5.最后得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加1滴1/5000詹纳斯绿B溶液。 垫鱼10min。 6.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见线 粒体被染成蓝绿色，呈球形、小棒状或哑铃状。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻：尽可能充分玻碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 二、植物线粒体的分离制备 1,玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30mim,再用清水浸泡 12“催芽。然后将种子均匀铺放在发芽盒中，覆盖一层湿润的沙子，保持湿度，置于温箱 28℃暗培养35d,得到黄化苗。 2.取黄化苗样品1g,加入3ml预冷的线粒体分离介质，在瓷研体内快速研磨匀浆。 3.取匀浆液1.5ml于1.5ml的EP管中，置于冷冻离心机中，以2500pm离心10min 4.取1.0ml上清转入新EP管中，置于冷冻离心机中，以10000rpm离心10min, 弃上清，得到沉淀即为线粒体。 5.加入预冷的线粒体分离介质1.5ml,摇匀洗涤后，10000pm离心5min,弃上清 6.将得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加1滴1V5000詹纳斯绿B溶液， 染色10min。 7.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见 线粒体被染成蓝绿色，呈圆形颗粒。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻：尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 【实验结果与思考题】 1.描述两种线粒体装片的观察结果，根据你的实验结果，你认为所分离的线粒体的纯 度如何？ 2.线粒体提取分离过程中，为什么要在0~4℃进行？ 3.要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问 题？ 5.最后得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加 1 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液， 染色 10 min。 6.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见线 粒体被染成蓝绿色，呈球形、小棒状或哑铃状。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 二、植物线粒体的分离制备 1. 玉米种子用 20%次氯酸钠溶液浸泡 10 min 消毒，清水冲洗 30min，再用清水浸泡 12 hr 催芽。然后将种子均匀铺放在发芽盒中，覆盖一层湿润的沙子，保持湿度，置于温箱 28℃暗培养 3~5 d，得到黄化苗。 2. 取黄化苗样品 1 g，加入 3 ml 预冷的线粒体分离介质，在瓷研钵内快速研磨匀浆。 3. 取匀浆液 1.5 ml 于 1.5 ml 的 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 2500 rpm 离心 10 min。 4. 取 1.0 ml 上清转入新 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 10 000 rpm 离心 10 min， 弃上清，得到沉淀即为线粒体。 5. 加入预冷的线粒体分离介质 1.5 ml，摇匀洗涤后，10 000 rpm 离心 5 min，弃上清。 6. 将得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加 1 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液， 染色 10 min。 7. 加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见 线粒体被染成蓝绿色，呈圆形颗粒。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 【实验结果与思考题】 1. 描述两种线粒体装片的观察结果，根据你的实验结果，你认为所分离的线粒体的纯 度如何? 2. 线粒体提取分离过程中，为什么要在 0～4℃进行？ 3. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问 题？ 11