实验6植物有丝分裂染色体制备 一、实验目的 主要掌握有丝分裂染色体制片技术:了解有丝分裂各个时期染色体的特征 二、实验原理 各种生长旺盛的植物组织,如根尖、茎尖、愈伤组织等常进行着活跃的细胞分裂。通过对 材料进行适当的园定处理,酶解和染色,就可以在显微镜下观察到细胞内染色体的变化过程。 有丝分裂中期的染色体长度较短,具有典型的形态特征,易于记数和分析。因此,在细胞 的分裂过程中,进行药物或冰冻处理,可阻止纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期。同时,对 组织细胞进行酸性水解或酶解处理,降解细胞之间的果胶质和细胞的纤维素壁,使细胞易于散开。 三、实验材料、器具及试剂 大麦、玉米及洋葱等根尖 显微镜、水浴锅、镊子、载玻片、盖玻片、小瓶、酒精灯、滤纸等。 0.0028-羟基喹林水溶液(或饱和对二氯苯水溶液,或饱和a-溴萘水溶液):0.075C1溶液: 95%乙醇冰醋酸=3:1固定液:2.5%纤维素酶和2.0%果胶酶水溶液:Giemsa母液: 1/15 sorensen's磷酸缓冲液(p6.8) 四、实验步骤 1、浸种催芽:取少许种子放入培养皿中,加水浸没,于30℃左右浸种1一2天。当种子萌动时, 把水倒去,在铺有湿滤纸的培养皿中催芽。 2、预处理:根长至0.5-1.0cm时切取根尖,投入0.002M8-羟基喹林水溶液中处理:18℃,1-1.5励。 3、前低渗:吸去预处理液,加入0.075NKC1,或水低渗处理10-30min。 4、固定:用甲醇(或95%乙醇):冰醋酸=3:1固定30mi以上,也可固定后放入4℃冰箱保存。 水洗3次,每次10min。 5、酵解:加入2.5%纤维素酶和2.0%果胶酶水溶液,在37℃酶解处理70-120min(根据软化 程度而定)。 6、后低渗:倒去酶液后用蒸馏水冲洗2-3次,在水中停留30加in以上,即可直接用于制片。也 可换入周定液保存
实验 6 植物有丝分裂染色体制备 一、实验目的 主要掌握有丝分裂染色体制片技术;了解有丝分裂各个时期染色体的特征。 二、实验原理 各种生长旺盛的植物组织,如根尖、茎尖、愈伤组织等常进行着活跃的细胞分裂。通过对 材料进行适当的固定处理,酶解和染色,就可以在显微镜下观察到细胞内染色体的变化过程。 有丝分裂中期的染色体长度较短,具有典型的形态特征,易于记数和分析。因此,在细胞 的分裂过程中,进行药物或冰冻处理,可阻止纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期。同时,对 组织细胞进行酸性水解或酶解处理,降解细胞之间的果胶质和细胞的纤维素壁,使细胞易于散开。 三、实验材料、器具及试剂 大麦、玉米及洋葱等根尖。 显微镜、水浴锅、镊子、载玻片、盖玻片、小瓶、酒精灯、滤纸等。 0.002M8-羟基喹林水溶液(或饱和对二氯苯水溶液,或饱和α-溴萘水溶液);0.075MKCl 溶液; 95%乙醇:冰醋酸=3:1 固定液;2.5%纤维素酶和 2.0%果胶酶水溶液;Giemsa 母液; 1/15Msorensen′s 磷酸缓冲液(pH6.8) 四、实验步骤 1、浸种催芽:取少许种子放入培养皿中,加水浸没,于 30℃左右浸种 1-2 天。当种子萌动时, 把水倒去,在铺有湿滤纸的培养皿中催芽。 2、预处理:根长至 0.5-1.0cm 时切取根尖,投入 0.002M8-羟基喹林水溶液中处理;18℃,1-1.5h。 3、前低渗:吸去预处理液,加入 0.075M KCl,或水低渗处理 10-30min。 4、固定:用甲醇(或 95%乙醇):冰醋酸=3:1 固定 30min 以上,也可固定后放入 4℃冰箱保存。 水洗 3 次,每次 10min。 5、酶解:加入 2.5%纤维素酶和 2.0%果胶酶水溶液,在 37℃酶解处理 70-120min(根据软化 程度而定)。 6、后低渗:倒去酶液后用蒸馏水冲洗 2-3 次,在水中停留 30min 以上,即可直接用于制片。也 可换入固定液保存。 1
7、火焰干燥制片:放2一3个根尖在载片上,加一小滴固定液,用镊子将根尖敲醉至浆状。再滴 2一3滴周定液,迅速用镊子夹住载片在酒精灯火焰上加热至着火,然后吹灭火焰。载片在空气 中自然干燥」 8、染色:Giemsa染色液染色,1-3h。自来水冲洗,晾干。 五、作业 1、制备分散良好的染色体制片。 2、绘出有丝分裂各时期的简图。 附:Giemsa(吉姆莎)染液配制 磷酸缓冲液(pH6.8): A液:1/15磷酸二氢钾:称取P0,9.118g溶于1000m1蒸馏水中 B液:1/15磷酸氢二钠:称取NaP0.2H011.876g溶于1000m1蒸偏水中。 使用时按A:B=51:49即配成pH6.8磷酸缓冲液。 Giemsa母液: 取Giemsa粉剂0.5g,加少量甘油研磨至无颗粒(约30分钟以上),再加入甘油共达33ml, 放在56℃温箱或水浴内2小时,促使溶化,冷却后加入甲醇33m1,室温下放置2一3周后,过滤 使用。 用时将Giesa母液用磷酸缓冲液1:20稀释,应随用随配
7、火焰干燥制片:放 2-3 个根尖在载片上,加一小滴固定液,用镊子将根尖敲碎至浆状。再滴 2-3 滴固定液,迅速用镊子夹住载片在酒精灯火焰上加热至着火,然后吹灭火焰。载片在空气 中自然干燥。 8、染色:Giemsa 染色液染色,1-3h。自来水冲洗,晾干。 五、作业 1、制备分散良好的染色体制片。 2、绘出有丝分裂各时期的简图。 附: Giemsa (吉姆莎)染液配制 磷酸缓冲液(pH6.8): A液:1/15 磷酸二氢钾:称取KH2PO4 9.118g溶于 1000ml蒸馏水中。 B液:1/15 磷酸氢二钠:称取Na2HPO4.2H2O11.876g溶于 1000ml蒸馏水中。 使用时按 A:B=51:49 即配成 pH6.8 磷酸缓冲液。 Giemsa 母液: 取 Giemsa 粉剂 0.5g,加少量甘油研磨至无颗粒(约 30 分钟以上),再加入甘油共达 33ml, 放在 56℃温箱或水浴内 2 小时,促使溶化。冷却后加入甲醇 33ml,室温下放置 2-3 周后,过滤 使用。 用时将 Giemsa 母液用磷酸缓冲液 1:20 稀释,应随用随配。 2