乳酸通过脂膜的快速扩散还可以解释许多细菌胞内乳酸及其它小分子有机酸的毒性效 应。胞外乳酸浓度高时，胞内的浓度也很高。由于乳酸的电离常数很小，细胞很难维持胞内 最适 pH 在 7 左右。尽管存在乳酸的主动运输系统，但通过细胞膜的快速自由扩散导致乳酸 仍然会连续流入细胞。 2、协助扩散 细胞膜中有许多转运蛋白，允许特定的化合物进行被动运输，但比自由扩散通过细胞又 快得多，这一过程就是协助扩散。真菌中这种运输机制是很典型的，在细菌中则比较少见， 文献报道只有甘油是通过协助扩散进入大肠杆菌细胞的。协助扩散与自由扩散相似，因为只 有存在浓度梯度时，由高浓度向低浓度的运输才可能发生。化合物在自由转运物的存在下才 能进入细胞，故运输速率遵循典型的饱和型动力学∶如在低浓度下，运输速率与底物浓度呈 一级相关，而在高浓度时则呈现零级相关。真菌中通过协助扩散的底物主要有葡萄糖和其它 糖类。 离子可以通过细胞特定蛋白(类似于革兰氏阴性菌细胞外膜的 porin)形成的孔道而被摄 入。当离子进入到孔道，内部就形成一种电荷，可以防止其它离子进入。离子孔道和转运蛋 白具有相似的功能，研究发现通过离子孔道的运输也遵循饱和型动力学。 3、主动运输 主动运输与协助扩散的相似之处在于，两者都以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介。 与协助扩散相比，主动运输可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程。运 输过程中需要的自由能可以靠消耗 ATP 中的高能磷酸键来维持(一级主动运输)，或者和其它 沿着浓度梯度方向的运输过程结合在一起(次级主动运输)。对于有些底物存在一种特别的主 动运输过程，即所谓的基团移位，它是指底物在穿过细胞膜时，转变成不可渗透的异构体。 在氧化磷酸化过程中释放质子就是一个重要的一级主动运输过程。原核生物将质子释放 到胞外培养基，例如穿过质膜而泵出体外。而在真核生物中，氧化磷酸化发生在线粒体内， 质子穿过线粒体内膜而运输到线粒体内膜和外膜之间。在这两种情况下，质子的泵出是通过 氧化 NADH 而释放大量的自由能来推动的。质子穿过膜的过程中会产生电化学势，将质子运 输回细胞(或线粒体内)，就可以获得吉布斯自由能。质子的内流是由参与了 ATP 合成的 ATP 酶传递的，其运输是可逆的，如 ATP 酶也可以通过消耗 ATP 的方式将质子泵出细胞，这也 是一个一级主动运输过程。质子的运输过程如图 2-1-1 所示
图2-1-1质子的运输 次级主动运输指的是:在消耗已经建立的其它物质浓度梯度的基础上运输物质穿过细 胞膜。如果这两种底物沿着相同的方向进行运输,称为同向转移;若两种底物沿着相反的方 向进行运输,称为反向转移;如果电化学势驱动离子进行运输,则称为单向转移。一般情况 下,次级主动运输是和穿过细胞膜的pH梯度相耦合的,为了保持胞内plH稳定,必须用AP 酶将质子泵出细胞。由于该过程需要能量,其宏观表现就是次级主动运输过程需要消耗胞内 能量。次级主动运输的例子有:微生物通过透性酶摄入糖类。在这个过程中,糖和一个质子 结合在一起运输到细胞质中,即质子同向运输:此外还有大肠杆菌中的乳糖透性酶系统。研 究者发现在乳糖一质子运输过程中,两种物质的化学计量比为1:1。在其它运输过程中尚未 发现到类似的简单化学计量比 基团移位是主动运输过程的一种重要类型。在该过程中,运输过程和被运输底物的并发 转变耦合在一起。最为人熟知的基团移位的例子是细菌用来摄取糖类的磷酸转移酶系统 (PTS)。在这个系统中,糖类在被运输之前先被磷酸化,所需的磷酸基团由EM途径的中间 体磷酸烯醇式丙酮酸提供。参与磷酸基团的转移的蛋白至少有4种(见图2-1-2),其中反应链 的最后一环可作为转运蛋白运输糖类穿过细胞膜。反应链中的后两种蛋白对于特定的糖来说 是特异的,而前两种蛋白在不同的PTSs中都是相同的。葡萄糖在PTSs运输下进入细胞时 直接被转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。PEP中的高能磷酸键由此得以保留,因此从能量的角度 来看,这种摄入葡萄糖的过程比通过透性酶摄入葡萄糖更经济。此外,和其它摄入系统相比, PISs对糖类的摄入具有很高的速率。这可以用来解释为什么PTSs主要存在于发酵性细菌中 (从糖代谢生成AP的量比呼吸性细菌少),如严格好氧菌 Azotobacter I中不含有PISs,而厌 氧菌和兼性厌氧菌,如乳酸菌属和埃希氏菌属,却拥有针对几种不同糖的PISsε丝状真菌和 酵母也不含PISs
