实验二十一超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化,如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低 及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明,植物在逆境胁迫或 衰老过程中,细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂 过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子 团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基(O2)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROD)烷氧自由基(RO) 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧 化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸(Vc)、VE 和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和 O2、H2O2、OH和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOD后,立刻引起科学界的高度重视,近40年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用 领域日益拓宽,SOD也有了产品。二十世纪80年代后期,我国关于SOD的研究及应用也形成了热点,如今 已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果 超氧自由基(O2)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分 子、原子、原子团或离子,化学性质非常活泼,是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时,机体就 会受到各种损伤。超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase),简称SOD,能通过歧化反应清除生物细胞中的超 氧自由基(O2-),生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O和O2,从而减少自由基对有机 体的毒害 、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力的方法和原理,并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn-SOD和CuZn-SOD,它们都催化下列反 应 由于超氧自由基(O2ˉ)为不稳定自由基,寿命极短,测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色 反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-,当加入NBT后,在光照条件下 与超氧自由基反应生成单甲謄(黄色),继而还原生成二甲,它是一种蓝色物质,在560mm波长下有最大吸 收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使蓝色二 甲月生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560m波长下各液光密度 值,抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比,以酶液加入量为横坐标,以抑制NBT光还原 相对百分率为纵坐标,在坐标纸上绘制出二者相关曲线,根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性
实验二十一 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低 及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或 衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂 过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子 团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2 .－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO） 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧 化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE 和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT 等活性氧清除剂的含量水平和 O2 .－、H2O2、OH. 和 O2 等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自 1968 年发现 SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近 40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用 领域日益拓宽，SOD 也有了产品。二十世纪 80 年代后期，我国关于 SOD 的研究及应用也形成了热点，如今 已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 超氧自由基（O2 .－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分 子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就 会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称 SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超 氧自由基（O2 .－），生成 H2O2 和 O2。H2O2 由过氧化氢酶（CAT）催化生成 H2O 和 O2，从而减少自由基对有机 体的毒害。 一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定 SOD 活力的方法和原理，并了解 SOD 的作用特性。 二、原理 SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD：Mn－SOD 和 Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反 应： 由于超氧自由基（O2 .－）为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色 反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子 O2 .－，当加入 NBT 后，在光照条件下， 与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在 560nm 波长下有最大吸 收。当加入 SOD 时，可以使超氧自由基与 H+结合生成 H2O2和 O2，从而抑制了 NBT 光还原的进行，使蓝色二 甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的 SOD 酶液，光照一定时间后测定 560nm 波长下各液光密度 值，抑制 NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制 NBT 光还原 相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据 SOD 抑制 NBT 光还原相对百分率计算酶活性
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时的酶量作为一个酶活力单位(U) 实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2.主要仪器 (1)722型或其他型号的可见分光光度计 (2)万分之一分析天平 (3)高速冷冻离心机 (4)冰箱 (5)光照箱:4500Lux (6)带盖瓷盘1个/处理 (7)移液管架 (8)研钵 (9)离心管5mL数个 (10)微烧杯10~15mL8个/处理 (11)移液管或加样器0.5mL×4;1mL×2;2mL×2;5mL×1 (12)微量进样器50μL×2;100uL×2 (13)烧杯50mL×3:100mL×5:500mL×1:1000mL×2 (14)量筒50mL×1:100mL×2 (15)容量瓶50mL×1:100mL×5;250mL×1;1000mL×2 (16)细口瓶125mL×5
找出 SOD 抑制 NBT 光还原相对百分率为 50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2．主要仪器 （1）722 型或其他型号的可见分光光度计 （2）万分之一分析天平 （3）高速冷冻离心机 （4）冰箱 （5）光照箱：4 500Lux （6）带盖瓷盘 1 个/处理 （7）移液管架 （8）研钵 （9）离心管 5mL 数个 （10）微烧杯 10～15mL 8 个/处理 （11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1 （12）微量进样器 50μL×2；100μL×2 （13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2 （14）量筒 50mL×1；100mL×2 （15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2 （16）细口瓶 125mL×5
