《发酵工程》课程教学资源（讲义）第五章丙酮酸发酵过程优化.doc_大学文库

第五章丙酮酸发酵过程优化.........................................................................................1 第一节丙酮酸发酵概述.............................................................................................1 一、引言..................................................................................................................1 二、国外研究水平和发展趋势..................................................................................1 三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题.................................................................6 四、本章主要内容....................................................................................................7 第二节营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的影响....................................8 一、引言..................................................................................................................8 二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响........................................................................8 三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响........................................................................8 四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响......................................................9 五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响............................... 10 六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响............................................. 11 七、讨论............................................................................................................ 13 第三节维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用........................................................ 15 一、引言................................................................................................................ 15 二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力.................................... 15 三、维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响.................................................... 17 四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程............................................................... 20 五、讨论................................................................................................................ 22 第四节丙酮酸分批发酵的供氧控制模式................................................................... 25 一、引言................................................................................................................ 25 二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况............................................................... 25 三、不同kLa下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征......................................... 25 四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证........................................................... 27 五、讨论................................................................................................................ 29 第五节丙酮酸发酵过程的代谢网络分析................................................................... 32 一、引言................................................................................................................ 32 二、代谢网络构建和代谢通量计算......................................................................... 32 三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果 ................................................ 34 四、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADPH的产生与消耗........................................ 37 五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗.......................................... 38 六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗 ............................................. 39 七、讨论................................................................................................................ 41 第六节丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验............................................................... 49 一、引言................................................................................................................ 49 二、30 L发酵罐中葡萄糖浓度对WSH-IP303菌株生产丙酮酸的影响......................... 49 三、300 L规模的丙酮酸发酵试验 ........................................................................... 50 四、5 m3规模丙酮酸发酵中试................................................................................. 51

第五章丙酮酸发酵过程优化第一节丙酮酸发酵概述引言丙酮酸( Pyruvic acid),又称2-氧代丙酸(2- oxopropanoic acid)、α-酮基丙酸 (α- ketopropionic acid或乙酰基甲酸( acetylformic acid),为无色至淡黄色液体,呈醋酸香气和愉快酸味,是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用,而且是多种有用化合物的前体,因此,它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中都有广泛的用途,如表5-1-1所示。表5-1-1丙酮酸的主要用途酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L多用于伯醇及仲醇的检定:转氨酶的测制药工业巴;合成L半胱氨酸、L亮氨酸、VB6生化研究定;是脂肪族胺的显色剂等。和VB12等。是合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、与乳酸组成抗氧化剂,降低对细胞的农用化学品谷物保护剂等多种农药的起始原料。细胞培养伤害:是动物细胞培养的重要底物 GB2760-19%6规定为酸味添加剂。近与乳酸、锂构成人工胰脏,作为体外食品工业年来由于在减肥上有特效而受到西传感器传感器测定葡萄糖的含量。方消费者青睐虽然作为一种化工产品,丙酮酸早已实现了工业化生产,但是,直到20世纪90年代工业上生产丙酮酸的方法仍是酒石酸脱水脱羧法∶将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220℃下蒸馏,馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。这种工艺的主要缺点是:(1)丙酮酸产率较低(对酒石酸的产率系数为029~030g/g):(2)得到1g丙酮酸需要消耗5g硫酸氢钾。为此, 在很长一段时间内,丙酮酸的价格居高不下,推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品工业中的应用为例,尽管它是一种很有潜力的酸味剂,但由于其在价格上与其它有机酸相比过于昂贵,因此,几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味开发成本更低的丙酮酸生产技术,如直接发酵法或生物转化法,是扩大丙酮酸应用范围的根本途径。然而,丙酮酸在代谢途径中所处的关键地位,使得丙酮酸高产菌株的选育十分困难。尽管有一些微生物能够积累丙酮酸,但其产量无法达到工业化的要求。发酵法生产丙酮酸真正取得突破,是在1988年。当时,日本东丽工业株式会社的研究人员选育出系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母( Torulopsis)菌株,使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992年,日本开始采用发酵法生产丙酮酸,产量为400ta,售价为4000日元/kg。国内除作者发表的论文外,尚未见关于发酵法生产丙酮酸的公开文献报道。二、国外研究水平和发展趋势发酵法生产丙酮酸包括两种方法∶一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累丙酮酸,即直接发酵法;另一种是微生物先生长,再转化底物为丙酮酸,称之为休止细胞法。休止细胞法与完整细胞酶法合成丙酮酸的区别在于:后者是利用微生物中某一种具有特定功能的酶完成由底物(如乳酸)向丙酮酸的转化;而前者则是利用微生物中的一系列酶(如 EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程。因此,休止细胞法也可归广义的发酵法。 (一)酵母直接发酵生产丙酮酸

