颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》,科学技术出版社,1998年6月,第1版 李永明等著《实用分子生物学方法手册》,科学技术出版社,1998年6月,第1版 五.分子生物学的主要技术和方法 1989年,美国冷泉港出版了《分子克隆实验指南》(第二版),该书比较全面地介绍了 有关方法与技术,以下主要摘要介绍一些该著的基本概念与方法,另外再补充一些新近发展 起来且使用较广的方法,具体内容可查阅参考文献所列举的原著或原作。由于分子生物学技 术与方法发展十分迅速,日新月异,因此,我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道, 以及各有关公司最新产品介绍。 6.8.1.1载体 载体的使用目的: 1.重组基因,以便放大某一基因片段,用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。 方法是:把某一DNA片段插入到相应的载体(比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等), 冾予扩增,用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因 此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常,扩增目的DNA主要借助两类方法,即PCR技术和载体重组技术,鉴于PCR技 术受到酶的性能和方法学等多方面的限制,某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难 所以载体重组技术倍受青睐。 2. DDPCR产物的克隆和测序。 3. RACE PCR产物的克隆和测序 4.构建基因库、cDNA库,等 5.基因功能检测。 6.基因工程(包括基因治疗之类)。 以上一一介绍 )质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子,长度为3kb左右,存在于细菌体中, 独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造,使实验室常用质粒具 备了以下几种特性:1)含有多克隆位点区域,可方便的插入目的DNA片段。2)对细菌的 可转移性,即在实验中,可将质粒诱导入细菌。3)选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这 样,一旦质粒进入细菌,便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力,在含这一抗生素的琼 脂平板上传代,如此,便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4)在细菌体内可获得较高的拷贝 数,例如一种叫pUC的质粒,在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分 生物学中应用最为广泛的载体。 2)λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体 颗粒内,该DNA为一双链分子,其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进 入宿主细胞后,其粘端通过碱基配对而结合,形成环状分子,相隔12bp有两个交错切口。宿 主体内的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子,该DNA分子在感染早期充当 抟录模板。实验用λ噬菌体,在其DNA的中部有一可取代区,含多克隆位点,供插入DNA 用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段,如有的λ噬菌体可插入长达 2000的外源性DNA 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等 6.8.1.2分子克隆常用酶 1.限制性内切酶(限制酶)。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊DNA序 列之上或这一DNA附近的特异位点上,并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端 1)粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物DNA的每条链,则双链DNA交 错割开,产生带突出的粘端的DNA片段。例如,Pst识别双链DNA的这样一段序列并切割 如下: NNNNNCTGCagNNNNN 3NNNNNGACGTCNNNNN 切割后产生两片段颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》，科学技术出版社，1998 年 6 月，第 1 版 李永明等著《实用分子生物学方法手册》，科学技术出版社，1998 年 6 月，第 1 版 五．分子生物学的主要技术和方法 1989 年，美国冷泉港出版了《分子克隆实验指南》（第二版），该书比较全面地介绍了 有关方法与技术，以下主要摘要介绍一些该著的基本概念与方法，另外再补充一些新近发展 起来且使用较广的方法，具体内容可查阅参考文献所列举的原著或原作。由于分子生物学技 术与方法发展十分迅速，日新月异，因此，我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道， 以及各有关公司最新产品介绍。 6．8．1．1 载体 载体的使用目的： 1．重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。 方法是：把某一 DNA 片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等）， 给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA 库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因 此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的 DNA 主要借助两类方法，即 PCR 技术和载体重组技术，鉴于 PCR 技 术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难， 所以载体重组技术倍受青睐。 2．DDPCR 产物的克隆和测序。 3．RACE PCR 产物的克隆和测序。 4．构建基因库、cDNA 库，等。 5．基因功能检测。 6．基因工程（包括基因治疗之类）。 以上一一介绍。 1）质粒。质粒是一类双链、闭环的 DNA 分子，长度为 3kb 左右，存在于细菌体中， 独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用质粒具 备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可方便的插入目的 DNA 片段。2）对细菌的 可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这 样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼 脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体内可获得较高的拷贝 数，例如一种叫 pUC 的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达 500-700 个。因此质粒已成为分 子生物学中应用最为广泛的载体。 2）λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为 50kb 的双链 DNA 分子。在λ噬菌体 颗粒内，该 DNA 为一双链分子，其末端为长 12 个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进 入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔 12bp 有两个交错切口。宿 主体内的 DNA 连接酶很快将切口封闭而形成闭环 DNA 分子，该 DNA 分子在感染早期充当 转录模板。实验用λ噬菌体，在其 DNA 的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入 DNA 之用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的 DNA 片段，如有的λ噬菌体可插入长达 20000bp 的外源性 DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等。 6．8．1．2 分子克隆常用酶 1．限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊 DNA 序 列之上或这一 DNA 附近的特异位点上，并在此切割双链 DNA。切割结果可产生两类末端： 1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的 5′侧切割底物 DNA 的每条链，则双链 DNA 交 错割开，产生带突出的粘端的 DNA 片段。例如，PstI 识别双链 DNA 的这样一段序列并切割 如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’ 切割后产生两片段： ↑