实验12琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNM的原理和方法。检测上次实验抽提的水稻总DNA的纯度与分 子量。 一、实验原理 凝胶电泳是分离和纯化D片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成 两类：琼脂凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者在分离度上差于后者，但在分离范用上优于 后者。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔 径的大小决定于琼脂糖的浓度。D分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 D分子在琼脂糖凝胶中冰动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DA,其分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂椭凝胶电泳法分离DA,主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关 系。因而就可依据DA分子的大小使其分离。该过程可以通过把示踪染料或分子量标准参照物和 样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DA片段大小的标 记。溴化乙锭(B)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。B可与DN分子形成B-DA复 合物，其发射的荧光强度较游离状态B发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与D的含量 成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 二、实验材料、器具及药品 上次实验提取的水稻总NA, 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉等。 琼脂糖，TBE电泳缓冲液，溴化乙锭(B),载样缓冲液 四、实验步骤 主要包括制胶、点样以及电泳等过程。 ()称取0.8g琼脂糖加入盛有100m11×TB距电泳缓冲液的500m1三角瓶中，据匀，用电子天 平称取三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼盾糖完全溶解，放在天平上加燕馏水至原重量。冷 却到60℃，加入100的0.5mg/m1溴化乙锭(B)，并摇匀。 1
实验 12 琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理和方法。检测上次实验抽提的水稻总 DNA 的纯度与分 子量。 一、实验原理 凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成 两类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者在分离度上差于后者，但在分离范围上优于 后者。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔 径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的 DNA，其分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关 系。因而就可依据 DNA 分子的大小使其分离。该过程可以通过把示踪染料或分子量标准参照物和 样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定 DNA 片段大小的标 记。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复 合物，其发射的荧光强度较游离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上，且荧光强度与 DNA 的含量 成正比。据此可粗略估计样品 DNA 浓度。 二、实验材料、器具及药品 上次实验提取的水稻总 DNA。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉等。 琼脂糖，TBE 电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），载样缓冲液 四、实验步骤 主要包括制胶、点样以及电泳等过程。 ⑴ 称取 0.8g 琼脂糖加入盛有 100ml 1×TBE 电泳缓冲液的 500 ml 三角瓶中，摇匀，用电子天 平称取三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷 却到 60℃，加入 100μl的 0.5mg/ml 溴化乙锭（EB），并摇匀。 1
(②)用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约0℃）倒入，室温冷却凝 周。 ()充分凝因后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳植中，加1×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1-2m,小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 (④用移液器吸取上次实验抽提的水稻总DN4以样品于点样板小孔中，再加入5川1XTE电 泳缓冲液及11的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。 同时点10l入DNA indIII酶切，30ng/ul)作为分子量标准。 ⑤)打开电源开关，调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即 可观察。 (6)将凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带。根 据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据己知分子量的标准DA,通过 线性DN条带的相对位置初步估计样品的分子量。 五、注意事项 ()倒胶时注意胶的温度，最好在55℃左右 (2②)胶一定要凝固好才使用。 (3)拔梳子须垂直向上，避免损坏点样孔。 (4)EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境
⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约 50℃）倒入，室温冷却凝 固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加 1×TBE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1-2mm，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 ⑷ 用移液器吸取上次实验抽提的水稻总 DNA 4μl样品于点样板小孔中，再加入 5μl 1×TBE 电 泳缓冲液及 1μl 的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。 同时点 10μl λDNA(HindIII 酶切，30ng/ul)作为分子量标准。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至 3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即 可观察。 ⑹ 将凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带。根 据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品 DNA 的浓度。同时根据已知分子量的标准 DNA，通过 线性 DNA 条带的相对位置初步估计样品的分子量。 五、注意事项 ⑴ 倒胶时注意胶的温度，最好在 55℃左右。 ⑵ 胶一定要凝固好才使用。 ⑶ 拔梳子须垂直向上，避免损坏点样孔。 ⑷ EB 是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 2