5 图 2-1-1 质子的运输 次级主动运输指的是∶在消耗已经建立的其它物质浓度梯度的基础上运输物质穿过细 胞膜。如果这两种底物沿着相同的方向进行运输，称为同向转移；若两种底物沿着相反的方 向进行运输，称为反向转移；如果电化学势驱动离子进行运输，则称为单向转移。一般情况 下，次级主动运输是和穿过细胞膜的 pH 梯度相耦合的，为了保持胞内 pH 稳定，必须用 ATP 酶将质子泵出细胞。由于该过程需要能量，其宏观表现就是次级主动运输过程需要消耗胞内 能量。次级主动运输的例子有：微生物通过透性酶摄入糖类。在这个过程中，糖和一个质子 结合在一起运输到细胞质中，即质子同向运输；此外还有大肠杆菌中的乳糖透性酶系统。研 究者发现在乳糖—质子运输过程中，两种物质的化学计量比为 1:1。在其它运输过程中尚未 发现到类似的简单化学计量比。 基团移位是主动运输过程的一种重要类型。在该过程中，运输过程和被运输底物的并发 转变耦合在一起。最为人熟知的基团移位的例子是细菌用来摄取糖类的磷酸转移酶系统 (PTS)。在这个系统中，糖类在被运输之前先被磷酸化，所需的磷酸基团由 EMP 途径的中间 体磷酸烯醇式丙酮酸提供。参与磷酸基团的转移的蛋白至少有 4 种(见图 2-1-2)，其中反应链 的最后一环可作为转运蛋白运输糖类穿过细胞膜。反应链中的后两种蛋白对于特定的糖来说 是特异的，而前两种蛋白在不同的 PTSs 中都是相同的。葡萄糖在 PTSs 运输下进入细胞时， 直接被转化为 6-磷酸葡萄糖(G6P)。PEP 中的高能磷酸键由此得以保留，因此从能量的角度 来看，这种摄入葡萄糖的过程比通过透性酶摄入葡萄糖更经济。此外，和其它摄入系统相比， PTSs 对糖类的摄入具有很高的速率。这可以用来解释为什么 PTSs 主要存在于发酵性细菌中 (从糖代谢生成 ATP 的量比呼吸性细菌少)，如严格好氧菌 Azotobacter 中不含有 PTSs，而厌 氧菌和兼性厌氧菌，如乳酸菌属和埃希氏菌属，却拥有针对几种不同糖的 PTSs。丝状真菌和 酵母也不含 PTSs
图2-1-2某些细菌中用于摄取糖类的PTS图解 (二)胞内反应 底物运输进入细胞质后,要经过1000多步胞内反应转化为代谢产物和细胞成分,这些 成分在大小和功能上存在差异,但是90%以上的细胞物质都是由蛋白质、RNA、DNA、脂类 和碳水化合物等大分子组成的。大分子物质是通过底物的合成代谢反应而形成的,在此过程 中,底物首先转化为氨基酸和核酸等结构单元,然后这些结构单元聚合成大分子。培养基的 成分决定了细胞的合成代谢活力。当细胞在含有所有氨基酸的复杂培养基上生长,正常情况 下不会再合成这些化合物。微生物的种不同,其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只 含有糖、无机氮和少量无机盐的培养基中生长,而有些微生物则需要在含有一些结构单元的 复合培养基上生长。合成代谢反应需要消耗吉布斯自由能和还原力,吉布斯自由能主要靠AIP 中的高能磷酸键来提供,而还原力则由辅酶 NADPH来提供。AP中的髙能磷酸键水解可释 放大量的吉布斯自由能: ATP+H20=ADP+~P△G=30.5kJ/摩尔 式中,~P表示磷酸基团。ΔG为正的反应,可以通过水解AIP所释放的吉布斯自由能 来起动。当 NADPH被氧化成NADP+,释放两个电子,转移到细胞内其它化合物上使其还原。 