细胞生物学教案 第一章绪论 (Introduction) 细胞生物学研究的内容和现状 (Cell biology research substance and present situation) 1.细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 ◆生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系,而细胞是生命体的结 构与牛命活动的基本单位,有了细胞木有宗整的生命活动 ◆细胞生物学是研究细胞基本生命 动规律的科学,它是在不同层次(显微 亚显微与分子水平)上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与 调亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主 要内容。 ◆核心问颗是将遗传与发音在细胞水平上结合起来 细胞生物学的主要研究内容 (1)细胞结构与功能、细胞重要生命活动:〔2)细胞核 染色体以及基因表 达的研究,(3)生物膜与细胞器的研究,〔4)细胞骨架体系的研究,细胞增殖及 其调控(5)细胞分化及其调控,〔6)细胞的衰老与调亡,〔7)细胞的起源与进 化,〔8)细胞工程 当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域 (1)总趋势:细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗 透与交融是总的发展趋势。(2)重点领域:染色体DNA与蛋白 质相互作用关系主要是非组蛋白对基因组的作用,细胞增殖、分化 调亡的相互关系及其调控,细胞信号转导的研究,细胞结构体系的 组装。细胞重大生命活动的相互关系 生殖、发育、疾病与衰老 细胞增雅.细胞分化细胞衰老细胞调士 染色休结构动态变化与基因表这 细胞信号转导 细胞重大生命活过 二、细胞学与细胞生物学发展简史 (History of cytology together and biology 1
细胞生物学教案 第一章 绪论 (Introduction) 一、细胞生物学研究的内容和现状 (Cell biology research substance and present situation) 1.细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科 ◆生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系,而细胞是生命体的结 构与生命活动的基本单位,有了细胞才有完整的生命活动。 ◆细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学,它是在不同层次(显微、 亚显微与分子水平)上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与 凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主 要内容。 ◆核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。 细胞生物学的主要研究内容: 〔1〕细胞结构与功能、细胞重要生命活动:〔2〕细胞核、染色体以及基因表 达的研究,〔3〕生物膜与细胞器的研究,〔4〕细胞骨架体系的研究,细胞增殖及 其调控〔5〕细胞分化及其调控,〔6〕细胞的衰老与凋亡,〔7〕细胞的起源与进 化,〔8〕细胞工程。 当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域 〔1〕总趋势:细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗 透与交融是总的发展趋势。〔2〕重点领域:染色体 DNA 与蛋白 质相互作用关系主要是非组蛋白对基因组的作用,细胞增殖、分化、 凋亡的相互关系及其调控,细胞信号转导的研究,细胞结构体系的 组装。细胞重大生命活动的相互关系 二、细胞学与细胞生物学发展简史 (History of cytology together and biology ) 1
1.细胞的发现 2。细朐学说的建立其音义 ◆细胞学说的基本内容 ()认为细胞是有机体, 一切动植物 都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成:(②)每个细胞作为一个相 对独立的单位,既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体 的牛命有所助益: (3)新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。3.细胞学的经典时期 4.实验细胞学与细胞学的分支及其发展 5.细胞生物学学科的形成与发展 6.细胞生物学的主要学术组织、学术刊物与教科书(I)A1 berts B et al, Essential Cell Biology.New York and London:Garland publishing, 1998 (2)Alberts B et al.Molecuar Biology of the Cell,3rd ed.New York and London:Garland Publishing,Inc.1994 (3)Becker W.M.et al.The World of the Cell.Fourth Ed.The Ben jamin/Cummings Publishing Company.2000 (4Gerald Karp.Cell and Molecular Biolo concepts and experiments. 2nd Edition.Published by John Wiley Sons,Inc. 1999 (5)Lodish H.et al.Molecular Cell Biology.4th Ed.Scientific American Books,Inc.2000. 1抽象思维与动态观点 2结构与功能统一的观与 3.同一性( ity)和多样性(diversity)的问题 4细胞生名 学的主要内容: 基本概念与实验证据:细胞器的动态特征:化学能的产生与利用:细胞的活 动及其调控等。 5.实验科学与实验技术一一细胞真知源于实验室 What we know//How we know 复习与思考题 1.通过学习细胞生物学发展简史,你如何认识细胞学说的重要意义 第二章细胞的基本知识概要 第一节 细胞的基本概念 (essential knowledge of the cell) 一、 细胞是生命活动的基本单位 (the cell is the basic unit of the life activity) 切有机体都由细胞构成,细胞是构成有机体的基本单位 1细胞具有独立的、有序的自控代谢体系,细胞是代谢与功能的基本单位 2细胞是有机体生长与发育的基础 3.细胞是遗传的基本单位,细胞具有遗传的全能性4没有细胞就没有完整的生 2
