实验5粗糙链孢霉子囊孢子的分离和交换 一、实验目的 通过粗糙链孢霉性状遗传的杂交实验，观察分析子囊孢子的分离和交换现象，验证基因分 离和连锁交换规律。 二、实验原理 粗糙链孢霉(Neurospore crassa,.2n=l4)又称红色面包霉，属于真菌门子囊菌纲，其生 活史包括无性和有性两个世代，它的无性世代是通过菌丝的有丝分裂发育成菌丝体，或由分生孢 子发芽形成新的菌丝体：有性世代是由两种不同生理类型的菌丝或称不同的接合型通过融合，或 通过异型核的结合而形成二倍体的合子。合子进行减数分裂产生4个单倍体的四分孢子，再经 次有丝分裂形成8个子囊孢子，成线性排列在子囊中。因此，很适宜接观察分离现象和推断交换 的性质。 本实验以一个赖氨酸缺陷型南株（记作1ys)和一个野生型南株（记作1ys)为亲本进行有 性杂交。Lys必须在基本培养基上补加Lys才能正常生长，且生长缓慢迟熟，产生的子囊孢子呈 灰色（一）1ys在基本培养基上可正常生长，产生的子囊孢子呈黑色(+)。1ys与1ys杂交 产生的子囊果中将出现6种可能的子囊型，其子囊中子囊孢子“+”与“一”的比例为4：4。但 有时由于基因转换出会出现一些异常的比例，如6：2,2：6或5：3,3：5。 交换型子囊的出现是由于该基因与着丝点之间发生了一次染色体片段的交换，所以从交换型 子囊数占总子囊数的百分比，可以计算出该基因与者丝点间的交换值。 三、实验材料、用具及药品 粗糙链孢莓：野生型(1ys)菌株，赖氨酸缺陷型(1ys)茵株. 显微镜、恒温箱、高压灭菌锅、酒精灯、三角烧瓶、试管、培养皿、载玻片、镊子、接种针、解 剖针、滤纸。 CaCl、aCI、NN0、MeS0,·7H0、KPO、蔗糖、酒石酸铵、生物素、赖氨酸、琼脂、5%次氯 酸钠、5路石炭酸、蒸馏水。 微量元素溶液：称取88gNaB40,·10,0、393gCuS0,·50、910mgFe(S0,),·6l0、 8807 mg ZnS0,·7H0,加蒸馏水至1000ml
实验 5 粗糙链孢霉子囊孢子的分离和交换 一、实验目的 通过粗糙链孢霉性状遗传的杂交实验，观察分析子囊孢子的分离和交换现象，验证基因分 离和连锁交换规律。 二、实验原理 粗糙链孢霉（Neurospore crassa，2n=14）又称红色面包霉，属于真菌门子囊菌纲，其生 活史包括无性和有性两个世代，它的无性世代是通过菌丝的有丝分裂发育成菌丝体，或由分生孢 子发芽形成新的菌丝体；有性世代是由两种不同生理类型的菌丝或称不同的接合型通过融合，或 通过异型核的结合而形成二倍体的合子。合子进行减数分裂产生 4 个单倍体的四分孢子，再经一 次有丝分裂形成 8 个子囊孢子，成线性排列在子囊中。因此，很适宜接观察分离现象和推断交换 的性质。 本实验以一个赖氨酸缺陷型菌株（记作lys- ）和一个野生型菌株（记作lys+ ）为亲本进行有 性杂交。Lys- 必须在基本培养基上补加Lys才能正常生长，且生长缓慢迟熟，产生的子囊孢子呈 灰色（—）；lys+ 在基本培养基上可正常生长，产生的子囊孢子呈黑色（+）。lys- 与lys+ 杂交， 产生的子囊果中将出现 6 种可能的子囊型，其子囊中子囊孢子“+”与“一”的比例为 4：4。但 有时由于基因转换出会出现一些异常的比例，如 6∶2，2∶6 或 5∶3，3∶5。 交换型子囊的出现是由于该基因与着丝点之间发生了一次染色体片段的交换，所以从交换型 子囊数占总子囊数的百分比，可以计算出该基因与着丝点间的交换值。 三、实验材料、用具及药品 粗糙链孢霉：野生型（lys+ ）菌株，赖氨酸缺陷型（lys- ）菌株。 显微镜、恒温箱、高压灭菌锅、酒精灯、三角烧瓶、试管、培养皿、载玻片、镊子、接种针、解 剖针、滤纸。 CaCl2、NaCI、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、蔗糖、酒石酸铵、生物素、赖氨酸、琼脂、5%次氯 酸钠、5%石炭酸、蒸馏水。 微量元素溶液：称取 88mg Na2B4O7·10H2O、393mg CuSO4·5H2O、910mg Fe2（SO4）3·6H2O、 8807mg ZnSO4·7H2O，加蒸馏水至 1000ml。 1
(一)培养基 1、基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长）称取100g整糖、0.1gCaC1、0.】 gNaC1、1gNN0、0.5gNgS0·7H0、1gKP0、5g酒石酸铵、4g生物素、1n1微理元素溶液、20g 琼脂，加蒸馏水至1000ml.Ph5.5-6.5. 2、补充培养基（供1ys生长）在基本培养基上补加适量赖氨酸，用量一般在每100如1基本培 养基中加1-20g。 3、马铃薯培养基（可代替补充培养基）将马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切碎，称取200g, 加水10001，煮熟后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的马铃薯汁加2%琼脂、20g蔗糖煮融，分装 到试管。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3-4粒，然后加入融化了的蔗糖和琼脂。 