ATP和 NADPH是在底物转化为能量更低的化合物的分解代谢反应中形成的,下面即对分解 代谢和合成代谢作一介绍 分解代谢反应 最常用于细胞生长的能源是糖类,它们在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等) 的同时,还形成ATP、NADH和 NADPH。其中NADH是和 NADPH相似的一种辅酶。NADH 和 NADPH都在分解代谢反应中产生,但 NADPH主要消耗于合成代谢中,NADH则主要消 耗于分解代谢途径,如氧化磷酸化 大多数糖类在代谢之前都首先转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)。正常情况 下,胞内G6P和F6P处于异构平衡。G6P可以作为许多糖代谢反应链的起点,有些微生物在 运输葡萄糖的过程中形成G6P,但另一些微生物则通过胞内葡萄糖与AP水解相耦合的反应 形成G6P。一般将糖从G6P开始的代谢分成酵解(EMP)和丙酮酸代谢两个部分。在EMP途 径中,G6P转化为丙酮酸,从葡萄糖开始的总的计量式如方程(2-1-7)所示 GIc+2ADP+2--P-+2NAD+- 2PYR+2ATP-+2H20+2NADH-+2H*=0 (2-1-7 F6P转化为1,6-二磷酸果糖的ΔG为正,需要ATP水解提供能量才能进行。因AIP(或 PEP)用于由葡萄糖形成G6P,故ATP的净产率是每摩尔葡萄糖转化为丙酮酸时产生2摩尔
6 图 2-1-2 某些细菌中用于摄取糖类的 PTS 图解 (二)胞内反应 底物运输进入细胞质后，要经过 1000 多步胞内反应转化为代谢产物和细胞成分，这些 成分在大小和功能上存在差异，但是 90%以上的细胞物质都是由蛋白质、RNA、DNA、脂类 和碳水化合物等大分子组成的。大分子物质是通过底物的合成代谢反应而形成的，在此过程 中，底物首先转化为氨基酸和核酸等结构单元，然后这些结构单元聚合成大分子。培养基的 成分决定了细胞的合成代谢活力。当细胞在含有所有氨基酸的复杂培养基上生长，正常情况 下不会再合成这些化合物。微生物的种不同，其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只 含有糖、无机氮和少量无机盐的培养基中生长，而有些微生物则需要在含有一些结构单元的 复合培养基上生长。合成代谢反应需要消耗吉布斯自由能和还原力，吉布斯自由能主要靠 ATP 中的高能磷酸键来提供，而还原力则由辅酶 NADPH 来提供。ATP 中的高能磷酸键水解可释 放大量的吉布斯自由能： ATP＋H20＝ADP＋～P G0=-30.5 kJ/摩尔 (2-1-6) 式中，~P 表示磷酸基团。ΔG 为正的反应，可以通过水解 ATP 所释放的吉布斯自由能 来起动。当 NADPH 被氧化成 NADP+，释放两个电子，转移到细胞内其它化合物上使其还原。 ATP 和 NADPH 是在底物转化为能量更低的化合物的分解代谢反应中形成的，下面即对分解 代谢和合成代谢作一介绍。 1、分解代谢反应 最常用于细胞生长的能源是糖类，它们在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等) 的同时，还形成 ATP、NADH 和 NADPH。其中 NADH 是和 NADPH 相似的一种辅酶。NADH 和 NADPH 都在分解代谢反应中产生，但 NADPH 主要消耗于合成代谢中，NADH 则主要消 耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化。 大多数糖类在代谢之前都首先转化为 6-磷酸葡萄糖(G6P)或 6-磷酸果糖(F6P)。正常情况 下，胞内 G6P 和 F6P 处于异构平衡。G6P 可以作为许多糖代谢反应链的起点，有些微生物在 运输葡萄糖的过程中形成 G6P，但另一些微生物则通过胞内葡萄糖与 ATP 水解相耦合的反应 形成 G6P。一般将糖从 G6P 开始的代谢分成酵解(EMP)和丙酮酸代谢两个部分。在 EMP 途 径中，G6P 转化为丙酮酸，从葡萄糖开始的总的计量式如方程(2-1-7)所示。 Glc＋2ADP＋2～P＋2NAD+ → 2PYR＋2ATP＋2H2O＋2NADH＋2H+=0 (2-1-7) F6P 转化为 1,6-二磷酸果糖的ΔG 为正，需要 ATP 水解提供能量才能进行。因 ATP(或 PEP)用于由葡萄糖形成 G6P，故 ATP 的净产率是每摩尔葡萄糖转化为丙酮酸时产生 2 摩尔