1 第五章丙酮酸发酵过程优化第一节丙酮酸发酵概述一、引言丙酮酸 (Pyruvic acid) ，又称 2- 氧代丙酸 (2-oxopropanoic acid) 、 - 酮基丙酸 (-ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，因此，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中都有广泛的用途，如表 5-1-1 所示。表5-1-1 丙酮酸的主要用途用途实例用途实例制药工业酶法合成 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴；合成 L-半胱氨酸、L-亮氨酸、VB6 和 VB12 等。生化研究用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶的测定；是脂肪族胺的显色剂等。农用化学品是合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料。细胞培养与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的伤害；是动物细胞培养的重要底物。食品工业 GB 2760-1996 规定为酸味添加剂。近年来由于在减肥上有特效而受到西方消费者青睐。传感器与乳酸、锂构成人工胰脏，作为体外传感器测定葡萄糖的含量。虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但是，直到 20 世纪 90 年代，工业上生产丙酮酸的方法仍是酒石酸脱水脱羧法∶将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 ℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。这种工艺的主要缺点是∶(1) 丙酮酸产率较低(对酒石酸的产率系数为 0.29～0.30 g/g)；(2)得到 1 g 丙酮酸需要消耗 5 g 硫酸氢钾。为此，在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有机酸相比过于昂贵，因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。开发成本更低的丙酮酸生产技术，如直接发酵法或生物转化法，是扩大丙酮酸应用范围的根本途径。然而，丙酮酸在代谢途径中所处的关键地位，使得丙酮酸高产菌株的选育十分困难。尽管有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业化的要求。发酵法生产丙酮酸真正取得突破，是在 1988 年。当时，日本东丽工业株式会社的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过 50 g/L 的球拟酵母(Torulopsis)菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992 年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸，产量为 400 t/a，售价为 4000 日元/kg。国内除作者发表的论文外，尚未见关于发酵法生产丙酮酸的公开文献报道。二、国外研究水平和发展趋势发酵法生产丙酮酸包括两种方法∶一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累丙酮酸，即直接发酵法；另一种是微生物先生长，再转化底物为丙酮酸，称之为休止细胞法。休止细胞法与完整细胞酶法合成丙酮酸的区别在于∶后者是利用微生物中某一种具有特定功能的酶完成由底物(如乳酸)向丙酮酸的转化；而前者则是利用微生物中的一系列酶(如 EMP 途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程。因此，休止细胞法也可归广义的发酵法。 (一)酵母直接发酵生产丙酮酸

2 在直接发酵法生产丙酮酸的菌株中，酵母是研究得最多的一种。表 5-1-2 中对酵母发酵生产丙酮酸的情况进行了总结，从中可以了解到近 30 年来国外学者在利用酵母生产丙酮酸方面的研究进展。表 5-1-2 以酵母为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览菌株遗传特点碳源氮源温度 /℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 反应器 Candida lipolytica 可利用脂肪酸酰胺为碳源乙酰胺玉米浆 31.5 72 1.5 0.15 摇瓶 Candida maltosa 丙酸 (NH4)2SO4 NH4NO3 31.5 72 2.2 0.22 摇瓶 Candida lipolytica 硫胺素、蛋氨酸营养缺陷型葡萄糖 NH4NO3 30 72 43.6 0.44 摇瓶 Debaryomyces coudertii 柑桔皮水解物 (NH4)2SO4 NH4NO3 30 48 11.5 摇瓶 Debaryomyces hansenii 硫胺素、生物素营养缺陷型葡萄糖蛋白胨 28 96 42 0.42 摇瓶 Saccharomyces cerevisiae 硫胺素营养缺陷型葡萄糖 30 48 36.9 0.37 摇瓶 Torulopsis sp. 硫胺素营养缺陷型葡萄糖蛋白胨(含生物素) 30 60 40.7 0.41 摇瓶 Torulopsis sp. 精氨酸营养缺陷型葡萄糖聚胨 30 60 49.3 0.49 摇瓶 Torulopsis sp. 异亮氨酸、缬氨酸营养缺陷型葡萄糖聚胨 30 60 50 0.50 摇瓶 Torulopsis sp. 氨基羟基乙酸抗性葡萄糖聚胨 30 60 52.1 0.52 摇瓶 Torulopsis Glabrata 硫胺素、生物素、精氨酸缺陷型，氨基羟基乙酸抗性葡萄糖蛋白胨 30 60 27.3 0.54 摇瓶 Torulopsis sp. 2-脱氧葡萄糖抗性葡萄糖蛋白胨 30 60 52.1 0.52 摇瓶 Torulopsis sp. PDC活性降低葡萄糖蛋白胨 30 60 56.8 0.58 摇瓶 Torulopsis glabrata 硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸营养缺陷型葡萄糖聚胨 30 59 57 0.57 摇瓶 Torulopsis glabrata 硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸营养缺陷型葡萄糖聚胨 30 63 67.8 0.49 3 L发酵罐 Torulopsis etchellsii 嗜盐葡萄糖 NH4Cl KNO3 30 14 d 1.08 0.02 摇瓶 Torulopsis etchellsii 嗜盐葡萄糖酪蛋白氨基酸 30 10 d 5.1 0.10 1 L发酵罐

