(二)器具：冷冻高速离心机，研体，玻璃匀浆器，普通光学显微镜，天平，恒温水浴锅 解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸、1.5m离 心管，量筒，烧杯。 (三)试剂： 1.Ringer溶液：称取氯化钠8.50g,氯化钙0.03g,氯化钾0.25g,溶于燕馏水，定容至100 ml。 2.1%詹纳斯绿B溶液：称取0.5g詹纳斯绿B溶于50 ml Ringer溶液中，稍加热(3040C)使 之很快溶解，用滤纸过滤，即成1%溶液，储存备用。 3.1/5000詹纳斯绿B溶液：实验前，取1%詹纳斯绿B溶液1ml,加入49 ml Ringeri溶液混 匀，即成1/50O0詹纳斯绿B溶液，装入棕色瓶备用。溶液最好现用现配，以保持它的充分氧 化能力。 4.1.0M的Tis-HCI缓冲液(pH7.4):称量12.11gTis置于烧杯中，加入约80ml的去离子 水，充分搅拌溶解。然后加入浓HC约7.0m将pH调至7.4，将溶液定容至100ml,高温高压 灭葡后，室温保存备用。 5.0.5 M EDTA(pH8.0)溶液：称取18.61 gNacEDTA·2HO,置于烧杯中，加入约80ml 的去离子水，充分搅拌。用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH),注意：pH值至8.O时， EDTA才能完全溶解。加去离子水将溶液定容至1O0ml,高温高压灭菌，室温保存备用。 6.线粒体分离介质(0.25M蔗糖，50 mM Tris-HCl,3 mM EDTA,0.75 g/LBSA):称 取燕糖85.5g,取1.0M的Tris-HCI缓冲液(pH74)50ml,0.5 M EDTA(pH80)溶液6ml,加 入0.75g牛血清白蛋白(BSA),加入蒸馏水，溶解，定容至1L,备用。 7.线粒体保存液(0.3M甘露醇，pH7.4)：称取甘露醇5.46g,溶于蒸馏水中，调节pH 至7.4，然后定容至100ml,备用。 80.9%生理盐水：称取9克氯化钠，溶解在蒸馏水中，定容到1L。 9.0.25M蔗糖溶液：称取蔗糖85.5g,加入蒸馏水，溶解，定容至1L。 10.20%次氯酸钠溶液。 【实验步骤】 一、动物肝脏线粒体的分离 1,制备肝细胞匀浆：取动物肝脏，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水分，称取 肝组织1g,剪碎：用预冷的0.25M蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9ml预冷的0,25M 燕糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0℃4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝组织制成匀浆。 2.取匀浆液1.5ml于1.5ml的Ep管中，置于冷冻离心机中，以2500pm离心10min 3.取1.0ml上清转入新EP管中，置于冷冻离心机中，以100O0rpm离心10min,弃 上清，得到沉淀即为线粒体。 4.加入预冷的0.25M蔗糖溶液1.5ml,摇匀洗涤后，10000pm离心5min,弃上清 重复两次。（二）器具：冷冻高速离心机，研钵，玻璃匀浆器，普通光学显微镜，天平，恒温水浴锅， 解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸、1.5 ml 离 心管，量筒，烧杯。 （三）试剂： 1.Ringer溶液：称取氯化钠8.50g，氯化钙0.03g，氯化钾0.25g，溶于蒸馏水，定容至100 ml。 2.1%詹纳斯绿B溶液：称取0.5g詹纳斯绿B溶于50 ml Ringer溶液中，稍加热(30~40℃)使 之很快溶解，用滤纸过滤，即成1%溶液，储存备用。 3.1/5000詹纳斯绿B溶液：实验前，取1%詹纳斯绿B溶液1 ml，加入49 ml Ringer溶液混 匀，即成1/5000詹纳斯绿B溶液，装入棕色瓶备用。溶液最好现用现配，以保持它的充分氧 化能力。 4.1.0 M的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）：称量12.11g Tris置于烧杯中，加入约80 ml的去离子 水，充分搅拌溶解。然后加入浓HCl约7.0 ml将pH调至7.4，将溶液定容至100 ml，高温高压 灭菌后，室温保存备用。 5.0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液：称取18.61 g Na2EDTA·2H2O，置于烧杯中，加入约80 ml 的去离子水，充分搅拌。用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH），注意：pH值至8.0时， EDTA才能完全溶解。加去离子水将溶液定容至100 ml，高温高压灭菌，室温保存备用。 6.线粒体分离介质（0.25 M蔗糖，50 mM Tris-HCl，3 mM EDTA，0.75 g/L BSA）：称 取蔗糖85.5 g，取1.0 M的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）50 ml，0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液6 ml，加 入0.75 g牛血清白蛋白（BSA），加入蒸馏水，溶解，定容至1 L，备用。 7.线粒体保存液（0.3 M甘露醇，pH 7.4）：称取甘露醇5.46g，溶于蒸馏水中，调节pH 至7.4，然后定容至100 ml，备用。 8.0.9%生理盐水：称取9克氯化钠，溶解在蒸馏水中，定容到1 L。 9.0.25M蔗糖溶液：称取蔗糖85.5 g，加入蒸馏水，溶解，定容至1 L。 10.20%次氯酸钠溶液。 【实验步骤】 一、动物肝脏线粒体的分离 1.制备肝细胞匀浆：取动物肝脏，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水分，称取 肝组织 1 g，剪碎；用预冷的 0.25M蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加 9 ml预冷的 0.25M 蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在 0℃~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝组织制成匀浆。 2. 取匀浆液 1.5 ml 于 1.5 ml 的 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 2500 rpm 离心 10 min。 3.取 1.0 ml 上清转入新 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 10 000 rpm 离心 10 min，弃 上清，得到沉淀即为线粒体。 4.加入预冷的 0.25M 蔗糖溶液 1.5 ml，摇匀洗涤后，10 000 rpm 离心 5 min，弃上清。 重复两次。 10