ATP。1摩尔葡萄糖经过部分氧化得到2摩尔丙酮酸所释放的四个电子,被2摩尔NAD俘获 形成2摩尔NADH 磷酸戊糖(P)途径的主要作用是为合成代谢提供以 NADPH为表现形式的还原力和合成 核酸的前体物质5-磷酸核糖(R5P)。由于P途径存在分枝点,对于需要R5P和 NADPH的细 胞来说,存在4种可能的化学计量式(表2-1-2)。 表2-1-24种情况下PP途径的化学计量式 情况 化学计量式 对RP的需求远大于5G6P+5ATP→6RsP+5ADP+4H2O+4~P NADPH 对R5P和 NADPH的需求平G6P+2NADP+H2O→R5P+2 NADPH+2H+CO2 对 NADPH的需求远大于G6P+12NADP++7H2O 12NADPH-+12H*+6C0+A-P R5P,且G6P完全氧化为 对 NADPH的需求远大于3G6P+6NADP++5NAD+5~P+8ADP→ R5P,且G6P转化为丙酮酸5PYR+3CO2+6 NADPH+5NADH+8ATP+2H2O EMP途径形成的丙酮酸脱羧形成乙酰CoA后进入三羧酸循环(ICA),并被完全氧化生成 CO2和水。在TCA循环中,1摩尔丙酮酸完全氧化可形成1摩尔ATP,4摩尔NADH和1摩 尔FADH2。丙酮酸在TCA循环中被完全转化的先决条件是:NAD和FAD可以从NADH和 FADH2中再生。该过程在呼吸链中发生,因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸链中, NADH脱氢酶将电子从NADH传递到辅酶UQ,再从辅酶UQ经过一系列细胞色素(含有亚 铁血红素基团的蛋白),最后传递给氧形成水。细胞色素或辅酶UQ位于细胞膜上或附近(或 真核细胞线粒体的内膜),当电子经过呼吸链,质子就通过膜层泵出细胞。当质子在ATP酶 的作用下再进入细胞(或线粒体),ADP就被磷酸化形成ATP,因此呼吸链通常也被称为氧化 磷酸化。质子可以通过呼吸链上的3个位点泵过细胞膜。根据化学计量式可知,理论上1摩 尔NADH氧化可形成3摩尔ATP: NADH-+0.502+3ADP-+3-P+3H+- NAD*+3ATP+4H2O (2-1-8) 对于 NADPH也有相似的反应,但是该辅酶主要用于生物合成。FADH2在辅酶UQ处进 入呼吸链,故电子不经过NADH脱氢酶。FADH2的氧化只导致质子在两个位点泵过细胞膜, 化学计量式和方程(2-1-8)有所区别。 FADH,-+0.50,+2ADP+2-P+2H+- FAD*+2ATP+3H,O (2-1-9) 氧化磷酸化中每个氧原子所形成ATP的摩尔数通常称为磷氧比(P/O),这个参数经常用 于能量的计算,此处不作详细介绍。由方程(2-1-8)可以看出,如果NADH是代谢反应形成的 唯一辅酶,理论PO值即为3,但是FADH2的PO通常小于3。FADH2和NADH之比会随 着操作条件而变化,因此P/O不是一个常数 真核生物的情况可能更为复杂。NADH在细胞质中形成(酵解),线粒体中也形成NADH 细胞质中形成的NADH不能穿过线粒体膜,它氧化为NAD是和线粒体中FAD还原为FADH 的反应耦联进行的。细胞质中NADH在FADH2的位置进入呼吸链,所以细胞质NADH氧化 的理论PO只有2。为了计算总的PO,有必要将细胞质中发生的反应和线粒体中发生的反
