实验11多聚酶链式反应(PCR) 一、实验目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。 二、实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是体外酶促合成特异DNA片段 的一种方法。典型的CR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多 次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNM置于高温下使之解链，人工 合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合：DXA聚合酶在72℃将 单核苷酸从引物的3端开始摻入，沿模板5”一3'端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行 这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的A序列以指数形式扩增。循环的次 数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达10°。PCR技术广 泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突 变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿构 机制的探索及医学鉴定等多方面。 三、实验材料、用具及试剂 水稻总DNA DA热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，1.5m1离心管架，移液器，1.5ml 离心管，0.21离心管，枪头等。 dNTPs,Ta酶，引物一对，10 XPCR Reaction Buffer,40%丙烯酰胺， 四、实验步骤 L.PCR反应 ()PCR反应混合液的配制(n为反应数)： n×2.0反应缓冲液（即10 XPCR Reaction Buffer,其中含l5 mM MgCl, nx2.0 ul dNTP(2mM,each) n×1.5叫引物F(20 nX1.5引物R(2u0
实验 11 多聚酶链式反应（PCR） 一、实验目的 了解 PCR 的基本原理，掌握 PCR 的基本操作技术。 二、实验原理 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段 的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多 次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工 合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在 72℃将 单核苷酸从引物的 3， 端开始掺入，沿模板 5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行 这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次 数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经 20 次循环扩增后可达 106 。PCR技术广 泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突 变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤 机制的探索及医学鉴定等多方面。 三、实验材料、用具及试剂 水稻总 DNA DNA 热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，1.5ml 离心管架，移液器，1.5ml 离心管，0.2ml 离心管，枪头等。 dNTPs，Taq 酶，引物一对，10×PCR Reaction Buffer，40%丙烯酰胺， 四、实验步骤 1.PCR 反应 ⑴ PCR 反应混合液的配制（n 为反应数）： n×2.0μl 反应缓冲液（即 10×PCR Reaction Buffer，其中含 15mM MgCl2） n×2.0μl dNTP(2mM,each) n×1.5μl 引物 F(2μM) n×1.5μl 引物 R(2μM) 1
n×0.1川Tag酶(5U/D 混匀，取19叫分别加入n个0.21PCR管中，各管加入模板DNA1l轻轻用手捧一下 (2)PCR反应程序设计如下： 94℃，预变性5分钟 94℃，变性1分钟 55℃，退火1分钟 >35个循环 72℃，延伸1分钟 72℃，延伸5分钟 PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约需要两个半小时. 2.PCR产物的检测 (3)制各1.2%的琼脂精凝胶. ()取5PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察，记录结果 五、注意事项 (①)使用的全部溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染. (2②)所有PCR试剂中使用的水都应该是最高质量的双蒸水. (③)所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后再分装成仅够一次使用的量储存，从 而确保实验与实验之间的连续性
n×0.1μl Taq 酶(5U/μl) 混匀,取 19μl分别加入 n 个 0.2ml PCR 管中,各管加入模板 DNA 1μl, 轻轻用手摔一下. ⑵ PCR 反应程序设计如下: 94℃,预变性 5 分钟 94℃,变性 1 分钟 55℃,退火 1 分钟 35 个循环 72℃,延伸 1 分钟 72℃,延伸 5 分钟 PCR 反应在带热盖的 PCR 仪上进行,大约需要两个半小时. 2.PCR 产物的检测 ⑶ 制备 1.2%的琼脂糖凝胶. ⑷ 取 5μl PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察,记录结果. 五、注意事项 ⑴ 使用的全部溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染. ⑵ 所有 PCR 试剂中使用的水都应该是最高质量的双蒸水. ⑶ 所有试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后再分装成仅够一次使用的量储存,从 而确保实验与实验之间的连续性. 2