葡萄糖乙醇丙酮氨基酸乙酰辅醇AⅢ 檬酸草酰乙酸 TCA循环图5-1-1光滑球拟酵母中丙酮酸的代谢途径 I:丙酮酸脱羧酶(PDC);Ⅱ:转氨酶:Ⅲ:丙酮酸羧化酶(PC):Ⅳ:丙酮酸脱氢酶系PDH) B1:硫胺素:B6:吡哆醇;Bio:生物素球拟酵母( Torulopsis)属菌株,特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型T. glabrata IFO005,5是发酵法生产丙酮酸的首选菌株。T. glabrata的维生素营养缺陷型能够积累丙酮酸的生理学依据如图5-1-1所示。烟酸和硫胺素是丙酮酸脱氢酶系的辅因子;生物素是丙酮酸羧化酶的辅因子;吡哆醇是转氨酶的辅因子;硫胺素是丙酮酸脱羧酶的辅因子。由于营养缺陷型菌株自身不能合成这些维生素,当培养基中这些维生素的浓度处于亚适量水平时,负责丙酮酸降解或转化的四种酶的活性均较低,于是丙酮酸得以积累。在一般培养条件下, T. glabrata IFO0005对葡萄糖的丙酮酸产率为0.41g/g。米原辙对该菌株进行诱变,增加一系列遗传标记(如L-^rg营养缺陷型;LVal和L-Ie营养缺陷型 2-脱氧葡萄糖抗性和氨基羟基乙酸抗性)以后,丙酮酸产率可提高到0.54gg。为了减少突变株产乙醇的能力,进一步提高丙酮酸产率,米原辙又通过选育乙酸营养缺陷型菌株,有效地降低了突变株的PDC活性,使丙酮酸产率提高到0.58g/g。尽管经过研究者的不懈努力,摇瓶发酵中的丙酮酸产量和产率已分别达到568gL和0.58gg,但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如,日本东丽化学公司采用流加培养技术,在3L发酵罐中丙酮酸产量达到678g/,然而丙酮酸产率仅为049gg 嗜盐酵母 Torulopsis etchellsii能在含盐量达80g的葡萄糖培养基中积累丙酮酸,但产率很低。硫胺素营养缺陷型菌株 Candida lipolytica、 Debaryomyces hansenii和 Saccharomyces cerevisiae积累丙酮酸的能力也不弱。其产率(0.37~0.44gg)虽然不及T labrada,但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源,而这一特点又是T. glabrata所不具备的。日本开展发酵法生产丙酮酸的研究的公司主要有3家。20世纪70年代是味之素发酵株式会社,以研究假丝酵母( Candida)为主;80~90年代则是东丽工业株式会社,以研究球拟酵母( Torulopsis)为主;另一家公司( Toyobo Co.Ltd)发表的专利和研究报告略少,以研究德巴利酵母( Debaryomyces)为主。这些公司之间的竟争,是推动日本发酵法生产丙酮酸迅速实现工业化的动力 3

3 葡萄糖乙醇丙酮酸氨基酸乙酰辅酶 A B1 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ B6 B1 NA Bio 柠檬酸草酰乙酸 TCA 循环图5-1-1 光滑球拟酵母中丙酮酸的代谢途径 Ⅰ: 丙酮酸脱羧酶(PDC)；Ⅱ: 转氨酶；Ⅲ: 丙酮酸羧化酶(PC)；Ⅳ: 丙酮酸脱氢酶系(PDH) NA∶烟酸；B1∶硫胺素；B6∶吡哆醇；Bio∶生物素球拟酵母(Torulopsis)属菌株，特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型 T. glabrata IFO 0005，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株。T. glabrata 的维生素营养缺陷型能够积累丙酮酸的生理学依据如图 5-1-1 所示。烟酸和硫胺素是丙酮酸脱氢酶系的辅因子；生物素是丙酮酸羧化酶的辅因子；吡哆醇是转氨酶的辅因子；硫胺素是丙酮酸脱羧酶的辅因子。由于营养缺陷型菌株自身不能合成这些维生素，当培养基中这些维生素的浓度处于亚适量水平时，负责丙酮酸降解或转化的四种酶的活性均较低，于是丙酮酸得以积累。在一般培养条件下，T. glabrata IFO 0005 对葡萄糖的丙酮酸产率为 0.41 g/g。米原辙对该菌株进行诱变，增加一系列遗传标记(如 L-Arg 营养缺陷型；L-Val 和 L-Ile 营养缺陷型； 2-脱氧葡萄糖抗性和氨基羟基乙酸抗性)以后，丙酮酸产率可提高到 0.54 g/g。为了减少突变株产乙醇的能力，进一步提高丙酮酸产率，米原辙又通过选育乙酸营养缺陷型菌株，有效地降低了突变株的 PDC 活性，使丙酮酸产率提高到 0.58 g/g。尽管经过研究者的不懈努力，摇瓶发酵中的丙酮酸产量和产率已分别达到 56.8 g/L 和 0.58 g/g，但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如，日本东丽化学公司采用流加培养技术，在 3 L 发酵罐中丙酮酸产量达到 67.8 g/L，然而丙酮酸产率仅为 0.49 g/g。嗜盐酵母 Torulopsis etchellsii 能在含盐量达 80 g/L 的葡萄糖培养基中积累丙酮酸，但产率很低。硫胺素营养缺陷型菌株 Candida lipolytica 、 Debaryomyces hansenii 和 Saccharomyces cerevisiae 积累丙酮酸的能力也不弱。其产率(0.37～0.44 g/g)虽然不及 T. glabrata，但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源，而这一特点又是 T. glabrata 所不具备的。日本开展发酵法生产丙酮酸的研究的公司主要有 3 家。20 世纪 70 年代是味之素发酵株式会社，以研究假丝酵母(Candida)为主；80～90 年代则是东丽工业株式会社，以研究球拟酵母(Torulopsis)为主；另一家公司(Toyobo Co. Ltd.)发表的专利和研究报告略少，以研究德巴利酵母(Debaryomyces)为主。这些公司之间的竞争，是推动日本发酵法生产丙酮酸迅速实现工业化的动力

