实验二十一超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低 及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或 衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂 过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子 团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O2)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROD)烷氧自由基(RO) 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧 化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸(Vc)、VE 和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和 O2、H2O2、OH和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOD后,立刻引起科学界的高度重视,近40年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用 领域日益拓宽,SOD也有了产品。二十世纪80年代后期,我国关于SOD的研究及应用也形成了热点,如今 已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果 超氧自由基(O2)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分 子、原子、原子团或离子,化学性质非常活泼,是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时,机体就 会受到各种损伤。超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase),简称SOD,能通过歧化反应清除生物细胞中的超 氧自由基(O2-),生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机 体的毒害 、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力的方法和原理,并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn-SOD和CuZn-SOD,它们都催化下列反 应 由于超氧自由基(O2ˉ)为不稳定自由基,寿命极短,测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色 反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-,当加入NBT后,在光照条件下 与超氧自由基反应生成单甲謄(黄色),继而还原生成二甲,它是一种蓝色物质,在560mm波长下有最大吸 收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使蓝色二 甲月生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560m波长下各液光密度 值,抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比,以酶液加入量为横坐标,以抑制NBT光还原 相对百分率为纵坐标,在坐标纸上绘制出二者相关曲线,根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。实验二十一 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低 及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或 衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂 过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子 团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2 .－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO） 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧 化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE 和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT 等活性氧清除剂的含量水平和 O2 .－、H2O2、OH. 和 O2 等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自 1968 年发现 SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近 40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用 领域日益拓宽，SOD 也有了产品。二十世纪 80 年代后期，我国关于 SOD 的研究及应用也形成了热点，如今 已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 超氧自由基（O2 .－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分 子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就 会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称 SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超 氧自由基（O2 .－），生成 H2O2 和 O2。H2O2 由过氧化氢酶（CAT）催化生成 H2O 和 O2，从而减少自由基对有机 体的毒害。 一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定 SOD 活力的方法和原理，并了解 SOD 的作用特性。 二、原理 SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD：Mn－SOD 和 Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反 应： 由于超氧自由基（O2 .－）为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色 反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子 O2 .－，当加入 NBT 后，在光照条件下， 与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在 560nm 波长下有最大吸 收。当加入 SOD 时，可以使超氧自由基与 H+结合生成 H2O2和 O2，从而抑制了 NBT 光还原的进行，使蓝色二 甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的 SOD 酶液，光照一定时间后测定 560nm 波长下各液光密度 值，抑制 NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制 NBT 光还原 相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据 SOD 抑制 NBT 光还原相对百分率计算酶活性