7 ATP。1 摩尔葡萄糖经过部分氧化得到 2 摩尔丙酮酸所释放的四个电子，被 2 摩尔 NAD+俘获 形成 2 摩尔 NADH。 磷酸戊糖(PP)途径的主要作用是为合成代谢提供以 NADPH 为表现形式的还原力和合成 核酸的前体物质 5-磷酸核糖(R5P)。由于 PP 途径存在分枝点，对于需要 R5P 和 NADPH 的细 胞来说，存在 4 种可能的化学计量式(表 2-1-2)。 表 2-1-2 4 种情况下 PP 途径的化学计量式 情况 化学计量式 对 R5P 的需求远大于 NADPH 5G6P＋5ATP → 6R5P＋5ADP＋4H2O＋4～P 对R5P和NADPH的需求平 衡 G6P＋2NADP+＋H2O → R5P＋2NADPH＋2H+＋CO2 对 NADPH 的需求远大于 R5P，且 G6P 完全氧化为 CO2 G6P＋12NADP+＋7H2O → 12NADPH＋12H+＋6CO2＋～P 对 NADPH 的需求远大于 R5P，且 G6P 转化为丙酮酸 3G6P＋6NADP+＋5NAD+＋5～P＋8ADP → 5PYR＋3CO2＋6NADPH＋5NADH＋8ATP＋2H2O EMP 途径形成的丙酮酸脱羧形成乙酰 CoA 后进入三羧酸循环(TCA)，并被完全氧化生成 CO2 和水。在 TCA 循环中，1 摩尔丙酮酸完全氧化可形成 1 摩尔 ATP，4 摩尔 NADH 和 1 摩 尔 FADH2。丙酮酸在 TCA 循环中被完全转化的先决条件是∶NAD+和 FAD 可以从 NADH 和 FADH2 中再生。该过程在呼吸链中发生，因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸链中， NADH 脱氢酶将电子从 NADH 传递到辅酶 UQ，再从辅酶 UQ 经过一系列细胞色素(含有亚 铁血红素基团的蛋白)，最后传递给氧形成水。细胞色素或辅酶 UQ 位于细胞膜上或附近(或 真核细胞线粒体的内膜)，当电子经过呼吸链，质子就通过膜层泵出细胞。当质子在 ATP 酶 的作用下再进入细胞(或线粒体)，ADP 就被磷酸化形成 ATP，因此呼吸链通常也被称为氧化 磷酸化。质子可以通过呼吸链上的 3 个位点泵过细胞膜。根据化学计量式可知，理论上 1 摩 尔 NADH 氧化可形成 3 摩尔 ATP∶ NADH＋0.5O2＋3ADP＋3～P＋3H+ → NAD+＋3ATP＋4H2O (2-1-8) 对于 NADPH 也有相似的反应，但是该辅酶主要用于生物合成。FADH2 在辅酶 UQ 处进 入呼吸链，故电子不经过 NADH 脱氢酶。FADH2 的氧化只导致质子在两个位点泵过细胞膜， 化学计量式和方程(2-1-8)有所区别。 FADH2＋0.5O2＋2ADP＋2～P＋2H+ → FAD+＋2ATP＋3H2O (2-1-9) 氧化磷酸化中每个氧原子所形成 ATP 的摩尔数通常称为磷氧比(P/O)，这个参数经常用 于能量的计算，此处不作详细介绍。由方程(2-1-8)可以看出，如果 NADH 是代谢反应形成的 唯一辅酶，理论 P/O 值即为 3，但是 FADH2 的 P/O 通常小于 3。FADH2 和 NADH 之比会随 着操作条件而变化，因此 P/O 不是一个常数。 真核生物的情况可能更为复杂。NADH 在细胞质中形成(酵解)，线粒体中也形成 NADH。 细胞质中形成的 NADH 不能穿过线粒体膜，它氧化为 NAD+是和线粒体中 FAD 还原为 FADH2 的反应耦联进行的。细胞质中 NADH 在 FADH2 的位置进入呼吸链，所以细胞质 NADH 氧化 的理论 P/O 只有 2。为了计算总的 P/O，有必要将细胞质中发生的反应和线粒体中发生的反
应区别开来,由于这两种情况下形成的NADH的比率随操作条件而变,一般不能指定P/O 的值,除非知道理论值在2~3之间。在实际情况中,氧化反应和磷酸化过程不可能完全耦 合,所以PO值低于理论值 当缺乏氧或必需的蛋白质导致氧化磷酸化失活时,丙酮酸不能在TCA循环中氧化,否 则将导致NADH在细胞内的积累。这种情况下,NADH被氧化的同时,丙酮酸可被还原为 乙酸、乳酸或乙醇。这些过程统称为发酵性代谢。发酵性代谢因微生物种类而异。从图 2-1-3(ab,c)可以看出,一些微生物是如何通过发酵性代谢平衡EMP途径产生的NADH的。 