(二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸在已有的文献报道中,酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言,细菌积累丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表5-1-3所示,能直接利用葡萄糖为底物积累丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E.col。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记,其丙酮酸产率虽然不是很低(介于03~04gg之间),但丙酮酸产量最高仅为23g/L( Nocardia fumifera以葡萄糖酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段表5-1-3以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览菌株遗传特点碳源氮源温度时间丙酮酸产率反应器葡萄糖 0.38 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型葡萄糖聚胨372 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型,葡萄糖聚胨372430 0.60 缺失F1-ATP酶发酵罐活性 Nocardia lutea 丙酸(NH4)2SO431.5722.50.25摇瓶 NHaNO3 Nocardia fiumifera 0.46 Pseudomonas tabari 葡萄糖酸(NH4SO430 摇瓶 0.26 Pseudomonas shuter 葡萄糖酸(NH4)2SO43014412 0.24 摇瓶葡萄糖酸酵母膏30 0.32 1,2-丙二醇铵盐28 摇瓶 cinetobacter sp 硫胺素缺陷型1,2-丙二醇聚胨289611.60.58摇瓶 Pseudomo烟酸sp 1,2-丙二醇NH4NO330 与 Miyata等选育T. glabrata的多重维生素营养缺陷型不同的是, Yokota选育的E.coli w485l2遗传标记非常简单,仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是PDH的辅因子,在硫辛酸亚适量供给的情况下,E. coli W1485lp2过量积累丙酮酸的原理与T. glabrata IFo0005 是基本相同的。 Yokota认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳,其原因是由于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子,故磷酸戊糖途径的活性在. glabrata的硫胺素营养缺陷型中会受到影响,但在E.co的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E.colW485lp2 培养32h时丙酮酸产率达0.5lgg,而以该菌株为出发菌株构建的缺失F1-ATP酶活性的 E. coli tbla-1培养24h时丙酮酸产率就达到了0.6g参见表5-1-3)。其原因是:E.col IBLA-1缺失F1-ATP酶活性后,通过氧化磷酸化途径形成的ATP减少,细胞整体能量水平下降,葡萄糖分解速度加快,从而使得丙酮酸积累速度显著提髙细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是:培养基的pH一般在70左右甚至更高一些。这意味着可以构建一个发酵生产丙酮酸一酶法合成色氨酸的耦合系统。 Yokota和 Takao先在含50 g/葡萄糖的培养基中培养 Agaricus campe stria,待发酵液中丙酮酸产量达到2~-26g/时, 加入具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵,转化12h后L-Tp产量达到15g/L。这一耦合系统随后又有新的发展, Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的 Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17g时,只需

4 (二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸在已有的文献报道中，酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言，细菌积累丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表 5-1-3 所示，能直接利用葡萄糖为底物积累丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E. coli)。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记，其丙酮酸产率虽然不是很低(介于 0.3～0.4 g/g 之间)，但丙酮酸产量最高仅为 23 g/L (Nocardia fumifera 以葡萄糖酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段。表5-1-3 以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览菌株遗传特点碳源氮源温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 反应器 Schizophyllum commune 葡萄糖聚胨 27 120 19 0.38 摇瓶 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型葡萄糖聚胨 37 32 25.5 0.51 5 L 发酵罐 Escherichia coli 硫辛酸缺陷型, 缺失F1-ATP酶活性葡萄糖聚胨 37 24 30 0.60 5 L 发酵罐 Nocardia lutea 丙酸 (NH4)2SO4 NH4NO3 31.5 72 2.5 0.25 摇瓶 Nocardia fumifera 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 96 23 0.46 Pseudomonas tabati 摇瓶 13 0.26 Pseudomonas stutzeri 葡萄糖酸 (NH4)2SO4 30 144 12 0.24 摇瓶 Enterococcus casseliflavus 葡萄糖酸酵母膏 30 72 16 0.32 摇瓶 Corynebacterium sp. 1,2-丙二醇铵盐 28 8.1 0.41 摇瓶 Acinetobacter sp. 硫胺素缺陷型 1,2-丙二醇聚胨 28 96 11.6 0.58 摇瓶 Pseudomo烟酸s sp. 1,2-丙二醇 NH4NO3 30 72 14 0.35 摇瓶与 Miyata 等选育 T. glabrata 的多重维生素营养缺陷型不同的是，Yokota 选育的 E. coli W1485lip2 遗传标记非常简单，仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是 PDH 的辅因子，在硫辛酸亚适量供给的情况下，E. coli W1485lip2 过量积累丙酮酸的原理与 T. glabrata IFO 0005 是基本相同的。Yokota 认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳，其原因是由于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子，故磷酸戊糖途径的活性在 T. glabrata 的硫胺素营养缺陷型中会受到影响，但在 E. coli 的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E. coli W1485lip2 培养 32 h 时丙酮酸产率达 0.51 g/g，而以该菌株为出发菌株构建的缺失 F1-ATP 酶活性的 E. coli TBLA-1 培养 24 h 时丙酮酸产率就达到了 0.6 g/g(参见表 5-1-3)。其原因是∶E. coli TBLA-1 缺失 F1-ATP 酶活性后，通过氧化磷酸化途径形成的 ATP 减少，细胞整体能量水平下降，葡萄糖分解速度加快，从而使得丙酮酸积累速度显著提高。细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是∶培养基的pH一般在7.0左右甚至更高一些。这意味着可以构建一个发酵生产丙酮酸─酶法合成色氨酸的耦合系统。Yokota和Takao先在含50 g/L葡萄糖的培养基中培养Agaricus campestris，待发酵液中丙酮酸产量达到22～26 g/L时，加入具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵，转化12 h后L-Trp产量达到15 g/L。这一耦合系统随后又有新的发展，Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17 g/L时，只需