1.细胞的发现 2.细胞学说的建立其意义 ◆细胞学说的基本内容: ⑴认为细胞是有机体,一切动植物 都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成;⑵每个细胞作为一个相 对独立的单位,既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体 的生命有所助益; ⑶新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。3.细胞学的经典时期 4.实验细胞学与细胞学的分支及其发展 5.细胞生物学学科的形成与发展 6.细胞生物学的主要学术组织、学术刊物与教科书⑴Alberts B et al. Essential Cell Biology. New York and London:Garland publishing, Inc. 1998 ⑵Alberts B et al. Molecuar Biology of the Cell, 3rd ed. New York and London:Garland Publishing,Inc. 1994 ⑶ Becker W.M. et al. The World of the Cell. Fourth Ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company. 2000 ⑷Gerald Karp. Cell and Molecular Biology:concepts and experiments, 2nd Edition. Published by John Wiley & Sons,Inc. 1999 ⑸ Lodish H. et al. Molecular Cell Biology. 4th Ed. Scientific American Books,Inc.2000. ⒈抽象思维与动态观点 ⒉结构与功能统一的观点 ⒊同一性(unity)和多样性(diversity)的问题 ⒋细胞生物学的主要内容: 基本概念与实验证据;细胞器的动态特征;化学能的产生与利用;细胞的活 动及其调控等。 ⒌实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室 What we know//How we know. 复习与思考题 1.通过学习细胞生物学发展简史,你如何认识细胞学说的重要意义 第二章 细胞的基本知识概要 第一节 细胞的基本概念 (essential knowledge of the cell) 一、 细胞是生命活动的基本单位 (the cell is the basic unit of the life activity) 一切有机体都由细胞构成,细胞是构成有机体的基本单位 ⒈细胞具有独立的、有序的自控代谢体系,细胞是代谢与功能的基本单位 ⒉细胞是有机体生长与发育的基础 ⒊细胞是遗传的基本单位,细胞具有遗传的全能性⒋没有细胞就没有完整的生 命 2
二、细胞概念的一些新思考(the new thinking of cell) 1.细胞是多层次非线性的复杂结构体系细胞具有高度复杂性和组织性2.细胞 是物质(结构)、能量与信息过程精巧结合的综合体()细胞完成各种化学反应: (2)细胞 需要和利用能量: (3)细胞参与大量机械活动: (④)细胞对刺激作出反应: 3细胞是高度有序的,具有自组装能力与自组织体系。 ()细胞能进行自我调控: (②)繁殖和传留后 代 三、细胞的基本共性(the fundamental feature of cell) 1所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌,蛋白质构成的生物膜,即细胞 2所有的细胞都含有两种核酸:即DNM与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。 3.作为蛋白质合成的机器 -核糖体 毫无例外地存在于一切细胞内 4所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 第二节、非细胞形态的生命体一病毒及其与细胞的关系 he) 一-relation 病毒的基本知识(basic knowledge of virus) 病毒(virus)一 一核酸分子(DNA或NA)与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合 体:根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类:D水A病毒 RNA病毒类病毒(viroid) 仅由感染性的NA构成: 朊病毒(prion) 仅由感染性的蛋白质亚基构成: 病毒在细胞内增殖(复制)(virus reproduction in the cell) 1病毒侵入细胞,病毒核酸的侵染 2病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成 病声的转成与羟放 三、病毒与细胞在起源与进化中的关系 (the relationship between virus and cells in the origin and evolution) 病毒是非细胞形态的生命体,它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒 与细胞在起源上的关系,目前存在3种主要观点: 1.生物大分子一病毒→细胞→病毒 2.生物大 子→细胞 3.生物大分子一细胞一病毒 第三节原核细胞与真核细胞 (Prokaryotic cell and Eukaryotic cell) 一、 原核细胞(Prokaryotic cell) 3
