NNNNNCTGCA pGNNNNN 3NNNNN Gp ACGTCNNNNN 这类限制酶主要有: BamH I、 Bgl ll、 ECOR I、HindⅢ、Kpnl、Pst等等。 2)平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链,则产生带平端的DNA 片段。例如:Hae识别双链DNA的这样一段序列,并切割如下: SNNNNNNGGCCNNNNNN 3NNNNNNCCGGNNNNNNS 切割后产生平端的片段:5 NNNNNNGG PCCNNNNNN3 3NNNNNNCCP GGNNNNNNS 这类限制酶主要有: Haelll, Mst I、Scal、SmaI等等 目的在于方便地剪贴DNA。 2.DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA体外合成反应。这些酶作用时大多 需要模板,合成产物的序列与模板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Iaq酶、大肠杆菌 DNA聚合酶I(全酶)和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段( Klenow片段)等 3.连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来,最常用的是T4噬菌体连接酶。 4.脱氧核糖核酸酶I。DNA酶Ⅰ为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链 或单链DNA。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下, DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布 5.反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA链 6.8.1.3重组载体(目的同前面在载体中所介绍的) 有了载体、酶和DNA片段,便可以重组载体。采用某限制酶切割开载体,用DNA连 接酶将载体DNA片段与拟插入的目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时, 插入片段的平端与载体的平端对接,插入片段的粘端与载体的粘端对接,两个粘端的序列互 补。实现载体重组。然后转化特定的大肠杆菌,转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素 抗性基因相应的抗生素培养皿中传代,形成菌落。可以采用原位杂交或扩增阳性单菌落, 量制备DNA,限制酶酶切鉴定重组成功与否。取成功者用于各有关实验。 6.8.1.4DNA的凝胶电泳 为了鉴别或分离分子量不同大小的DAN或RNA片段,最常用的方法就是凝胶电泳。 常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。前者作水平电泳,可分离 200bp-50kb的DNA,在溴乙锭染色下,可清晰地辨别少至50ng的DNA,甚至1-10 nanA 也能辨别得出来,分子生物学中常用此分离和鉴定RNA和DNA;后者作垂直电泳,多用于 分离5-500bp的DNA,精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA,所以常用来测序、 DDPCR、 Footprint等,分离蛋白也常用此胶 6.8.1.5真核细胞RNA的制备 目的: 1.了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化,如 RT-PCR、 Northern blot 2.了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化,如DD-PCR、基因芯片等。 3.获得某一特定组织或细胞全部mRNA,以便建立cDNA库等。 4.获得某一特定组织或细胞全部RNA,作其他用途 真核细胞RNA的制备方法有多种,还有许多种商品试剂盒出售,性能稳定,重复性好。 实验室比较常用的是制备总RNA一步法。该方法操作简便,一次可以分离大量的RNA,原 理是采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍等,抑制RNA的降解,并使RNA与蛋白质分离进入 溶液,离心后,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相,之后被异丙醇沉淀。提取的RNA 可用于 Northern blot和过 Oligo dT柱。后者用于分离mRNA 6.8.1. Northern blot5’N N N N N C T G C A pG N N N N N3’ 3’N N N N N Gp A C G T C N N N N N5’ 这类限制酶主要有：BamH I、BglⅡ、EcoR I、Hind Ⅲ、Kpn I、Pst I 等等。 2）平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生带平端的 DNA 片段。例如：HaeⅢ识别双链 DNA 的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段： 5’N N N N N N G G pC C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C Cp G G N N N N N N5’ 这类限制酶主要有：HaeⅢ、Mst I、Sca I、Sma I 等等。 目的在于方便地剪贴 DNA。 2．DNA 聚合酶。DNA 聚合酶主要用于催化 DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多 需要模板，合成产物的序列与模板互补。最常用 DNA 聚合酶有 PCR 用的 Taq 酶、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I（全酶）和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段（Klenow 片段）等。 3．连接酶。连接酶用于将两段 DNA 拼接起来，最常用的是 T4 噬菌体连接酶。 4．脱氧核糖核酸酶 I。DNA 酶 I 为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链 或单链 DNA 。产物为 5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在 Mg2+存在下， DNA 酶 I 可独立地存在于每条 DNA 链且切割位点随机分布。 5．反转录酶。这类酶可以将 RNA 作为模板合成互补 DNA 链。 6．8．1．3 重组载体（目的同前面在载体中所介绍的） 有了载体、酶和 DNA 片段，便可以重组载体。采用某限制酶切割开载体，用 DNA 连 接酶将载体 DNA 片段与拟插入的目的 DNA 片段重新连接成一个环状的 DNA 分子。连接时， 插入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的粘端与载体的粘端对接，两个粘端的序列互 补。实现载体重组。然后转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素 抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落。可以采用原位杂交或扩增阳性单菌落，小 量制备 DNA，限制酶酶切鉴定重组成功与否。取成功者用于各有关实验。 6．8．1．4 DNA 的凝胶电泳 为了鉴别或分离分子量不同大小的 DAN 或 RNA 片段，最常用的方法就是凝胶电泳。 常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。前者作水平电泳，可分离 200bp-50kb 的 DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至 50ng 的 DNA，甚至 1-10ngDNA 也能辨别得出来，分子生物学中常用此分离和鉴定 RNA 和 DNA；后者作垂直电泳，多用于 分离 5-500bp 的 DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的 DNA，所以常用来测序、DDPCR、 Footprint 等，分离蛋白也常用此胶。 6．8．1．5 真核细胞 RNA 的制备 目的： 1．了解某一特定组织或细胞某一特定 mRNA 转录量的变化，如 RT-PCR、Northern blot 等。 2．了解某一特定组织或细胞全部 mRNA 转录量的变化，如 DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部 mRNA，以便建立 cDNA 库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部 RNA，作其他用途。 真核细胞 RNA 的制备方法有多种，还有许多种商品试剂盒出售，性能稳定，重复性好。 实验室比较常用的是制备总 RNA 一步法。该方法操作简便，一次可以分离大量的 RNA，原 理是采用强 RNA 酶抑制剂异硫氰酸胍等，抑制 RNA 的降解，并使 RNA 与蛋白质分离进入 溶液，离心后，RNA 选择性地进入无 DNA 和蛋白质的水相，之后被异丙醇沉淀。提取的 RNA 可用于 Northern blot 和过 Oligo dT 柱。后者用于分离 mRNA。 6．8．1．6 Northern blot