加入吲哚和氯化铵就可将丙酮酸转化为L-Irp(14g/L)。由于限制L-Trp浓度进一步提高的原因是 Enterobacter aerogenes的丙酮酸产量不高,为了获得更高的LTrp产量, Kawasaki将 Enterobacter aerogenes'中编码色氨酸酶的基因克隆至质粒pKT90IEA上,然后转入丙酮酸生产菌E.colW1485lip2中。在葡萄糖浓度为50gL的培养基中,最终L-Irp的产量提高到23.7 (三)休止细胞法生产丙酮酸表5-1-4中给出的采用休止细胞法生产丙酮酸的微生物,有一些也可以用于直接发酵法。如 Acinetobacter sp(表5-1-3)和 Debaryomyces coudert(表5-1-2)。对这两株菌来说,休止细胞法的丙酮酸产量虽然略低于直接发酵法,但培养时间显著缩短,如 Acinetobacter sp. 由96h缩短到24h, Debaryomyces couderti则由48h缩短到10h。其缺点是操作比较繁琐需要先培养细胞,再分离细胞,洗涤,最后才用于合成丙酮酸。也有不需要进行细胞分离操作的报道。一个例子是,细胞先以甘油为碳源生长,待氮源(NaNO3)耗尽后加入葡萄糖细胞由于缺氮而不能生长,自然转向积累丙酮酸。遗憾的是丙酮酸产量不高。另一个例子是待细胞在pH45~5.5的条件下生长90h后将pH降至3.5~45,实验结果表明,这种p 控制策略可有效地抑制α-酮戊二酸的形成。其缺点是反应器结构比较复杂,培养时间也太长。严格地说,这两个例子都不是真正意义上的休止细胞法,但由于其有别于典型的发酵法,因此将其放至表5-1-4中进行讨论。表5-1-4采用休止细胞法生产丙酮酸的研究情况一览菌株氮源温度时间丙酮酸生长因子产率反应器 acinetobacter先培养细胞,12-丙二醇282410硫胺素050摇瓶再转化底物 p.pH4.5~55下葡萄糖NHNO330180406生长需硫0.41l 胺素,产酸 Debaryomyces先培养细胞,柑桔皮 01079添加ATP0 coudert再转化底物水解物 Enterobacter先培养细胞,葡萄糖 10361A,添加0.8 aerogenes 再转化底物亚砷酸钠 xanthomonas氮源耗尽后加甘油烟酸30 3010.3 酵母膏摇瓶 campestris入葡萄糖,产酸葡萄糖NO3 (四)完整细胞酶法生产丙酮酸近年来关于酶法生产丙酮酸的研究也很热门。如利用 Acetobacter将D(-)乳酸氧化为丙酮酸,转化率虽然较高,但由于D-(-)乳酸比L-(+)乳酸价格高得多,所以在实现工业化方面有困难。由 Hansenula polymorpha中的乙醇酸氧化酶催化的L-乳酸氧化反应具有高底物转化率的优点,但由于L乳酸氧化为丙酮酸的过程中会产生H2O2,如果不及时去除,丙酮酸会被进一步氧化为乙酸。L-乳酸在价格方面是非常有优势的,目前的关键是如何解决丙酮酸被HO进一步氧化的问题。已经开发出一些方法,如,利用 Pichia pastoris中的过氧化氢酶来分解乳酸氧化过程中产生的H2O2。在这一方面,美国杜邦公司开展了大量的研究工作,但迄今为止,还未见到工业化成功的消息

