实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1.学习水解蛋白质的方法。 2.掌握纸层析的基本技术。 3。学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1,蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白醛，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。 叭。盐酸溶液中将蛋白质在110加热大约20 ,肽健断裂 质完 解为氨基酸 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L 氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸 解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质一一腐黑质，因 此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2.纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同 的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系 数是一个常数，若以K表示分配系数 K=质在流动相中的浓度 层析溶剂（又称推动剂）， 是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲利 力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸 重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形 成固定相：而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形 成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移 动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点入 断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的 层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R值表示： 原点到层析点中心的距离 R:=原点到溶剂前沿的距离 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R值，借此可以达到定性、鉴别的目 的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、 时间等都会影响R值。 三、仪器试剂和材料 1.仪器 (1)干燥箱 (2)水浴锅 实验六 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。 实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在 6 mo 叭。盐酸溶液中将蛋白质在 110t 加热大约 20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为 L 一 氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸 解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因 此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同 的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系 数是一个常数，若以 K 表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和 力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH 基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸 重的 22％左右（其中约有 6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形 成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形 成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移 动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不 断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的 层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以 Rf值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的 Rf 值，借此可以达到定性、鉴别的目 的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH 值、滤纸的质地以及层析的温度、 时间等都会影响 Rf值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