二、细胞概念的一些新思考(the new thinking of cell) ⒈细胞是多层次非线性的复杂结构体系细胞具有高度复杂性和组织性⒉细胞 是物质(结构)、能量与信息过程精巧结合的综合体⑴细胞完成各种化学反应; ⑵细胞需要和利用能量; ⑶细胞参与大量机械活动; ⑷细胞对刺激作出反应; ⒊细胞是高度有序的,具有自组装能力与自组织体系。 ⑴细胞能进行自我调控; ⑵繁殖和传留后代; 三、细胞的基本共性(the fundamental feature of cell) ⒈所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌,蛋白质构成的生物膜,即细胞 膜。 ⒉所有的细胞都含有两种核酸:即 DNA与 RNA作为遗传信息复制与转录的载体。 ⒊作为蛋白质合成的机器─核糖体,毫无例外地存在于一切细胞内。 ⒋所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 第二节、非细胞形态的生命体——病毒及其与细胞的关系 (the life with non-cell appearance — — relation between virus and the cell) 一、 病毒的基本知识(basic knowledge of virus) 病毒(virus)——核酸分子(DNA 或 RNA)与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合 体;根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类:DNA 病毒 与 RNA 病毒类病毒(viroid)——仅由感染性的 RNA 构成; 朊病毒(prion)——仅由感染性的蛋白质亚基构成; 二、 病毒在细胞内增殖(复制)(virus reproduction in the cell) ⒈病毒侵入细胞,病毒核酸的侵染 ⒉病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成 ⒊病毒的装配、成熟与释放 三、病毒与细胞在起源与进化中的关系 (the relationship between virus and cells in the origin and evolution) 病毒是非细胞形态的生命体,它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒 与细胞在起源上的关系,目前存在 3 种主要观点: ⒈生物大分子→病毒→细胞→病毒 ⒉生物大分子→细胞 ⒊生物大分子→细胞→病毒 第三节 原核细胞与真核细胞 (Prokaryotic cell and Eukaryotic cell) 一、 原核细胞(Prokaryotic cell) 3
◆基本特点:遗传的信息量小,遗传信息载体仅由一个环状DN构成:细胞内 没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核 ◆主要代表: 1.支原体(mycoplast) 一目前发现的最小最简单的细胞 2.细菌(bacteria)3.蓝藻又称蓝细菌(Cyanobacteria) (①)以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统 (②)以核酸(DM或RNA)与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统(3)由特异 蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 细胞的大小及其分析 各类细胞直径的比较 最小的病毒 0.02 支原体细胞 0.1-0.3 细黄细物 1-2 动植物细胞 20-30(10-50) 原生动物细胞 数百至数千 原核细胞与真核细胞的比较原核细胞与真核细胞基本特征的比较原核细胞与 真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较植物细胞与动物细胞的比较古细菌 T(archaebacteria)与真核细胞曾在进化上有过共同历程 三、主要正据 (1)细胞壁的成分与真核细胞一样,而非由含壁酸的肽聚糖构成,因此抑制壁 鞍合成的链素, 抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸,抑制肽聚糖合成 的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强的抑制生长作用,而对古细菌与真 (2)DNA与基因结构:古细菌DNA中有重复序列的存在。此外,多数古核细胞 的基因组中存在内含子。 (3)有类核小体结构:古细菌具有组蛋白,而且能与DA构建成类似核小体结 (4)有类似真核细胞的核糖体:多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势 含有60种以上蛋白,介于真核细胞(70~84)与真细菌(55)之间。抗4 素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。 (5)5 SrRNA:根据对5 SrRNA的分子进化分析,认为古细菌与真核生物同属 类,而真细菌却与之差距甚远。5 S rRNA二级结构的研究也说明很多古细 菌与真核生物相似。 除上述各点外, 根据DNA聚合酶分析,氨基酰tRNA合成酶的作用, 起始金 基酰tNA与肽链延长因子等分析,也提供了以上类似依据,说明古细菌与真核 生物在进化上的关系较真细菌类更为密切。因此近年来,真核细胞起源于古细菌 的观点得到了加强 4
◆基本特点:遗传的信息量小,遗传信息载体仅由一个环状 DNA 构成;细胞内 没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核 膜。 ◆主要代表: ⒈支原体(mycoplast)——目前发现的最小最简单的细胞; ⒉细菌(bacteria)⒊蓝藻又称蓝细菌(Cyanobacteria) 二、 真核细胞(Eukaryotic cell) 1 真核细胞的基本结构体系: ⑴以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统; ⑵以核酸(DNA 或 RNA)与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统⑶由特异 蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 细胞的大小及其分析 各类细胞直径的比较 最小的病毒 支原体细胞 细菌细胞 动植物细胞 原生动物细胞 0.02 0.1-0.3 1-2 20-30(10-50) 数百至数千 原核细胞与真核细胞的比较原核细胞与真核细胞基本特征的比较原核细胞与 真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较植物细胞与动物细胞的比较古细菌 (Archaebacteria) 古细菌(archaebacteria)与真核细胞曾在进化上有过共同历程 三、主要证据 (1)细胞壁的成分与真核细胞一样,而非由含壁酸的肽聚糖构成,因此抑制壁 酸合成的链霉素, 抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸,抑制肽聚糖合成 的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强的抑制生长作用,而对古细菌与真 核细胞却无作用。 (2)DNA 与基因结构:古细菌 DNA 中有重复序列的存在。此外,多数古核细胞 的基因组中存在内含子。 (3)有类核小体结构:古细菌具有组蛋白,而且能与 DNA 构建成类似核小体结 构。 (4)有类似真核细胞的核糖体:多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势, 含有 60 种以上蛋白,介于真核细胞(70~84)与真细菌(55)之间。抗生 素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。 (5)5S rRNA:根据对 5S rRNA 的分子进化分析,认为古细菌与真核生物同属一 类,而真细菌却与之差距甚远。5S rRNA 二级结构的研究也说明很多古细 菌与真 核生物相似。 除上述各点外,根据 DNA 聚合酶分析,氨基酰 tRNA 合成酶的作用,起始氨 基酰 tRNA 与肽链延长因子等分析,也提供了以上类似依据,说明古细菌与真核 生物在进化上的关系较真细菌类更为密切。因此近年来,真核细胞起源于古细菌 的观点得到了加强。 4
复习与思考题 1.根据你所掌握的知识,如何理解“细胞是生命活动的基本单位”这一概念? 2.病毒是非细胞形态的生命体,又是最简单的生命体,请论证一下它与细胞不 可分割的关系。 3.为什么说支原体可能是最小最简单的细胞存在形式? 第三章细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 第一节细胞形态结构的观察方法 (study method for cell morphology and structure) 一、光学显微镜技术(light microscopy) 1.普通复式光学显微镜技术 (①)光镜样本制作2)分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 2.荧光5D= 0.617 cence Microscopy) ◆原卫 N.Sina/2 ①)直接荧光标记技术(2间接免疫荧光标记技术 (③)在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位:如绿色荧光蛋白 (GFP)的应用 3.激光共焦扫描显微镜技术(Laser Confocal Microscopy) ◆原理◆应用: 排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率(1.4一1.7),可重 构样品的三维结构。 4.相差显微镜(phase-contrast microscope) 将光程差或相位差转换成振幅差,可用于观察活细胞5.微分干涉显微镜 (differential interference contrast microscope,DIC) 明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞 器6.录像增第品微锫技术(video 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的 运动 二、电子显微镜技术(Electro microscopy) 1.电子显微镜的基本知识 由镜与光镜的出较 显微 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原 培 LM 200nm 可见光 玻璃透镜 要求真空 利用样品对光的吸收形成 (400-700 明暗反差和颜色变化 FM 紫外光 玻璃透镜 不要求真空 (约200nm) EM 100nn 电子束 电磁透镜 要求真空 利用样品对电子的散射和 (0.01-0.9) 1.33x10 透射形成明暗反差
复习与思考题 1.根据你所掌握的知识,如何理解“细胞是生命活动的基本单位”这一概念? 2.病毒是非细胞形态的生命体,又是最简单的生命体,请论证一下它与细胞不 可分割的关系。 3.为什么说支原体可能是最小最简单的细胞存在形式? 第三章 细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 第一节 细胞形态结构的观察方法 (study method for cell morphology and structure) 一、光学显微镜技术(light microscopy) 1.普通复式光学显微镜技术 ⑴光镜样本制作⑵分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 2.荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy) ◆原理◆应用: ⑴直接荧光标记技术⑵间接免疫荧光标记技术 ⑶在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位:如绿色荧光蛋白 (GFP)的应用 3.激光共焦扫描显微镜技术(Laser Confocal Microscopy) ◆原理◆应用: 排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7),可重 构样品的三维结构。 4.相差显微镜(phase-contrast microscope) 将光程差或相位差转换成振幅差,可用于观察活细胞 5.微分干涉显微镜 (differential interference contrast microscope, DIC) 明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞 器 6.录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy) 计算机辅助的 DIC 显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的 运动 二、电子显微镜技术(Electro microscopy) 1.电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 5 利用样品对光的吸收形成 明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和 透射形成明暗反差 要求真空 不要求真空 要求真空 1.33x10P -5P~ 玻璃透镜 玻璃透镜 电磁透镜 可见光 (400-700) 紫外光 (约200nm) 电子束 (0.01-0.9) 200nm 100nm LM FM EM 显微 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 镜