5 加入吲哚和氯化铵就可将丙酮酸转化为L-Trp(14 g/L)。由于限制L-Trp浓度进一步提高的原因是Enterobacter aerogenes的丙酮酸产量不高，为了获得更高的L-Trp产量，Kawasaki 将 Enterobacter aerogenes中编码色氨酸酶的基因克隆至质粒pKT901EA上，然后转入丙酮酸生产菌E. coli W1485lip2中。在葡萄糖浓度为50 g/L的培养基中，最终L-Trp的产量提高到23.7 g/L。 (三)休止细胞法生产丙酮酸表 5-1-4 中给出的采用休止细胞法生产丙酮酸的微生物，有一些也可以用于直接发酵法。如 Acinetobacter sp.(表 5-1-3)和 Debaryomyces coudertii(表 5-1-2)。对这两株菌来说，休止细胞法的丙酮酸产量虽然略低于直接发酵法，但培养时间显著缩短，如 Acinetobacter sp. 由 96 h 缩短到 24 h，Debaryomyces coudertii 则由 48 h 缩短到 10 h。其缺点是操作比较繁琐∶ 需要先培养细胞，再分离细胞，洗涤，最后才用于合成丙酮酸。也有不需要进行细胞分离操作的报道。一个例子是，细胞先以甘油为碳源生长，待氮源(NaNO3)耗尽后加入葡萄糖。细胞由于缺氮而不能生长，自然转向积累丙酮酸。遗憾的是丙酮酸产量不高。另一个例子是待细胞在 pH 4.5～5.5 的条件下生长 90 h 后将 pH 降至 3.5～4.5，实验结果表明，这种 pH 控制策略可有效地抑制-酮戊二酸的形成。其缺点是反应器结构比较复杂，培养时间也太长。严格地说，这两个例子都不是真正意义上的休止细胞法，但由于其有别于典型的发酵法，因此将其放至表 5-1-4 中进行讨论。表5-1-4 采用休止细胞法生产丙酮酸的研究情况一览菌株方法碳源氮源温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 生长因子产率 / gg -1 反应器 Acinetobacter sp. 先培养细胞，再转化底物 1,2-丙二醇 28 24 10 硫胺素 0.50 摇瓶 Candida sp. pH 4.5 ～5.5 下生长，pH 3.5～ 4.5下产酸葡萄糖 NH4NO3 30 180 40.6 生长需硫胺素，产酸不需要 0.41 5 L 发酵罐 Debaryomyces coudertii 先培养细胞，再转化底物柑桔皮水解物 30 10 7.9 添加ATP 和NAD + 0 摇瓶 Enterobacter aerogenes 先培养细胞，再转化底物葡萄糖 30 10 3.6 LA-，添加亚砷酸钠 0.8 摇瓶 Xanthomonas campestris 氮源耗尽后加入葡萄糖，产酸甘油葡萄糖烟酸 NO3 30 30 10.3 酵母膏 0.29 摇瓶 (四)完整细胞/酶法生产丙酮酸近年来关于酶法生产丙酮酸的研究也很热门。如利用 Acetobacter 将 D-(-)-乳酸氧化为丙酮酸，转化率虽然较高，但由于 D-(-)-乳酸比 L-(+)-乳酸价格高得多，所以在实现工业化方面有困难。由 Hansenula polymorpha 中的乙醇酸氧化酶催化的 L-乳酸氧化反应具有高底物转化率的优点，但由于 L-乳酸氧化为丙酮酸的过程中会产生 H2O2，如果不及时去除，丙酮酸会被进一步氧化为乙酸。L-乳酸在价格方面是非常有优势的，目前的关键是如何解决丙酮酸被 H2O2 进一步氧化的问题。已经开发出一些方法，如，利用 Pichia pastoris 中的过氧化氢酶来分解乳酸氧化过程中产生的 H2O2。在这一方面，美国杜邦公司开展了大量的研究工作，但迄今为止，还未见到工业化成功的消息

表5-1-5完整细胞或酶法合成丙酮酸的研究情况一览反应原理温度时间丙酮酸产率 /℃ Acetobacter D-(-)-乳酸甲醛脱氢酶丙酮醛丙酮醛氧化3010 3.6 丙酮酸合酶乙酰磷酸还原性羧化乙醇酸氧化酶L乳酸乳酸氧化 Pichia pastoris 过氧化氢酶 Rhodotorula D-氨基酸氧化酶 0.23 g/dU 过氧化氢酶三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题发酵法生产丙酮酸所追求的目标,是实现丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的统也就是说,在尽可能短的时间内,消耗尽可能少的底物生产出尽可能多的产品。一般情况下,这种完美的统一是无法实现的,只能退而求其次,以获得丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的相对统一为研究目标。从代谢控制的观点考虑,为了实现这一目标,必须从两方面入手:(1)在保证细胞正常代谢的前提下,尽可能减少丙酮酸的降解或转化,这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件;(2)加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度,以确保获得丙酮酸的高生产强度前已述及,日本东丽化学公司米原辙和宫田令子选育了具有多种遗传标记的 Torulopsis glabrata菌株,且每增加一个遗传标记,丙酮酸产量就有新的提高(在摇瓶培养中丙酮酸产量和产率已分别达到568gL和0.58gg),但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如,在3L发酵罐中通过流加培养,丙酮酸产量可达67.8gL,其代价是丙酮酸产率仅为0.49gg。之所以不能很好地解决这一问题,其原因在于T. glabrata不是发酵工业上的常用菌株,学术界对该菌株在过量合成有用物质的生理生化特性上还缺乏明确的认识。对于任何一种发酵产品,要获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一,首先要找出影响该物质高效生产的最重要因素,然后考察这些因素对发酵过程的影响,从生理学角度出发对这些因素的影响规律进行分析,进而提出针对这些影响因素的控制方法或策略用这一思路去分析米原辙和宫田令子的研究结果,就会发现,他们的侧重点在于选育丙酮酸的高产菌株,对于采用什么方法来保证这些菌株发挥出高产丙酮酸的潜力,研究得还很不够,因而会产生这样一些问题 1.见诸文献报道的所有T.glab菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源。一般来说,质量好的聚蛋白胨中应当没有维生素,但T. glabrata IFO0005在只有聚蛋白胨而没有维生素的种子培养基中照样生长良好,表明聚蛋白胨中的维生素含量已足以满足多重维生素营养缺陷型菌株的生长。在这种情况下硏究该菌株所不能合成的维生素在代谢途径中的作用显然无法得出明确的结论,也不可能使丙酮酸产率达到很高的水平。 2.T. glabrata所不能合成的维生素有四种∶烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素。虽然宫田令子和米原辙曾采用单因素试验的方法考察了这四种维生素对丙酮酸发酵的影响,但实际上,由于培养基中四种维生素的水平直接影响PDC、PDH、PC和PT的活性,仅仅依单因素试验,很难分析出烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素各自在丙酮酸过量合成中的作用

