称为互补( Complementary)DNA或cDNA 随着DNA合成技术的发展,目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成,即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致,但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程,用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰,也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质,如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2载体DNA 分离得到了目标基因后,基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体DNA,质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是:在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的DNA分子 载体应该具有以下性质 1)在宿主细胞中具有自我复制的能力 2)能够与各种分子量的外来DNA片段结合而又不会影响本身的复制能力 3)载体DNA经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞 4)载体DNA应该含有至少一个选择性标记,这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体DNA 的细胞; 5)对于一种或几种限制性内切酶,载体DNA上只有一个目标切点 表11.3.1常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量拷贝数|自我转移能力「表型特征 (10°da)染色体 Col质ColE1 10-18 不能大肠杆菌EI(膜的变化) Col e2 10-18 不能 [大肠杆菌EII(Dase) ColE 10-18 不能 大肠杆菌EIII(核糖体 RNase) 性质粒|F 1-2 Flac R质粒[R1o0 70 能能能 F性须( f pilus) F性须,Lac操纵子 Cml, str, sul, tet Tet, st PSC101 粒[229的20不能高贝数 pBR345[0.7 约20不能 Colel改型 除质粒外,噬菌体λ、噬菌体M3及粘粒( Cosmids或称为装配型质粒)也能用于Ecol 的基因重组。噬菌粒载体是有M13噬菌体和质粒结合而成的新型载体,它克服了M3噬菌体 克隆外源DNA的能力十分有限(小于1,500bp)的缺点,而且分子量小,易于体外操作 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表11.3.1和表11.3.2。下面将以重组 E. coli为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作,克隆了外源DNA片段(一般 不会超过15kb)后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率 质粒可以通过转化进入E.col,一个被转化的E.coli细胞只能接受一个质粒,而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞,这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的E.coli细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约 66 称为互补（Complementary）DNA 或 cDNA。 随着 DNA 合成技术的发展，目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成, 即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致，但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程，用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰，也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质，如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2 载体 DNA 分离得到了目标基因后，基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体 DNA，质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是： 在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的 DNA 分子。 载体应该具有以下性质： 1） 在宿主细胞中具有自我复制的能力； 2） 能够与各种分子量的外来 DNA 片段结合而又不会影响本身的复制能力； 3） 载体 DNA 经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞； 4） 载体 DNA 应该含有至少一个选择性标记，这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体 DNA 的细胞； 5） 对于一种或几种限制性内切酶，载体 DNA 上只有一个目标切点。 表 11.3.1 常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量 (106 dal) 拷贝数 染色体 自我转移能力 表型特征 Col 质 粒 ColE1 4.2 10-18 不能 大肠杆菌 EI(膜的变化) Col E2 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EII(Dnase) ColE3 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EIII(核糖体 RNase) 性质粒 F 62 1-2 能 F 性须(F pilus) F’lac 95 1-2 能 F 性须,Lac 操纵子 R 质粒 R100 70 1-2 能 Cmlr ,Strr ,Sulr ,Tetr R64 78 少数 能 Tetr , Strr R6K 25 12 能 Ampr , Strr PSC101 5.8 1-2 不能 Tetr 重组体 质粒 pDM500 9.8 约 20 不能 黑腹果蝇组蛋白基因 pBR322 2.9 约 20 不能 高拷贝数 pBR345 0.7 约 20 不能 ColE1 改型 除质粒外，噬菌体、噬菌体 M13 及粘粒(Cosmids 或称为装配型质粒)也能用于 E.coli 的基因重组。噬菌粒载体是有 M13 噬菌体和质粒结合而成的新型载体，它克服了 M13 噬菌体 克隆外源 DNA 的能力十分有限（小于 1,500bp）的缺点，而且分子量小，易于体外操作。一 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表 11.3.1 和表 11.3.2。下面将以重组 E. coli 为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作，克隆了外源 DNA 片段（一般 不会超过 15kb）后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数， 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率。 质粒可以通过转化进入 E. coli，一个被转化的 E. coli 细胞只能接受一个质粒，而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞，这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的 E. coli 细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约