(一)培养基 1、基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长）称取100g整糖、0.1gCaC1、0.】 gNaC1、1gNN0、0.5gNgS0·7H0、1gKP0、5g酒石酸铵、4g生物素、1n1微理元素溶液、20g 琼脂，加蒸馏水至1000ml.Ph5.5-6.5. 2、补充培养基（供1ys生长）在基本培养基上补加适量赖氨酸，用量一般在每100如1基本培 养基中加1-20g。 3、马铃薯培养基（可代替补充培养基）将马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切碎，称取200g, 加水10001，煮熟后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的马铃薯汁加2%琼脂、20g蔗糖煮融，分装 到试管。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3-4粒，然后加入融化了的蔗糖和琼脂。 4、杂交培养基（供1ys+×1ys-用）将玉米在水中浸软后（一般浸24h)，捞出晾干，每支 试管放2-3粒，加2-3m1溶化了的2%琼脂，再放入一小片扇形折叠的滤纸（长约3-4cm)塞紧棉 塞。 上述培养基都需分装到试管，塞上棉塞，包上牛皮纸，灭菌30mi,试管取出后摆成斜面（杂 交培养基不需摆斜面)。 四、实验步臻 1、菌种活化实验前57天，把冰箱中保存的野生型和赖氨酸缺陷型菌株取出进行活化。在 无菌条件下，用接种环挑取少量分生孢子或菌丝体分别接在各自的试管培养基上，置于28℃恒 温箱中培养5天左右，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。 2、接种杂交在无菌条件下，用接种环挑取少许野生型和赖氨酸缺陷型的菌丝，接种在同 试管的杂交培养基上，贴上标签，然后在28℃下培养。约2周后子囊成熟，一般当子囊果呈棕 黑色时即可进行观察分析。观察时期要掌握适当。如偏早，虽有子囊但孢子尚末成熟都呈白色。 如过迟，则全为黑色，对交换型和非交换型的分类带来困难。 3、收集子囊果在长有棕黑色子囊果的试管中，加少量无南水，摇动片刻，倒入空三角烧 瓶中，加热煮沸5mim,以防分生孢子飞扬。 4、镜检观察取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠溶液，然后用解剂针将子囊果挑出放到载 玻片上（若子囊果上附着的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠溶液中洗涤，再移到载玻片上） 再用镊子柄平压或盖上另一载玻片，用手指压片，压开子囊果，使子囊充分压散而末玻裂，最后 在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺序。 2（一） 培养基 1、基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长） 称取 100g蔗糖、0.1g CaCl2、0.1 gNaCl、lgNH4NO3、0.5gMgSO4·7H2O、lgKH2PO4、5g酒石酸铵、4ug生物素、1ml微理元素溶液、20g 琼脂，加蒸馏水至 1000ml。Ph5.5-6.5。 2、补充培养基（供lys- 生长） 在基本培养基上补加适量赖氨酸，用量一般在每 100ml基本培 养基中加 1-20mg。 3、马铃薯培养基（可代替补充培养基） 将马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切碎，称取 200g， 加水 1000ml，煮熟后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的马铃薯汁加 2%琼脂、20g 蔗糖煮融，分装 到试管。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放 3-4 粒，然后加入融化了的蔗糖和琼脂。 4、杂交培养基（供 lys+×lys-用） 将玉米在水中浸软后（一般浸 24h），捞出晾干，每支 试管放 2-3 粒，加 2-3ml 溶化了的 2%琼脂，再放入一小片扇形折叠的滤纸（长约 3-4cm）塞紧棉 塞。 上述培养基都需分装到试管，塞上棉塞，包上牛皮纸，灭菌 30min，试管取出后摆成斜面（杂 交培养基不需摆斜面）。 四、实验步骤 1、菌种活化 实验前 5-7 天，把冰箱中保存的野生型和赖氨酸缺陷型菌株取出进行活化。在 无菌条件下，用接种环挑取少量分生孢子或菌丝体分别接在各自的试管培养基上，置于 28℃恒 温箱中培养 5 天左右，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。 2、接种杂交 在无菌条件下，用接种环挑取少许野生型和赖氨酸缺陷型的菌丝，接种在同一 试管的杂交培养基上，贴上标签，然后在 28℃下培养。约 2 周后子囊成熟，一般当子囊果呈棕 黑色时即可进行观察分析。观察时期要掌握适当。如偏早，虽有子囊但孢子尚末成熟都呈白色。 如过迟，则全为黑色，对交换型和非交换型的分类带来困难。 3、收集子囊果 在长有棕黑色子囊果的试管中，加少量无菌水，摇动片刻，倒入空三角烧 瓶中，加热煮沸 5min，以防分生孢子飞扬。 4、镜检观察 取一载玻片，滴 1-2 滴 5%次氯酸钠溶液，然后用解剖针将子囊果挑出放到载 玻片上（若子囊果上附着的分生孢子过多，可先在 5%次氯酸钠溶液中洗涤，再移到载玻片上）， 再用镊子柄平压或盖上另一载玻片，用手指压片，压开子囊果，使子囊充分压散而末破裂，最后 在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺序。 2