第十一章微生物和基因工程 11.1概述 自从分子生物学家发现所有生物的遗传信息都是由DNA分子携带并发现了基因的密码 后,人们就一直致力于将分子生物学的这一划时代成果用于微生物细胞的改造,使得微生物 细胞能够结累更多的目标产物、合成新的代谢产物及转化原本不能转化的底物或有毒物质 通过科学家们的不懈努力,基因工程已经成了工业微生物菌种选育的重要手段,正在发酵工 业中发挥愈来愈大的作用。可以说工业微生物遗传育种取得的重要进展是基因工程发展的基 础之一,现在又为工业微生物的育种提供了新的、有力的工具。两者始终存在着十分密切的 依赖关系。 基因克隆是重组DNA技术的关键步骤。这里,基因定义为细胞的染色体中含有遗传信 息的基本单元。在对基因进行操纵之前,必须对DNA分子的脱氧核糖核酸顺序、各个结构单 元的功能及其相互关系有一个清楚的认识,即所谓的基因组。目前,许多微生物、植物、动 物及人类基因组计划已经完成或即将完成,怎样利用从基因组中获得的大量信息为人类服务 已经成了生物技术的重要研究内容和发展方向。但是这些基因组、特别是人类基因组太复杂, 很难讲清楚其功能和组织。因此本章将只讨论最简单的基因组为例对DNA分子的核苷序列分 析和结构基因的获得进行简要讨论 早在1978年猴子病毒SV40的DNA分子的核苷序列就已经完全清楚,它有5,243个碱基 对,这些碱基对构成了五个结构基因。限制性内切酶( Restriction endonuclease)对基因序 列分析作出了巨大的贡献,限制性内切酶是一类从细菌中分离得到的能够将DNA分子在特定 的位点进行切断的酶。限制性内切酶的功能是将一个很大的DNA分子切割成许多良好定义的 碎片,以便进一步研究。目前已经从约250种细菌中提纯出了500余种限制性内切酶。其中 典型的如从大肠杆菌得到的EORI,专门作用于 GAATTC核苷序列:又如从白色短小杆菌 ( BrevibacteriⅧ m albidum)得到的BaII则专门切断 TGGCCA核苷序列 限制性内切酶切断双股DNA分子时有如图11.1.1所示的两种方式: TGGCCA GAATTC ACCGGT CTTAAG TGG CCA AATTC ACC CTTAAG 图1.1限制性内切酶的两种切断方式:(a)平端,(b)粘性末端 1)沿对称线切断形成两个平端分子(图11.1.1a 2)在对称线附近沿对称位置切断形成两个含粘性末端( Sticky ends)的分子(图 11.11b)。这种方式都在重组DNA技术中使用 限制性内切酶的类型和主要特性列于表11.1.1,其它在重组DNA中常用的核酸酶见表 11.1.2 由于限制性内切酶所能识别的核苷序列是唯一的,因此在一个DNA分子中的切割位点 有限。被切割下来的DNA碎片的分离时需要应用一项非常有用的技术:凝胶电泳。然后就能 进一步研究每个DNA碎片的结构和功能。利用不同的限制性内切酶反复进行上述过程,就能
1 第十一章 微生物和基因工程 11.1 概述 自从分子生物学家发现所有生物的遗传信息都是由 DNA 分子携带并发现了基因的密码 后，人们就一直致力于将分子生物学的这一划时代成果用于微生物细胞的改造，使得微生物 细胞能够结累更多的目标产物、合成新的代谢产物及转化原本不能转化的底物或有毒物质。 通过科学家们的不懈努力，基因工程已经成了工业微生物菌种选育的重要手段，正在发酵工 业中发挥愈来愈大的作用。可以说工业微生物遗传育种取得的重要进展是基因工程发展的基 础之一，现在又为工业微生物的育种提供了新的、有力的工具。两者始终存在着十分密切的 依赖关系。 基因克隆是重组 DNA 技术的关键步骤。这里，基因定义为细胞的染色体中含有遗传信 息的基本单元。在对基因进行操纵之前，必须对 DNA 分子的脱氧核糖核酸顺序、各个结构单 元的功能及其相互关系有一个清楚的认识，即所谓的基因组。目前，许多微生物、植物、动 物及人类基因组计划已经完成或即将完成，怎样利用从基因组中获得的大量信息为人类服务 已经成了生物技术的重要研究内容和发展方向。但是这些基因组、特别是人类基因组太复杂， 很难讲清楚其功能和组织。因此本章将只讨论最简单的基因组为例对 DNA 分子的核苷序列分 析和结构基因的获得进行简要讨论。 早在 1978 年猴子病毒 SV40 的 DNA 分子的核苷序列就已经完全清楚，它有 5,243 个碱基 对，这些碱基对构成了五个结构基因。限制性内切酶(Restriction endonuclease)对基因序 列分析作出了巨大的贡献，限制性内切酶是一类从细菌中分离得到的能够将 DNA 分子在特定 的位点进行切断的酶。限制性内切酶的功能是将一个很大的 DNA 分子切割成许多良好定义的 碎片，以便进一步研究。目前已经从约 250 种细菌中提纯出了 500 余种限制性内切酶。其中 典型的如从大肠杆菌得到的 EcoRI，专门作用于 GAATTC 核苷序列；又如从白色短小杆菌 (Brevibacterium albidum)得到的 BalI 则专门切断 TGGCCA 核苷序列。 限制性内切酶切断双股 DNA 分子时有如图 11.1.1 所示的两种方式: 1） 沿对称线切断形成两个平端分子（图 11.1.1a）。 2） 在对称线附近沿对称位置切断形成两个含粘性末端(Sticky ends)的分子（图 11.1.1b）。