如果乳酸是最终的代谢产物,所有EMP途径中利用的NAD都可以再生:而若乙醇是代谢产 物时,NAD就会过剩,因为从碳元素的角度分析,每摩尔葡萄糖最多只能产生2/3摩尔乙醇, 其它的碳转化为CO2或甲酸;形成乙酸时,NADH也过剩,同样可得出类似的结果。大肠杆 菌的发酵性代谢中可形成图2-1-3中所示的代谢产物,因此,这种现象通常又称作混合酸发 酵。大肠杆菌和乳酸菌的主要区别在于大肠杆菌缺乏在丙酮酸降解为乙酰CoA时生成CO2 的能力。 图2-1-3 Escherichia(A), Lactococci(B和 Saccharomyces(C)在葡萄糖上的发酵性代谢 酵母中丙酮酸的代谢(图2-1-3-C)相对更复杂一些。TCA循环中化合物的代谢与合成是从 乙酰CoA开始在线粒体中进行的。为了使发酵代谢过程中细胞的氧化还原水平得以平衡,丙 酮酸可转变为乙醛、乙酸和乙醇。值得注意的是,细胞质中乙醛氧化为乙酸时会形成 NADPH 乙酸可通过乙酰CoA而被代谢(主要通过好氧生长)酿酒酵母则既不产生乙酸也不产生甲酸, 但可摄入乳酸并转化为丙酮酸 2、生物合成和聚合反应 为了合成细胞物质,需要合成结构单元并将其聚合。EcOb细胞中大约70%的能量和还 原力用于合成蛋白质。深入研究发现,细胞对于吉布斯自由能和还原力的需求取决于培养基 中是否存在结构单元。因此,若细胞在只含部分结构单元的复杂培养基中生长,就很难对其 进行详细的生理学研究,这正是优化培养基组成的困难所在 合成蛋白质需要消耗大量的自由能,细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成。蛋 白质的合成由蛋白质合成系统(PSS)负责,该系统中核糖体是主要部分。细胞通过调节PSS 的大小和活性来控制蛋白质的合成,因此需要消耗能量。当细胞从能量充足的环境转移到缺 乏能量的环境,1~2h内细胞就可调节PSS的大小来适应新的环境。考虑到PSS的重要作用
8 应区别开来，由于这两种情况下形成的 NADH 的比率随操作条件而变，一般不能指定 P/O 的值，除非知道理论值在 2～3 之间。在实际情况中，氧化反应和磷酸化过程不可能完全耦 合，所以 P/O 值低于理论值。 当缺乏氧或必需的蛋白质导致氧化磷酸化失活时，丙酮酸不能在 TCA 循环中氧化，否 则将导致 NADH 在细胞内的积累。这种情况下，NADH 被氧化的同时，丙酮酸可被还原为 乙酸、乳酸或乙醇。这些过程统称为发酵性代谢。发酵性代谢因微生物种类而异。从图 2-1-3(a,b,c)可以看出，一些微生物是如何通过发酵性代谢平衡 EMP 途径产生的 NADH 的。 如果乳酸是最终的代谢产物，所有 EMP 途径中利用的 NAD+都可以再生；而若乙醇是代谢产 物时，NAD+就会过剩，因为从碳元素的角度分析，每摩尔葡萄糖最多只能产生 2/3 摩尔乙醇， 其它的碳转化为 CO2 或甲酸；形成乙酸时，NADH 也过剩，同样可得出类似的结果。大肠杆 菌的发酵性代谢中可形成图 2-1-3 中所示的代谢产物，因此，这种现象通常又称作混合酸发 酵。大肠杆菌和乳酸菌的主要区别在于大肠杆菌缺乏在丙酮酸降解为乙酰 CoA 时生成 CO2 的能力。 图 2-1-3 Escherichia(A)，Lactococci(B)和 Saccharomyces(C)在葡萄糖上的发酵性代谢 酵母中丙酮酸的代谢(图 2-1-3-C)相对更复杂一些。TCA 循环中化合物的代谢与合成是从 乙酰 CoA 开始在线粒体中进行的。为了使发酵代谢过程中细胞的氧化还原水平得以平衡，丙 酮酸可转变为乙醛、乙酸和乙醇。值得注意的是，细胞质中乙醛氧化为乙酸时会形成 NADPH。 乙酸可通过乙酰 CoA 而被代谢(主要通过好氧生长)。酿酒酵母则既不产生乙酸也不产生甲酸， 但可摄入乳酸并转化为丙酮酸。 2、生物合成和聚合反应 为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。E. coli 细胞中大约 70%的能量和还 原力用于合成蛋白质。