在660nm下测定其吸光度值 改良的快速简易法,可获得与 Folin-酚试剂法(即Lowy基本法)相接近的结果 五、考马斯亮兰法( Bradford法) )实验原理 双缩脲法( Biuret法)和 Folin-酚试剂法( Lowry法)的明显缺点和许多限制,促 使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由 Bradford建立的考马斯亮兰法( Bradford法),是根据蛋白质与染料相结 合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到 广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法 考马斯亮兰G250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置 (max),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料 主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值As9s,与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比 Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达lug。这是 因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质一染料复合物有更高的消光系 数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右 由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持 稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry法那样 费时和严格地控制时间 (3)干扰物质少。如干扰 Lowry法的K+、Nat、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDIA等均不干扰此测定法 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用y—球蛋白为标准蛋白 质,以减少这方面的偏差 (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100 十二烷基硫酸钠(SDS)和0.IN的NaOH。(如同0.IN的酸干扰 Lowry法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准 曲线来测定未知蛋白质的浓度 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液,用γ球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mgm和 0.lmg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰G—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml95% 176176 在 660nm 下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即 Lowry 基本法）相接近的结果。 五、考马斯亮兰法（Bradford 法） （一）实验原理 双缩脲法（Biuret 法）和 Folin—酚试剂法（Lowry 法）的明显缺点和许多限制，促 使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976 年由 Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford 法），是根据蛋白质与染料相结 合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到 广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置 （max），由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料 主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在 595nm 下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford 法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1g。这是 因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系 数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。 由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持 稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样 费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 —球蛋白为标准蛋白 质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、 十二烷基硫酸钠（SDS）和 0.1N 的 NaOH。（如同 0.1N 的酸干扰 Lowary 法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，而只能用标准 曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用 —球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰 G—250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G—250，溶于 50ml 95%