这种方式都在重组 DNA 技术中使用。 限制性内切酶的类型和主要特性列于表 11.1.1，其它在重组 DNA 中常用的核酸酶见表 11.1.2。 由于限制性内切酶所能识别的核苷序列是唯一的，因此在一个 DNA 分子中的切割位点 有限。被切割下来的 DNA 碎片的分离时需要应用一项非常有用的技术：凝胶电泳。然后就能 进一步研究每个 DNA 碎片的结构和功能。利用不同的限制性内切酶反复进行上述过程，就能 T G G C C A G A A T T C A C C G G T C T T A A G T G G C C A G A A T T C A C C G G T C T T A A G (a) (b) 图 11.1.1 限制性内切酶的两种切断方式：(a)平端，(b)粘性末端
够最终确定DNA分子的核苷序列和鉴别它所包含的结构基因。现在已经有了全自动DNA测序 仪,利用这类仪器可以大大提高核苷序列分析的速度。此外现在已经建立了各种基因库,将 分析得到基因核苷序列与基因库中已知结构基因的核苷序列进行比较就能够确定该基因是 那一种结构基因或者是新发现的基因。 表11.1.1核酸内切限制酶的类型和主要特性 识别序列 同裂酶 同尾酶 切割位点数目 λSv40|pBR322 Aval C√ PyCGPu 80 BamHI GGATCC BstI Bcll, BglII, Mbol,5 1 Sau3A. Holi BclI TlGATCA BamHI, BglII, Mbol, 7 10 Sau3a. Holi BgIII ALGATC BamHI,BclIl, Mbol, 6 Sau3A, holi Clal AT LCGAT Accl, Acyl, AsIL, 150 Hpall, taql ECoRI EcoRII JCC(A/C)GG Atul, ApyI >35166 Haelll cIcC BspRI, SurI >5019 Hgal GACGC (N) >50|0 11 TGCG(N)10 FnudIIl, HinPI HincIi TPy HindII Hind GTPyPuAC HincII, HinJCI 2 HindIIIAAGCTT 6 HinfI GVANTC FueL >5010 10 Hpal GTT AAC 134 0 Hpall CVCO GG Haply, mol Accl, Acyl, AsulI >504 12 Clal, taql HphI GTGA(N) >504 ↓ CCACT(N) KpnI gGTACLC BamHI, Bcll, BglIl, 21 0 KholI Mbol IDpnI, Sau3AI 508 PstI CTGCAG I SalPI, SfII 1821 Pull CAGVCTG 153 SacII CcCG CscI. SstII >25 Sall GVTCGAC HgiCIII,HgiDIIAval,XhoI 100 Sau3A CATO ChoI BamHI, Bcll, BglIl, >508 22 bol, Holi CCCVGGG Xmal 0 0 gagCtJO Sact 2|0 0 bal TVCTAGA 0 Khol C√ TCGAG I Blul, PaeR7I Aval, Sall 10 ClCCGGG Aval 000
2 够最终确定 DNA 分子的核苷序列和鉴别它所包含的结构基因。现在已经有了全自动 DNA 测序 仪，利用这类仪器可以大大提高核苷序列分析的速度。此外现在已经建立了各种基因库，将 分析得到基因核苷序列与基因库中已知结构基因的核苷序列进行比较就能够确定该基因是 那一种结构基因或者是新发现的基因。 表 11.1.1 核酸内切限制酶的类型和主要特性 酶 识别序列 同裂酶 同尾酶 切割位点数目 SV40 pBR322 Aval CPyCGPuG SalI,XhoI,XmaI 8 0 1 BamHI GGATCC BstI BclI,BglII,MboI, Sau3A,XhoII 5 1 1 BclI TGATCA BamHI,BglII,MboI, Sau3A,XhoII 7 1 0 BglII AGATCT BamHI,BclII,MboI, Sau3A,XhoII 6 0 0 ClaI ATCGAT AccI,AcyI,AsYII, HpaII,TaqI 15 0 1 EcoRI GAATTC 5 1 1 EcoRII CC(A/C)GG AtuI,ApyI >35 16 6 HaeIII GCCC BspRI,BsuRI >50 19 22 HgaI GACGC(N)5 CTGCG(N)10 >50 0 11 HhaI GCGC FnuDIII,HinPI >50 2 31 HincII CTPyPuAC HindII 34 7 2 HindII GTPyPuAC HincII,HinJCI 34 7 2 HindIII AAGCTT HsuI 6 6 1 HinfI GANTC FnuAI >50 10 10 HpaI GTTAAC 13 4 0 HpaII CCGG HapII,MnoI AccI,AcyI,AsuII, ClaI,TaqI >50 4 12 HphI