6 表5-1-5 完整细胞或酶法合成丙酮酸的研究情况一览菌株酶底物反应原理温度 / ℃ 时间 / h 丙酮酸 / gL -1 产率 / gg -1 Acetobacter D-(-)-乳酸 Bacteria 甲醛脱氢酶丙酮醛丙酮醛氧化 30 10 3.6 Clostridium sporogenes 丙酮酸合酶乙酰磷酸还原性羧化 Hansenula polymorpha Pichia pastoris 乙醇酸氧化酶过氧化氢酶 L-乳酸乳酸氧化 Pediococcus homari 甘油 30 24 15 0.3 Rhodotorula gracilis D-氨基酸氧化酶过氧化氢酶 0.23 g/dU 三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题发酵法生产丙酮酸所追求的目标，是实现丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的统一。也就是说，在尽可能短的时间内，消耗尽可能少的底物生产出尽可能多的产品。一般情况下，这种完美的统一是无法实现的，只能退而求其次，以获得丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的相对统一为研究目标。从代谢控制的观点考虑，为了实现这一目标，必须从两方面入手∶(1)在保证细胞正常代谢的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化，这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件；(2)加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度。前已述及，日本东丽化学公司米原辙和宫田令子选育了具有多种遗传标记的 Torulopsis glabrata 菌株，且每增加一个遗传标记，丙酮酸产量就有新的提高(在摇瓶培养中丙酮酸产量和产率已分别达到 56.8 g/L 和 0.58 g/g)，但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如，在 3 L 发酵罐中通过流加培养，丙酮酸产量可达 67.8 g/L，其代价是丙酮酸产率仅为 0.49 g/g。之所以不能很好地解决这一问题，其原因在于 T. glabrata 不是发酵工业上的常用菌株，学术界对该菌株在过量合成有用物质的生理生化特性上还缺乏明确的认识。对于任何一种发酵产品，要获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一，首先要找出影响该物质高效生产的最重要因素，然后考察这些因素对发酵过程的影响，从生理学的角度出发对这些因素的影响规律进行分析，进而提出针对这些影响因素的控制方法或策略。用这一思路去分析米原辙和宫田令子的研究结果，就会发现，他们的侧重点在于选育丙酮酸的高产菌株，对于采用什么方法来保证这些菌株发挥出高产丙酮酸的潜力，研究得还很不够，因而会产生这样一些问题∶ 1．见诸文献报道的所有 T. glabrata 菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源。一般来说，质量好的聚蛋白胨中应当没有维生素，但 T. glabrata IFO 0005 在只有聚蛋白胨而没有维生素的种子培养基中照样生长良好，表明聚蛋白胨中的维生素含量已足以满足多重维生素营养缺陷型菌株的生长。在这种情况下研究该菌株所不能合成的维生素在代谢途径中的作用，显然无法得出明确的结论，也不可能使丙酮酸产率达到很高的水平。 2．T. glabrata 所不能合成的维生素有四种∶烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素。虽然宫田令子和米原辙曾采用单因素试验的方法考察了这四种维生素对丙酮酸发酵的影响，但实际上，由于培养基中四种维生素的水平直接影响 PDC、PDH、PC 和 PT 的活性，仅仅依靠单因素试验，很难分析出烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素各自在丙酮酸过量合成中的作用

也就谈不上确定合理的优化策略 3.已有报道认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累,但对溶氧高到什么程度,应当怎样控制等具体问题并没有明确的结论。此外,如果把维生素作为影响T. glabrata生产丙酮酸最重要的因素,溶氧作为次重要因素,这两种因素组合起来会对丙酮酸发酵过程产生什影响,至今未有研究者涉足 4.培养基优化是实现T. glabrata高产丙酮酸的一项基础性工作。然而,迄今为止,关于营养条件对丙酮酸发酵过程的影响、特别是三种最主要的营养元素(碳、氮、磷)的影响未有详细报道。如,葡萄糖对菌体生长和产酸是否存在抑制?是否有可能先培养细胞,待氮源耗尽后,细胞再转向大量积累丙酮酸?无机磷是EM途径的必需元素,在丙酮酸生产中又起到什么样的作用? 这些问题的解决,对理解T. glabrata发酵生产丙酮酸的生理学本质,进而确定一系列以实现丙酮酸发酵高产率、高产量和高生产强度的相对统一为目标的控制策略,都是非常必要的。四、本章主要内容为了尽快填补我国在发酵法生产丙酮酸方面的空白,江苏省科委设立了“九五”工业重大科技攻关项目“发酵法生产丙酮酸中试”(BG98015-3)。我们研究室作为项目的承担单位,从实验室规模到中试规模对丙酮酸发酵进行了全面、系统、深入的硏究。从过程优化的观点出发,对丙酮酸这样一个特殊的代谢中间体,其优化方法应当是在透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸的生理学本质的基础上,采用一系列控制策略实现丙酮酸的过量合成。根据这一指导思想,本节将着重介绍以下四部分内容 1.在摇瓶和小型发酵罐中,硏究各种营养条件对多重维生素营养缺陷型菌株T. glaberαa wSH-P12发酵生产丙酮酸的影响。 2.为了避免蛋白胨中不定量维生素的影响,以T. glabrata WSH-IP12为出发菌株,选育能以无机氮源为唯一氮源生长和产酸的突变株。然后,透彻分析T. glabrata所不能合成的四种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 3.在培养基中维生素含量处于亚适量水平时,研究不同供氧方式下T. glabrata发酵生产丙酮酸的代谢特征,提出供氧方式的优化策略。在此基础上,利用代谢通量分析方法, 得到不同硫胺素浓度和不同溶氧下发酵过程的全部代谢通量分布,探讨丙酮酸发酵过程的本质。 4.对T. glabrata在发酵生产丙酮酸过程中表现出的一些代谢特征进行分析,同时将丙酮酸发酵逐级放大到5m3规模

