实验四线粒体的分离制备与观察 【实验目的】 1.了解差速离心技术的原理 2.掌握线粒体的差速离心分离技术。 【实验原理】 差速离心(difriifution)是利用不同物质颗粒沉降系数的差别，由低速向高 速离心时，各种沉降系数不同的颗粒可先后分批沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别 在一个或几个数量级的颗粒，可以用差速离心法分离，该方法简单，但分辨率不高，沉淀系 数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。差速 离心用到的仪器为离心机，一般认为，转速为10-25Kmin的离心机称为高速离心机：转速 低于1 0Kr/min的离心机称为低速离心机：转速超过25 Kr/min的离心机称为超速离心机。目 前超速离心机的最高转速可达1O0 Kr/min,离心力超过500Kg。 ●9 Time 图4两种不同的离心分离方式。左图为差速离心，右图为密度梯度离心 采用差速离心方法，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，可用于分离不同大小 的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物 酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体和大分子。通过差速离心可将细胞器初步分离，常 需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当 的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。悬浮介质通常采用缓冲的燕糖溶液，它较接 近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性：pH7.2的条件下，亚细 胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在4℃，避免酶失活。 线粒体的检测鉴定采用詹纳斯绿B(Janus green B)染色观察。线粒体内膜上分布有细胞 色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而 胞质中的染料被还原成无色。 【材料、器具与试剂】 (一)材料：玉米黄化苗，猪肝脏等。 9 实验四 线粒体的分离制备与观察 【实验目的】 1.了解差速离心技术的原理 2.掌握线粒体的差速离心分离技术。 【实验原理】 差速离心(differential centrifugation) 是利用不同物质颗粒沉降系数的差别，由低速向高 速离心时，各种沉降系数不同的颗粒可先后分批沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别 在一个或几个数量级的颗粒，可以用差速离心法分离，该方法简单，但分辨率不高，沉淀系 数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。差速 离心用到的仪器为离心机，一般认为，转速为 10~25Kr/min 的离心机称为高速离心机；转速 低于 10Kr/min 的离心机称为低速离心机；转速超过 25Kr/min 的离心机称为超速离心机。目 前超速离心机的最高转速可达 100Kr/min，离心力超过 500Kg。 图 4 两种不同的离心分离方式。左图为差速离心，右图为密度梯度离心 采用差速离心方法，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，可用于分离不同大小 的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物 酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体和大分子。通过差速离心可将细胞器初步分离，常 需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当 的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接 近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2 的条件下，亚细 胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在 4℃，避免酶失活。 线粒体的检测鉴定采用詹纳斯绿 B(Janus green B)染色观察。线粒体内膜上分布有细胞 色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿 B 染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而 胞质中的染料被还原成无色。 【材料、器具与试剂】 （一）材料：玉米黄化苗，猪肝脏等。 9