3.试剂 (1)0.1mol/LpH78磷酸钠( NazHPO- NaH,PO4)缓冲液 A液(0. mol/L NazHPO4溶液):准确称取 NazHPO412H2O(MW=35814)35814g于100mL小烧杯中 用少量蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用 B液(0.1mol/LNaH2PO4溶液):淮准确称取 NamPo42H2O(MW=156.01)0.780g于50mL小烧杯中,用 少量蒸馏水溶解后,移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为 0. 1 mol/L pH78的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 (2)0.026molL蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸(CsH1NO2S,MW=14921)0.3879g于100mL小烧杯中,用少量0 I mol/L pH7.8的磷 酸钠缓冲液溶解后,移λ100mL容量瓶中并用θ. I mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度,充分混匀(现用 现配)。4℃冰箱中保存可用1~2d。 (3)75×10-4mo/LNBT溶液 准确称取NBr(COH3OClN10O6,Mw=817.7)0.1533g于100mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,移入 250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀(现配现用)。4℃冰箱中保存可用2~3d (4)含1.0 umol/LEDTA的2×105moL核黄素溶液 A液:准确称取EDIA(Mw=292)0.00292g于5omL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解 B液:准确称取核黄素(Mw=376.36)0.0753g于50mL小烧杯中,用少量蒸馏水溶解。 C液:合并A液和B液,移λl00mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,此溶液为含0. 1mMol/L edta的 2 mmol/L核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8~ld。该溶液应避光保存,即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好, 置于4℃冰箱中保存 当测定SOD酶活时,将C液稀释100倍,即为含10μ MoI/EDTA的2×10-5moL核黄素溶液 (5)0.05mo/LpH78磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/L pH78的磷酸钠缓冲液5omL,移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰 箱中保存备用
3．试剂 （1）0.1 mol/L pH7.8 磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A 液（0.1 mol/L Na2HPO4 溶液）：准确称取 Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g 于 100mL 小烧杯中， 用少量蒸馏水溶解后，移入 100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B 液（0.1 mol/L NaH2PO4 溶液）：准确称取 NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g 于 50mL 小烧杯中，用 少量蒸馏水溶解后，移入 50mL 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述 A 液 183mL 与 B 液 17mL 充分混匀后即为 0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 准确称取 L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g 于 100mL 小烧杯中，用少量 0.1 mol/L pH7.8 的磷 酸钠缓冲液溶解后，移入 100mL 容量瓶中并用 0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用 现配）。4℃冰箱中保存可用 1～2d。 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT 溶液 准确称取 NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g 于 100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 250mL 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用 2～3d。 （4）含 1.0μmol/L EDTA 的 2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液 A 液：准确称取 EDTA（MW=292）0.00292g 于 50mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B 液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g 于 50mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 C 液：合并 A 液和 B 液，移入 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含 0.1mmol/L EDTA 的 2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用 8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好， 置于 4℃冰箱中保存。 当测定 SOD 酶活时，将 C 液稀释 100 倍，即为含 1.0μmol/L EDTA 的 2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。 （5）0.05 mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液 取 0.1 mol/L pH7.8 的磷酸钠缓冲液 50mL，移入 100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰 箱中保存备用
(6)石英砂。 四、操作方法和步骤 1.酶液的制备 按每克鲜叶加入3mLo.05 mol/L pH78磷酸钠缓冲液,加入少量石英砂,于冰浴中的硏钵内硏磨成匀浆 定容到5mL刻度离心管中,于8500r/min(10000g)冷冻离心30min,上清液即为SOD酶粗提液。 2.酶活力的测定 每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号,按表1加入各试剂及酶液,反应系统总体积为3mL。其中4 8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整(如酶液浓度大、活性强时, 酶用量适当减少)。 各试剂全部加入后,充分混匀,取1号微烧杯置于暗处,作为空白对照,比色时调零用。其余7个微烧杯 均放在温度为25℃,光强为4500Lux的光照箱内(安装有3根20W的日光灯管)照光15min,然后立即遮光 终止反应。在560m波长下以1号杯液调零,测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值 作为抑制NBT光还原率100%,根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光 还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标,以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标,作出二者相关曲线。找 出50%抑制率的酶液量(μL)作为一个酶活力单位(U) 表1反应系统中各试剂及酶液的加入量(mL) 试剂(5) 试剂(2) 试剂(3) 酶液 试剂(4) 0.9 0.3 0.3 0.10 7 0.3 .3 3
（6）石英砂。 四、操作方法和步骤 1．酶液的制备 按每克鲜叶加入 3mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆， 定容到 5mL 刻度离心管中，于 8 500 r/min（10 000g）冷冻离心 30min，上清液即为 SOD 酶粗提液。 2．酶活力的测定 每个处理取 8 个洗净干燥好的微烧杯编号，按表 1 加入各试剂及酶液，反应系统总体积为 3mL。其中 4～ 8 号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时， 酶用量适当减少）。 各试剂全部加入后，充分混匀，取 1 号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余 7 个微烧杯 均放在温度为 25℃，光强为 4 500Lux 的光照箱内（安装有 3 根 20W 的日光灯管）照光 15min，然后立即遮光 终止反应。在 560nm 波长下以 1 号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以 2、3 号杯液光密度的平均值 作为抑制 NBT 光还原率 100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制 NBT 光 还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制 NBT 光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找 出 50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。 表 1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂 杯 号 试剂（5） 试剂（2） 试剂（3） 酶 液 试剂（4） 1 0.9 1.5 0.3 0 0.3 2 0.9 1.5 0.3 0 0.3 3 0.9 1.5 0.3 0 0.3 4 0.85 1.5 0.3 0.05 0.3 5 0.80 1.5 0.3 0.10 0.3 6 0.75 1.5 0.3 0.15 0.3 7 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 8 0.65 1.5 0.3 0.25 0.3
五、结果计算 1.560nm波长下各杯液的光密度(表2) 表2测定数据列表 杯号 345678 号 平 酶液量(mL) 0000.050.100.150.200.25 光密度(ODs60n <td style="BORDER-RIGHT: medium PADDING-RIGHT 5.4pt BORDER-TOP meaium PADDING-LEFT PADDING-BOTTOM. Ocm BORDER-LEFT: medium none: WIDTH 864pt PADDING-TOP BORDER-BOTTOM: windowtext 0.5pt solid"vAlign=te
五、结果计算 1．560nm 波长下各杯液的光密度（表 2） 表 2 测定数据列表 杯 号 1 2 3 4 5 6 7 8 2、3 号 平 均 值 酶液量（mL） 0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 — 光密度（OD560nm） 0 <TD style="BORDER-RIGHT: medium none; PADDING-RIGHT: 5.4pt; BORDER-TOP: medium none; PADDING-LEFT: 5.4pt; PADDING-BOTTOM: 0cm; BORDER-LEFT: medium none; WIDTH: 86.4pt; PADDING-TOP: 0cm; BORDER-BOTTOM: windowtext 0.5pt solid" vAlign=to