电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 2.主要电镜制样技术(1)负染色技术 负染色技术(Negative staining)与金属投影染色背景,衬托出样品的 精细结构(2)冰冻蚀刻技术 冰冻蚀刻技术(Freeze 。etching)(技术示意图)冰冻断裂与蚀刻复型 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)(3)超薄切片技术 超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图(④)电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应 用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁 振分析技术 日结△ ,是当前结构生 (Structural Biol 08y) 要研究生物大分子空间结构及其相互关系一 一的主要实验手段。 3.扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM) 原理与应用: 电子“探针”扫描,激发样品表面放出二次电子,探测器收集二次电子成象。 C0,临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题 三、扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)扫描遂道显微镜(scanning tunneling microscope Scanning Probe Microscope,SPN(80年代发展起来的检测样品微观结构的 仪器)句括:S、AF、磁力显微、摩力微锫等 1.原理:扫描探针与样品接触或达到很近 离时,即产生彼此间相互作用力 如量子力学中的隧道效应(隧道电流)、原子间作用力、磁力、摩撟 力等,并在计算机显示出来,从而反映出样品表面形貌信息、电特性 或磁特性等。 2装置:扫描的压电陶瓷,逼近装置,电子学反馈控制系统和数据采集、处理、 示系 3特点:(1)可对晶体或非晶体成像,无需复杂计算,且分辨本领高。(侧分 辨率为0.1~0.2nm,纵分辨率可达0.01nm): (2)可实时得到样品表面三维图象,可测量厚度信息: (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作:非破坏性测量。 (4)可连续成像,进行动态观察 4用途:纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结 构。 第二节细胞组分的分析方法
电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 2.主要电镜制样技术⑴负染色技术 负染色技术(Negative staining)与金属投影染色背景,衬托出样品的 精细结构⑵冰冻蚀刻技术 冰冻蚀刻技术(Freeze etching)(技术示意图)冰冻断裂与蚀刻复型: 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching)⑶超薄切片技术 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 ⑷电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应 用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与 X-射线晶体衍射技术及核磁 共振分析技术相结合,是当前结构生物学(Structural Biology)——主 要研究生物大分子空间结构及其相互关系——的主要实验手段。 3.扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM) 原理与应用: 电子“探针”扫描,激发样品表面放出二次电子,探测器收集二次电子成象。 CO2 临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。 三、扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)扫描遂道显微镜(scanning tunneling microscope ) Scanning Probe Microscope,SPM(80 年代发展起来的检测样品微观结构的 仪器)包括:STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等。 ⒈原理:扫描探针与样品接触或达到很近距离时,即产生彼此间相互作用力, 如量子力学中的隧道效应(隧道电流)、原子间作用力、磁力、摩擦 力等,并在计算机显示出来,从而反映出样品表面形貌信息、电特性 或磁特性等。 ⒉装置:扫描的压电陶瓷,逼近装置,电子学反馈控制系统和数据采集、处理、 显示系统。 ⒊特点:(1)可对晶体或非晶体成像,无需复杂计算,且分辨本领高。(侧分 辨率为 0.1~0.2nm,纵分辨率可达 0.01nm); (2)可实时得到样品表面三维图象,可测量厚度信息; (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作;非破坏性测量。 (4)可连续成像,进行动态观察 ⒋用途:纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结 构。 第二节 细胞组分的分析方法 6