深入研究发现，细胞对于吉布斯自由能和还原力的需求取决于培养基 中是否存在结构单元。因此，若细胞在只含部分结构单元的复杂培养基中生长，就很难对其 进行详细的生理学研究，这正是优化培养基组成的困难所在。 合成蛋白质需要消耗大量的自由能，细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成。蛋 白质的合成由蛋白质合成系统(PSS)负责，该系统中核糖体是主要部分。细胞通过调节 PSS 的大小和活性来控制蛋白质的合成，因此需要消耗能量。当细胞从能量充足的环境转移到缺 乏能量的环境，1～2 h 内细胞就可调节 PSS 的大小来适应新的环境。考虑到 PSS 的重要作用
可以考虑将其相对大小(g/g干重)作为结构模型中的关键变量 细胞合成所需要的结构单元数在75~100之间,这些物质都是从12种前体代谢物合成 得到的(表2-1-3)。可以发现,这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物,因此分解代谢 在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物) 表2-1-3合成E.cOi细胞对前体代谢物的需求 前体代谢物 分子式摩尔质量(g/mo)需要量(μmol/g细胞) 6-磷酸-葡萄糖 C6H13O9P260 205 6-磷酸果糖 C6H13O9P260 5-磷酸核糖 CsHuOsP 898 4-磷酸赤藓糖 C4H9O7P200 3-磷酸甘油醛 C3H7O6P 170 129 3-磷酸甘油酸 C3H7O7P 186 磷酸烯醇式丙酮酸C3H5OPl68 丙酮酸 C3H4O 2833 乙酰辅酶A α-酮戊二酸 CsH,Os 1079 琥珀酰辅酶A / 草酰乙酸 C4H4O 132 1787 TCA循环的中间体用于生物合成会使TCA循环活性降低,所以有必要补加这些化合物 丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环是最重要的两条回补途径。在丙酮酸羧化反应中,草酰乙酸可 由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成;在乙醛酸循环中,异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸, 而乙醛酸可和乙酰CoA反应生成苹果酸。草酰乙酸和苹果酸的生成可保证TCA循环的持续 运转。 氮的同化也是细胞代谢很重要的一部分。在大多数合成培养基中,采用氨作为氮源氨也 常作为复合培养基中的补充物)。氨通过结合进入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸的方式被同化, 如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。 CsH6O5(α-酮戊二酸)+NH4++NADH=CH9O4N(谷氨酸)+NAD+H2O (2-1-10 CsHO4N(谷氨酸)+NH4+AP=CH10ON2+ADP+~P+H 3、次级细胞代谢 细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程,称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品 其合成反应并不与生长过程偶联,我们称之为次级代谢,这些反应合成的产物叫次级代谢产 物,就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。次级代谢产物最典型的代表是抗生素 一般来说,所有细胞的初级代谢都是相似的,而次级代谢则随细胞不同而异。定义一个代谢 产物是初级代谢物还是次级代谢物并不麻烦,但因为所有胞内反应都紧密相联,所以有时要 对特定的代谢产物进行分类是有困难的 最早人们认为,只有与细胞生长过程中形成的才称之为初级代谢产物。乳酸是初级代谢 产物,但它是乳酸菌在非生长条件下形成的,许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条 件下产生的,因此初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较
