第四节基因工程 微生物育种的发展史: 初级阶段:生产选种和初级的定向选育 物理因素诱变育种 ◆化学诱变育种 杂交育种 基因工程
第四节 基因工程 微生物育种的发展史： ◆ 初级阶段：生产选种和初级的定向选育 ◆ 物理因素诱变育种 ◆ 化学诱变育种 ◆ 杂交育种 ◆ 基因工程
基因工程的定义 ●基因工程( genetic engineering):在基因水平上的遗传工 程。利用分子生物学的理论和技术,自觉设计、操纵、改造 和重建细胞的遗传核心一基因组,使生物体的遗传性状发 生定向变异,以满足于人类的需要 ●基因工程是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质 DNA大分子提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进 行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与 载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源 遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从 而获得新物种的一种崭新的育种技术。 ●基因工程育种的特点:体外重组性;远缘杂交性;定向性
一、基因工程的定义 ⚫ 基因工程（genetic engineering） ：在基因水平上的遗传工 程。利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造 和重建细胞的遗传核心 — 基因组，使生物体的遗传性状发 生定向变异，以满足于人类的需要。 ⚫ 基因工程是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质 －DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进 行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与 载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源 遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从 而获得新物种的一种崭新的育种技术。 ⚫ 基因工程育种的特点：体外重组性；远缘杂交性；定向性
二、基因工程的基本操作 ●目的基因的取得; ●载体的选择; ●目的基因与载体DNA的体外重; ●重组载体引入受体细胞 ●重组受体细跑的筛选和鉴定; 工程菌”或“工程细胞”的大规模培养
二、基因工程的基本操作 ⚫ 目的基因的取得； ⚫ 载体的选择； ⚫ 目的基因与载体DNA的体外重； ⚫ 重组载体引入受体细胞； ⚫ 重组受体细胞的筛选和鉴定； ⚫ “工程菌”或“工程细胞”的大规模培养
1.目的基因的取得 1.黻体系统 2.供体系统 一般有三条途径:①从适当大顾粒 的供体细胞(各种动物、植 rmmmmmyhif dnarmmmmm 物赵微生物均可)的nNA由 内切核酸酶 分2、载体的选择 内切核酸酶 (EcoRD Su(EcoRD TTAA TTAA 3、目的基因与载体 AAT DN4、重组载体引入受 体细胞 处理目前使用最广泛的 可受体微生物有大肠杆菌、 然后枯草杆菌和酿酒酵母。 DNA连接酶 体D把重组载体DNA分子 重组质粒 连接引入受体细胞的方法很 重组质粒 便可多,若以重组质粒作载 过‘体时,可以用转化的手 染色体 成段如以病毒A作为( 复制(“工程菌” 染的方法。 感受态细菌 3.受体系统 基因工程的主要原理与操作步骤
1. 目的基因的取得 一般有三条途径：①从适当 的供体细胞（各种动物、植 物及微生物均可）的DNA中 分离； ②利用反转录酶的作 用由mRNA合成cDNA；③由 化学方法合成特定功能的基 因。 2、载体的选择 有了目的基因后，还必 须有符合要求的运送目 的基因的载体，以便把 它运载到受体细胞中进 行增殖和表达。 3、目的基因与载体 DNA的体外重组 用同一种限制性内切酶 处理目的基因和基因载体， 可以形成相同的粘性末端， 然后，将外源目的基因和载 体DNA混合，在添加DNA 连接酶，在一定条件下作用， 便可以使目的基因与载体经 过“退火”和连接的步骤形 成重组DNA。 4、重组载体引入受 体细胞 目前使用最广泛的 受体微生物有大肠杆菌、 枯草杆菌和酿酒酵母。 把重组载体DNA分子 引入受体细胞的方法很 多，若以重组质粒作载 体时，可以用转化的手 段；如以病毒DNA作为 重组载体时，则要用感 染的方法