4、杂交培养基（供1ys+×1ys-用）将玉米在水中浸软后（一般浸24h)，捞出晾干，每支 试管放2-3粒，加2-3m1溶化了的2%琼脂，再放入一小片扇形折叠的滤纸（长约3-4cm)塞紧棉 塞。 上述培养基都需分装到试管，塞上棉塞，包上牛皮纸，灭菌30mi,试管取出后摆成斜面（杂 交培养基不需摆斜面)。 四、实验步臻 1、菌种活化实验前57天，把冰箱中保存的野生型和赖氨酸缺陷型菌株取出进行活化。在 无菌条件下，用接种环挑取少量分生孢子或菌丝体分别接在各自的试管培养基上，置于28℃恒 温箱中培养5天左右，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。 2、接种杂交在无菌条件下，用接种环挑取少许野生型和赖氨酸缺陷型的菌丝，接种在同 试管的杂交培养基上，贴上标签，然后在28℃下培养。约2周后子囊成熟，一般当子囊果呈棕 黑色时即可进行观察分析。观察时期要掌握适当。如偏早，虽有子囊但孢子尚末成熟都呈白色。 如过迟，则全为黑色，对交换型和非交换型的分类带来困难。 3、收集子囊果在长有棕黑色子囊果的试管中，加少量无南水，摇动片刻，倒入空三角烧 瓶中，加热煮沸5mim,以防分生孢子飞扬。 4、镜检观察取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠溶液，然后用解剂针将子囊果挑出放到载 玻片上（若子囊果上附着的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠溶液中洗涤，再移到载玻片上） 再用镊子柄平压或盖上另一载玻片，用手指压片，压开子囊果，使子囊充分压散而末玻裂，最后 在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺序。 2
（一） 培养基 1、基本培养基（野生型可生长，缺陷型不能生长） 称取 100g蔗糖、0.1g CaCl2、0.1 gNaCl、lgNH4NO3、0.5gMgSO4·7H2O、lgKH2PO4、5g酒石酸铵、4ug生物素、1ml微理元素溶液、20g 琼脂，加蒸馏水至 1000ml。Ph5.5-6.5。 2、补充培养基（供lys- 生长） 在基本培养基上补加适量赖氨酸，用量一般在每 100ml基本培 养基中加 1-20mg。 3、马铃薯培养基（可代替补充培养基） 将马铃薯洗净去皮，挖去芽眼，切碎，称取 200g， 加水 1000ml，煮熟后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的马铃薯汁加 2%琼脂、20g 蔗糖煮融，分装 到试管。也可将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放 3-4 粒，然后加入融化了的蔗糖和琼脂。 4、杂交培养基（供 lys+×lys-用） 将玉米在水中浸软后（一般浸 24h），捞出晾干，每支 试管放 2-3 粒，加 2-3ml 溶化了的 2%琼脂，再放入一小片扇形折叠的滤纸（长约 3-4cm）塞紧棉 塞。 上述培养基都需分装到试管，塞上棉塞，包上牛皮纸，灭菌 30min，试管取出后摆成斜面（杂 交培养基不需摆斜面）。 四、实验步骤 1、菌种活化 实验前 5-7 天，把冰箱中保存的野生型和赖氨酸缺陷型菌株取出进行活化。在 无菌条件下，用接种环挑取少量分生孢子或菌丝体分别接在各自的试管培养基上，置于 28℃恒 温箱中培养 5 天左右，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。 2、接种杂交 在无菌条件下，用接种环挑取少许野生型和赖氨酸缺陷型的菌丝，接种在同一 试管的杂交培养基上，贴上标签，然后在 28℃下培养。约 2 周后子囊成熟，一般当子囊果呈棕 黑色时即可进行观察分析。观察时期要掌握适当。如偏早，虽有子囊但孢子尚末成熟都呈白色。 如过迟，则全为黑色，对交换型和非交换型的分类带来困难。 3、收集子囊果 在长有棕黑色子囊果的试管中，加少量无菌水，摇动片刻，倒入空三角烧 瓶中，加热煮沸 5min，以防分生孢子飞扬。 4、镜检观察 取一载玻片，滴 1-2 滴 5%次氯酸钠溶液，然后用解剖针将子囊果挑出放到载 玻片上（若子囊果上附着的分生孢子过多，可先在 5%次氯酸钠溶液中洗涤，再移到载玻片上）， 再用镊子柄平压或盖上另一载玻片，用手指压片，压开子囊果，使子囊充分压散而末破裂，最后 在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺序。 2
本实验操作须严格消毒，防止污染，要求：(1)实验用过的接种针要过火灭南：(2)慑 子放入5%次氯酸钠溶液中，浸泡5血i后洗净：(3)用过的载玻片及玻璃器皿用5%石炭酸溶液 浸泡后取出，冲洗擦干：(4)不要的南株和南液须煮沸5mi方可倒去。 五、实验作业 每人接种杂交一试管，待子囊果长成后进行观察，按不同的子囊类型记数填入表，并计算 基因与者丝点间的交换值
本实验操作须严格消毒，防止污染，要求：（1）实验用过的接种针要过火灭菌；（2）镊 子放入 5%次氯酸钠溶液中，浸泡 5min 后洗净；（3）用过的载玻片及玻璃器皿用 5%石炭酸溶液 浸泡后取出，冲洗擦干；（4）不要的菌株和菌液须煮沸 5min 方可倒去。 五、实验作业 每人接种杂交一试管，待子囊果长成后进行观察，按不同的子囊类型记数填入表，并计算 基因与着丝点间的交换值。 3