(analysis method for cell composition) 离心分离技术(techniqe 用途 分离细胞 与生物大分子及其 速离心:分离密度不同的细胞 组分2密度梯度离心:精细组分或生物大分子的分离. 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 (the manifestation method of the nuclear acid,protein,sugar,enzyme, Linid etc in the ce11) ◆原理: 显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞 中的分布和含量 Feulgen staining 三、 特异蛋白抗原的定位与定性 1。 ation and qualitify of special antige) 1.免疫荧光技术: 快速、灵敏、有特异性,但其分辨率有限 (I)蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot) (2)免疫电镜技术! 2.免疫铁蛋白技术 免疫酶标技 4.免疫胶体金技术 ◆应用:通过对分泌蛋白的定位,可以确定某种蛋白的分泌动态;胞内酶 的研究:膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 四、 细胞内特异核酸的定位与定性 cation qualitify special nuclear acid) 1.光镜水平的原位杂交技术(同位素标记或荧光素标记的探针 2.电镜水平的原位杂交技术(生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金 标记结合) 3.PCR技术 五 射自显影技术 .原 里及应 用 ()利用同位素的放射自显影,对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量 研究: (②)实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 2步摩. 前体物掺入细胞(标记 持续标记和脉冲标记 一放射自显影 六、 定量细胞化学分析技术(cytochemical analysis technique) 1.细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收,测定这些物质(如核酸与蛋白 质等)在细胞内的含最。句括:紫外光显微分光光府定法:可见光显微分 光光度测定法 2.流式细胞仪(F1 ow Cytometry) ◆主要应用: 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量:测定细胞群体中
(analysis method for cell composition) 一、 离心分离技术(technique of concentration) 用途:分离细胞器与生物大分子及其复合物⒈差速离心:分离密度不同的细胞 组分⒉密度梯度离心:精细组分或生物大分子的分离. 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 (the manifestation method of the nuclear acid,protein,sugar,enzyme, Lipid etc.in the cell) ◆原理:利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征, 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞 中的分布和含量。 Feulgen Staining 三、 特异蛋白抗原的定位与定性 (location and qualitify of special antige) 1.免疫荧光技术: 快速、灵敏、有特异性,但其分辨率有限 ⑴蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot) ⑵免疫电镜技术: 2.免疫铁蛋白技术 3.免疫酶标技术 4.免疫胶体金技术 ◆ 应用:通过对分泌蛋白的定位,可以确定某种蛋白的分泌动态;胞内酶 的研究;膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等 四、 细胞内特异核酸的定位与定性 (location and qualitify of special nuclear acid) 1.光镜水平的原位杂交技术(同位素标记或荧光素标记的探针) 2.电镜水平的原位杂交技术(生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金 标记结合) 3.PCR 技术 五、 放射自显影技术 1.原理及应用: ⑴利用同位素的放射自显影,对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量 研究; ⑵实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 2 步骤: 前体物掺入细胞(标记:持续标记和脉冲标记)——放射自显影 六、 定量细胞化学分析技术(cytochemical analysis technique) 1.细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收,测定这些物质(如核酸与蛋白 质等)在细胞内的含量。包括:紫外光显微分光光度测定法;可见光显微分 光光度测定法。 2.流式细胞仪(Flow Cytometry) ◆主要应用: 用于定量测定细胞中的 DNA、RNA 或某一特异蛋白的含量;测定细胞群体中 7
不同时相细胞的数量:从细胞群体中分离某些特异染色的细胞:分离DNA 含量不同的中期染色体。 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养(cel1 culture)L.动物细胞培养 (I)类型:原代培养细胞(primary culture cell) 继代培养细胞(sub-culture cell) (2)细胞株(cell strain)正常二倍体,接触抑制(3)细胞系(cell1ine)亚 二倍体,接触抑制丧 2.植物细胞类型:原生质体培养(体细胞培养):单倍体细胞培养(花药培养) 3.非细胞体系(cel1-free system) 二、细胞工程(cell engineering)l.细胞融合(cell fusion)与细胞杂交(cell hybridization)技术 2.单克隆抗体 0n0 one antibody)技术 图细胞拆合与显微操作技术 (①)物理法结合显微操作技术(图1、图2) (2)化学法结合离心技术 (3)制备核体(karyoplast)和胞质体(cytoplast). 4.其它技术 遗传分析(mutant,knock out,knock in) 复习与思考题 1.