三、基因工程的应用和发展前景 1、基因工程在工业上的应用 2、基因工程在农业上的应用 3、遗传工程在医疗上的应用 4、基因工程在环境保护中的应用 5、基因工程与基本理论研究
三、基因工程的应用和发展前景 1、基因工程在工业上的应用 2、基因工程在农业上的应用 3、遗传工程在医疗上的应用 4、基因工程在环境保护中的应用 5、基因工程与基本理论研究
第五节菌种的衰退、复壮和保藏 菌种的衰退与复壮 ·蘖奔名絮驯粉学发生由茭我导致 衰退的具体表现 原有的形态性状不典型了 2)生长速度变慢,产生的孢子变少 3)代谢产物的生产能力下降 4)致病菌对宿主的侵染能力下降 (5)对外界不良条件抵抗力下降 菌种衰退的原因 1)有关基因的自发突变 (2)育种后未经很好的分离纯化 (3)培养条件的改变 (4)污染杂菌
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏 一、菌种的衰退与复壮 1. 菌种衰退（degeneration of strains）：由于自发突变导致 某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 衰退的具体表现 （1）原有的形态性状不典型了 （2）生长速度变慢，产生的孢子变少 （3）代谢产物的生产能力下降 （4）致病菌对宿主的侵染能力下降 （5）对外界不良条件抵抗力下降 菌种衰退的原因 （1）有关基因的自发突变 （2）育种后未经很好的分离纯化 （3）培养条件的改变 （4）污染杂菌
衰退的防止 (1)控制传代次数:尽量避免不必要的移种和传代,并将 必要的传代降低到最低限度,以减少自发突变的几率 (2)创造良好的培养条件 (3)利用不同类型的细胞进行接种传代 (4)采用有效的菌种保藏方法
衰退的防止 （1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将 必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不同类型的细胞进行接种传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
2菌种的复壮 ●狭义复壮 在菌种已发生衰退的情况下,通过纯种分离和测定生产性能 等方法,从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体,以达 到恢复该菌原有典型性状的一种措施。 ●广义复壮 在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作,以期菌种的生产性能逐步有所提
2.菌种的复壮 ⚫ 狭义复壮 在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能 等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达 到恢复该菌原有典型性状的一种措施。 ⚫ 广义复壮 在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提 高
菌种复壮的方法 1)纯种分离法 2)通过宿主体内生长进行复壮 3)淘汰已衰退的个体 平板表血涂布法 莴落纯(“菌种纯”)平板划线分离法 琼脂培养浇汴汰 纯种分肉法 用“分离小室”进行单细胞分离 细胞纯(“菌株纯")用显微操纵器进行单细胞分离 用丝尖端切割法进行单细胞分离
菌种复壮的方法 1）纯种分离法 2）通过宿主体内生长进行复壮 3）淘汰已衰退的个体
菌种的保藏 1菌种保藏的目的 妥善保藏菌种,达到菌不死、不衰、不乱以及便于硏究、交换 和使用的目的。 2菌种保藏原理: ●优良纯种的选择(最好休眠体) 良好休眠环境的创造条件(干燥、低温、缺氧、避光、缺乏 营养、加保护剂等)不生长,少死亡,以保持遗传性,减少 变异性。菌种保藏中最主要的因素是干燥和低温(液氮 196℃、干冰-70℃)。 3选择菌种保藏方法要考虑的因素 ●菌种性状的保持;通用性;简便性;设备的普及性
二、菌种的保藏 1.菌种保藏的目的： 妥善保藏菌种，达到菌不死、不衰、不乱以及便于研究、交换 和使用的目的。 2.菌种保藏原理： ⚫ 优良纯种的选择（最好休眠体）； ⚫ 良好休眠环境的创造条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏 营养、加保护剂等）不生长，少死亡，以保持遗传性，减少 变异性。菌种保藏中最主要的因素是干燥和低温（液氮- 196℃、干冰-70℃）。 3.选择菌种保藏方法要考虑的因素 ⚫ 菌种性状的保持；通用性；简便性；设备的普及性