7 也就谈不上确定合理的优化策略。 3．已有报道认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累，但对溶氧高到什么程度，应当怎样控制等具体问题并没有明确的结论。此外，如果把维生素作为影响 T. glabrata 生产丙酮酸最重要的因素，溶氧作为次重要因素，这两种因素组合起来会对丙酮酸发酵过程产生什么影响，至今未有研究者涉足。 4．培养基优化是实现 T. glabrata 高产丙酮酸的一项基础性工作。然而，迄今为止，关于营养条件对丙酮酸发酵过程的影响、特别是三种最主要的营养元素(碳、氮、磷)的影响未有详细报道。如，葡萄糖对菌体生长和产酸是否存在抑制? 是否有可能先培养细胞，待氮源耗尽后，细胞再转向大量积累丙酮酸? 无机磷是 EMP 途径的必需元素，在丙酮酸生产中又起到什么样的作用? 这些问题的解决，对理解 T. glabrata 发酵生产丙酮酸的生理学本质，进而确定一系列以实现丙酮酸发酵高产率、高产量和高生产强度的相对统一为目标的控制策略，都是非常必要的。四、本章主要内容为了尽快填补我国在发酵法生产丙酮酸方面的空白，江苏省科委设立了“九五”工业重大科技攻关项目“发酵法生产丙酮酸中试”(BG98015-3)。我们研究室作为项目的承担单位，从实验室规模到中试规模对丙酮酸发酵进行了全面、系统、深入的研究。从过程优化的观点出发，对丙酮酸这样一个特殊的代谢中间体，其优化方法应当是在透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸的生理学本质的基础上，采用一系列控制策略实现丙酮酸的过量合成。根据这一指导思想，本节将着重介绍以下四部分内容。 1．在摇瓶和小型发酵罐中，研究各种营养条件对多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata WSH-IP12 发酵生产丙酮酸的影响。 2．为了避免蛋白胨中不定量维生素的影响，以 T. glabrata WSH-IP12 为出发菌株，选育能以无机氮源为唯一氮源生长和产酸的突变株。然后，透彻分析 T. glabrata 所不能合成的四种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用。 3．在培养基中维生素含量处于亚适量水平时，研究不同供氧方式下 T. glabrata 发酵生产丙酮酸的代谢特征，提出供氧方式的优化策略。在此基础上，利用代谢通量分析方法，得到不同硫胺素浓度和不同溶氧下发酵过程的全部代谢通量分布，探讨丙酮酸发酵过程的本质。 4．对 T. glabrata 在发酵生产丙酮酸过程中表现出的一些代谢特征进行分析，同时将丙酮酸发酵逐级放大到 5 m3 规模

8 第二节营养条件对光滑球拟酵母 WSH-IP12 生产丙酮酸的影响一、引言由于丙酮酸是代谢途径中的重要中间产物，正常情况下很难在胞外大量积累，因此，尽管研究者在丙酮酸高产菌的选育上开展了大量研究工作，但效果均不太理想。1990 年以前，除了 Uchio 等人的专利外，几乎没有丙酮酸产量超过 20 g/L 的报道。进入 20 世纪 90 年代后，发酵法生产丙酮酸才有了较大的突破，其中具有代表性的丙酮酸高产菌株有两种，一种是携带多种遗传标记的 Torulopsis glabrata ，另一种则是能量代谢被削弱的 Escherichia coli 。在本节中，我们主要讨论和分析营养条件对丙酮酸积累株 T. glabrata WSH-IP12 发酵生产丙酮酸的影响。二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响酵母粉是一种常用的氮源和生长因子的来源，但并不适合菌株 WSH-IP12 发酵生产丙酮酸。如图 5-2-1 所示，随着发酵培养基中酵母粉浓度的增大，细胞干重不断增加而丙酮酸产量(浓度)却迅速下降。当酵母粉浓度达到 10 g/L 时，发酵液中丙酮酸产量几乎降低到零。 0 5 10 15 20 25 0 12 24 36 t / h 细胞干重 / gL-1 0 5 10 15 20 25 0 12 24 36 t / h 丙酮酸浓度 / gL-1 0 20 40 60 80 100 0 12 24 36 t / h 葡萄糖浓度 / gL-1 图 5-2-1 酵母粉浓度对 WSH-IP12 菌株发酵生产丙酮酸的影响酵母粉浓度(g/L): ○ zero (control); □ 1; △ 3; ● 5; ■ 8; ▲ 10. 三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响当初始葡萄糖浓度为 80 g/L 时，由图 5-2-2 可知，培养基中的蛋白胨浓度选择在 15 g/L 较为适宜，此时，丙酮酸产量为 23.4 g/L。蛋白胨浓度低于 15 g/L 时，葡萄糖消耗速度较慢，细胞干重和丙酮酸产量也较低；而若高于此值，则丙酮酸产量明显下降。可以认为，在蛋白胨浓度较高的情况下，细胞干重的增加是以丙酮酸产量的下降为代价的。此外，由图 5-2-2 还可知，若要使细胞在 48 h 内消耗 80 g/L 的葡萄糖，培养基中至少应添加大于 10 g/L 的蛋白胨(氮浓度约为 1.0 g/L)

《发酵工程》课程教学资源（讲义）第五章 丙酮酸发酵过程优化

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