光学显微镜技术有哪些新发展?它们各有哪些突出优点?为什么电子显微镜 不能完全替代光学显微镜 2.为什么说细胞培养是细胞生物学研究的最基本技术之一? 第四章细胞质膜与细胞表面 (cell membrance and cell surface) 第一节细胞质膜与细胞表面特化结构 (plasma membrane and specific structure of cell surface) r membrane,)生物膜(biomembrane) 、细胞质膜的结构模型(structure model of cell membrane) 1.研究简虫 2.结构模型 〔1)E Gorter和F.Grendel(1925) “蛋白质-脂类蛋白质”三夹板质膜结构模型 (2)J.D.Robertson(1959年): 单位膜模型(unit membrane model) (3)S.J.Singer GNicolson (1972): 生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model)
不同时相细胞的数量;从细胞群体中分离某些特异染色的细胞;分离 DNA 含量不同的中期染色体。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养(cell culture)1.动物细胞培养 ⑴类型:原代培养细胞(primary culture cell) 继代培养细胞(sub-culture cell) ⑵细胞株(cell strain) 正常二倍体,接触抑制⑶细胞系(cell line) 亚 二倍体,接触抑制丧失 2.植物细胞类型:原生质体培养(体细胞培养);单倍体细胞培养(花药培养) 3.非细胞体系(cell-free system) 二、细胞工程 (cell engineering)⒈细胞融合(cell fusion)与细胞杂交(cell hybridization)技术 ⒉单克隆抗体(monoclone antibody)技术 图细胞拆合与显微操作技术 ⑴物理法结合显微操作技术(图 1、图 2) ⑵化学法结合离心技术 ⑶制备核体(karyoplast)和胞质体(cytoplast)。 ⒋其它技术 遗传分析(mutant, knock out, knock in) 复习与思考题 1.光学显微镜技术有哪些新发展?它们各有哪些突出优点?为什么电子显微镜 不能完全替代光学显微镜 2.为什么说细胞培养是细胞生物学研究的最基本技术之一? 第四章 细胞质膜与细胞表面 (cell membrance and cell surface) 第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构 (plasma membrane and specific structure of cell surface) 细胞质膜(plasma membrane),又称细胞膜(cell membrane)。 细胞内膜(intracellular membrane); 生物膜(biomembrane) 一、细胞质膜的结构模型(structure model of cell membrane) 1.研究简史 2.结构模型 〔1〕E.Gorter 和 F.Grendel(1925): “蛋白质-脂类-蛋白质”三夹板质膜结构模型 〔2〕J.D.Robertson(1959 年): 单位膜模型(unit membrane model) 〔3〕S.J.Singer 和 G.Nicolson(1972): 生物膜的流动镶嵌模型(fluid mosaic model) 8
〔4)K.Simons et al(1997):脂筏模型(lipid rafts model) Functional rafts in Cell membranes.Nature 387:569-572 3.生物膜结构 (1)磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分, 尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白: (2)蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面,膜蛋白是赋 予生物膜功能的主要决定者: (3)生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体。 entra rane biology 二、膜脂 生物膜的基本组成成分 (membrane lipid-basic component of the biological membrane) 1.成分:膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。 (1)磷脂:是膜脂的基本成分(50%以上) ◆分为二类: 甘油脂和迷脂 ◆主要特征:①具有 个极性头和两个非极性的尾(脂肪酸链)(心磷脂 除外) ②脂肪酸碳链碳原子为偶数,多数碳链由16,18或20个组 成: ③饱和脂肪酸(如软脂酸)及不饱和脂肪酸(如油酸) (2)糖脂:糖脂普遍存在于原核和真核细胞的质膜上(5%以下),神经细胞 糖脂含量较高: 〔3)胆固醇:胆固醇存在于真核细胞膜上(30%以下),细菌质膜不含有胆固 醇,但某些细菌的膜脂中含有甘油脂等中性脂类。 2.膜脂的4种热运动方式 (1)沿膜平面的侧向运动(基本运动方式),其扩散系数为10-8m2s 〔2)脂分子围绕轴心的自旋运动: (3)脂分子尾部的摆动: 〔4)双层脂分子之间的翻转运动,发生频率还不到脂分子侧向交换频率的10 一10。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。 3.脂质体(p 脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人 工膜。 〔1)脂质体的类型 ◆水溶液中的磷脂分子团: ◆球形脂质休】 ◆平面脂质体膜 ◆用于疾病治疗的脂质体的示意图 9