9 可以考虑将其相对大小(g/g 干重)作为结构模型中的关键变量。 细胞合成所需要的结构单元数在 75～100 之间，这些物质都是从 12 种前体代谢物合成 得到的(表 2-1-3)。可以发现，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢 在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物)。 表 2-1-3 合成 E. coli 细胞对前体代谢物的需求 前体代谢物 分子式 摩尔质量(g/mol) 需要量(mol/g 细胞) 6-磷酸-葡萄糖 C6H13O9P 260 205 6-磷酸果糖 C6H13O9P 260 71 5-磷酸核糖 C5H11O8P 230 898 4-磷酸赤藓糖 C4H9O7P 200 361 3-磷酸甘油醛 C3H7O6P 170 129 3-磷酸甘油酸 C3H7O7P 186 1496 磷酸烯醇式丙酮酸 C3H5O6P 168 519 丙酮酸 C3H4O3 88 2833 乙酰辅酶 A / / 3747 -酮戊二酸 C5H6O5 146 1079 琥珀酰辅酶 A / / / 草酰乙酸 C4H4O5 132 1787 TCA 循环的中间体用于生物合成会使 TCA 循环活性降低，所以有必要补加这些化合物。 丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环是最重要的两条回补途径。在丙酮酸羧化反应中，草酰乙酸可 由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成；在乙醛酸循环中，异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸， 而乙醛酸可和乙酰 CoA 反应生成苹果酸。草酰乙酸和苹果酸的生成可保证 TCA 循环的持续 运转。 氮的同化也是细胞代谢很重要的一部分。在大多数合成培养基中，采用氨作为氮源(氨也 常作为复合培养基中的补充物)。氨通过结合进入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸的方式被同化， 如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。 C5H6O5(-酮戊二酸)＋NH4 +＋NADH＝C5H9O4N(谷氨酸)＋NAD+＋H2O (2-1-10) C5H9O4N(谷氨酸)＋NH4 +＋ATP＝C5H10O3N2＋ADP＋～P＋H+ 3、次级细胞代谢 细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品， 其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产 物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。次级代谢产物最典型的代表是抗生素。 一般来说，所有细胞的初级代谢都是相似的，而次级代谢则随细胞不同而异。定义一个代谢 产物是初级代谢物还是次级代谢物并不麻烦，但因为所有胞内反应都紧密相联，所以有时要 对特定的代谢产物进行分类是有困难的。 最早人们认为，只有与细胞生长过程中形成的才称之为初级代谢产物。乳酸是初级代谢 产物，但它是乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条 件下产生的，因此初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较
