实验二紫外线的诱变育种 目的要求 通过实验,观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应,并学习物理因素诱变育种的方法 基本原理 紫外线对微生物有诱变作用,主要引起是DNA的分子结构发生改变(同链DNA的相 邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体),从而引起菌体遗传性变异 三.菌种与仪器 菌种:枯草芽孢杆菌; 仪器:血球计数板,显微镜,紫外线灯(15W),电磁搅拌器,离心机 四.操作步骤 (1)菌悬液的制备 (a)取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4-5支,用无菌生理盐水将菌苔洗下,并倒 入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块。 (b)将上述菌液离心(3000/min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理盐 水洗涤2—3次,最后制成菌悬液 (c)用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每亳升108个。 (2)平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后,冷至55℃左右时倒平板,凝固后待用。 (3)紫外线处理 (a)将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 (b)取直径6cm无菌平皿2套,分别加入上述菌悬液5m,并放入无菌搅拌棒于平皿 (c)将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上,在距离为30cm,功率为15W的紫外 线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟 (4)稀释在红灯下,将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-106(具体可 按估计的存活率进行稀释)。 (5)涂平板取104、105、106三个稀释度涂平板,每个稀释度涂平板3只,每只平板加 稀释菌液0.lml,用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作,取未经紫外线处理的菌稀释液涂平 板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板,用黑布(或黑纸)包好,置37℃培养48小时。注意每个平皿背面 要标明处理时间和稀释度 (7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数,根据对照平板上菌落数,计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 存活率 处理后每毫升活菌数 对照每毫升活菌数×100 致死率 对照每毫升活菌数-处理后每毫升活菌数 对照每毫升活菌数 100 (8)观察诱变效应实验二 紫外线的诱变育种 一．目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是 DNA 的分子结构发生改变（同链 DNA 的相 邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三．菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤 （1）菌悬液的制备 （a）取培养 48 小时的枯草芽孢杆菌的斜面 4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒 入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡 30 分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐 水洗涤 2—3 次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108 个。 （2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。 （b）取直径 6cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿 中。 （c）将盛有菌悬液的 2 平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W 的紫外 线灯下分别搅拌照射 1 分钟及 3 分钟。 (4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1 -10-6（具体可 按估计的存活率进行稀释）。 (5)涂平板取 10-4、10-5、10-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3 只，每只平板加 稀释菌液 0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平 板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面 要标明处理时间和稀释度。 (7)计数将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1 分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。 (8)观察诱变效应