〔4〕K.Simons et al(1997): 脂筏模型(lipid rafts model) Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572 3.生物膜结构 〔1〕磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分, 尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白; 〔2〕蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面, 膜蛋白是赋 予生物膜功能的主要决定者; 〔3〕生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体。 “Central dogma ” of membrane biology 二、膜脂——生物膜的基本组成成分 (membrane lipid——basic component of the biological membrane) 1.成分:膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。 〔1〕磷脂:是膜脂的基本成分(50%以上) ◆分为二类:甘油磷脂和鞘磷脂 ◆主要特征:①具有一个极性头和两个非极性的尾(脂肪酸链)(心磷脂 除外); ②脂肪酸碳链碳原子为偶数,多数碳链由 16,18 或 20 个组 成; ③饱和脂肪酸(如软脂酸)及不饱和脂肪酸(如油酸); 〔2〕糖脂:糖脂普遍存在于原核和真核细胞的质膜上(5%以下),神经细胞 糖脂含量较高; 〔3〕胆固醇:胆固醇存在于真核细胞膜上(30%以下),细菌质膜不含有胆固 醇,但某些细菌的膜脂中含有甘油脂等中性脂类。 2.膜脂的4种热运动方式 〔1〕沿膜平面的侧向运动(基本运动方式),其扩散系数为 10-8cm2/s; 〔2〕脂分子围绕轴心的自旋运动; 〔3〕脂分子尾部的摆动; 〔4〕双层脂分子之间的翻转运动,发生频率还不到脂分子侧向交换频率的 10 -10。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。 3.脂质体(liposome) 脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人 工膜。 〔1〕脂质体的类型。 ◆水溶液中的磷脂分子团; ◆球形脂质体; ◆平面脂质体膜; ◆用于疾病治疗的脂质体的示意图 9
(2)脂质体的应用 ◆研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质: ◆脂质体中裹入DNA可用于基因转移 ◆在临床治疗中,脂质体作为药物或酶等载体 三膜蛋白(membrane protein) 1.基本类型 〔1)外在(外周)膜蛋白(extrinsic/peripheral membrane proteins): 水溶性蛋白,靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极 生头部非共价结合 ,易分离 (2)内在(整合)膜蛋白((intrinsic/integral membrane proteins)。 水不溶性蛋白,形成跨膜螺旋,与膜结合紧密,需用去垢剂使膜崩解后 才可分离 (3)脂质错定蛋白(lipid-anchored roteins) 通过磷脂或脂肪酸错定,共价结合 2. 内在膜蛋白与膜 结合 的 〔1)膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。 〔2)跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电的极性头形 成离子键,或带负电的氨基酸残基通过C2+、Mg2+等阳离子与带负电 的磷脂极性头相互作用。 (3)某些膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子 插入脂双层之间,进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力,还有少数蛋白与 糖脂共价结合。 3.外在膜蛋白与膜脂结合的方式 4:去本折是端亲水、另一端疏水的两性小分子是分离与研究膜蛋白的觉 用试剂。 (2)离子型去垢剂(SDS)和非离子型去垢剂(TritonX-100) SDS:CH3- -(CH2)- -0503- -Na TritonX-100: C(CHs)- CH C(CK 0 —CH—CHOl。-H 四、确定膜蛋白方向的实验程序 (experimental protocal to determine the derection of membrane protein) 1.胰酶消化法
〔2〕脂质体的应用 ◆研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质; ◆脂质体中裹入 DNA 可用于基因转移; ◆在临床治疗中,脂质体作为药物或酶等载体 三 膜蛋白(membrane protein) 1.基本类型 〔1〕外在(外周)膜蛋白(extrinsic/peripheral membrane proteins ); 水溶性蛋白,靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极 性头部非共价结合,易分离。 〔2〕内在(整合)膜蛋白(intrinsic/ integral membrane proteins)。 水不溶性蛋白,形成跨膜螺旋,与膜结合紧密,需用去垢剂使膜崩解后 才可分离。 〔3〕脂质锚定蛋白(lipid-anchored proteins) 通过磷脂或脂肪酸锚定,共价结合 2.内在膜蛋白与膜脂结合的方式 〔1〕膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。 〔2〕跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电的极性头形 成离子键,或带负电的氨基酸残基通过 Ca2+、Mg2+等阳离子与带负电 的磷脂极性头相互作用。 〔3〕某些膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子, 插入脂双层之间,进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力,还有少数蛋白与 糖脂共价结合。 3.外在膜蛋白与膜脂结合的方式 4.去垢剂(detergent) 〔1〕去垢剂是一端亲水、另一端疏水的两性小分子,是分离与研究膜蛋白的常 用试剂。 〔2〕离子型去垢剂(SDS)和非离子型去垢剂(Triton X-100) SDS: CH3——(CH2)11——OSO3——Na+ TritonX-100: C(CH3)3——CH2——C(CH2)————O——(CH2)2——O——[CH2——CH2O]n——H 四、确定膜蛋白方向的实验程序 (experimental protocal to determine the derection of membrane protein) 1.胰酶消化法 10