GGTGA(N)6 CCACT(N)7 >50 4 12 KpnI GGTACC BamHI,BclI,BglII, XhoII 2 1 0 MboI GATC DpnI,Sau3AI >50 8 22 PstI CTGCAG SalPI,SfII 18 2 1 PvuII CAGCTG 15 3 1 SacII CCGCGC CscI,SstII >25 0 0 SalI GTCGAC HgiCIII,HgiDII AvaI,XhoI 1 0 0 Sau3A GATC MhoI BamHI,BclI,BglII, boI,XhoII >50 8 22 SmaI CCCGGG XmaI 3 0 0 SstI GAGCTC SacI 2 0 0 XbaI TCTAGA 1 0 0 XhoI CTCGAG BluI,PaeR7I AvaI,SalI 1 0 0 XmaI CCCGGG SmaI AvaI 3 0 0
表11.1.2重组DNA常用的核酸藤 核酸藤名称 主要功能 ⅡI型核酸内切限制酶「在特异性碱基序列部位切割DNA分子 DNA连接酶 将两条DNA分子或片段连接成一个DNA分 大肠杆菌DN聚合酶I通过向3’-端逐一增加核苷酸,填补 反(逆)转录酶 多核苷酸激酶 把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-0H末端 末端转移酶 将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3-0H末端 核酸外切酶III 从一条DNA链的3-端移去核苷酸残基 D核酸外切酶 自双链DNA分子的5-端移走单核苷酸,暴露出延伸的单链3-端 或性磷酸酶 人DNA分子的5’-端或3’-端或同时从5-和3’-端移去末端磷酸 S1核酸酶 将RNA和单链DMNA降解成5-单核苷酸,或切割双链核苷酸单链区 Bal31核酸酶 有单链特异的核酸内切酶特性,也有双链特异的核酸外切酶活性 Tag DNA聚合酶 在高温下一单链DNA为模板按5→3方向合成新生互补链 无论是细菌DNA还是哺乳动物的DNA,它们在结构上都是相容的,因此从一种机体得到 的DNA分子片断可以很容易地与来自另一种机体的DNA混合。这种类似性可以推广到质粒 ( Plasmids)。质粒是环状双股DNA分子,许多细菌中都有这种存在于染色体外的遗传物质 在重组DNA技术中,质粒在基因工程中的作用是作为载体DNA( Vector)。 EcoR14361Hind Ill 29 Fco57405 Aat|:286 EcoR V 185 Ban il 4 Nhe 1 229 Xmn 3963 sp BamH1 375 ph562 Hinc 1i 3907 Sca 13846 EcoN 1 622 Pyu I 373 sa651 Pst I 3609 Ase13539 Ppa I 3435 Eag I939 Nru I 972 PM/M 1 1315 smI1353 HgiE ll 3056 Eco5713002 Ava I 1425 ppm 11438 Ba144Da11447 AIwN I 2886 PpuM I 1 BspM I 1664 Pyu l 2066 Nde|2297 Tth111I2219 HgE!2295 Xca 1 2246 ACc I 2246 图11.1.2pBR322质粒酶切图谱
3 表 11.1.2 重组 DNA 常用的核酸酶 核酸酶名称 主要功能 II 型核酸内切限制酶 在特异性碱基序列部位切割 DNA 分子 DNA 连接酶 将两条 DNA 分子或片段连接成一个 DNA 分子 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 通过向 3’-端逐一增加核苷酸，填补双链 DNA 分子上的单链缺口 反（逆）转录酶 以 RNA 分子为模板合成互补的 cDNA 多核苷酸激酶 把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5’-OH 末端 末端转移酶 将同聚物尾巴加到线性双链或单链 DNA 分子的 3’-OH 末端 核酸外切酶 III 从一条 DNA 链的 3’-端移去核苷酸残基 核酸外切酶 自双链 DNA 分子的 5’-端移走单核苷酸，暴露出延伸的单链 3’-端 碱性磷酸酶 从 DNA 分子的 5’-端或 3’-端或同时从 5’-和 3’-端移去末端磷酸 S1 核酸酶 将 RNA 和单链 DNA 降解成 5’-单核苷酸，或切割双链核苷酸单链区 Bal31 核酸酶 有单链特异的核酸内切酶特性，也有双链特异的核酸外切酶活性 Tag DNA 聚合酶 在高温下一单链 DNA 为模板按 5’→3’方向合成新生互补链 无论是细菌 DNA 还是哺乳动物的 DNA，它们在结构上都是相容的，因此从一种机体得到 的 DNA 分子片断可以很容易地与来自另一种机体的 DNA 混合。这种类似性可以推广到质粒 (Plasmids)。质粒是环状双股 DNA 分子，许多细菌中都有这种存在于染色体外的遗传物质。 在重组 DNA 技术中，质粒在基因工程中的作用是作为载体 DNA(Vector)。 图 11.1.2 pBR322 质粒酶切图谱
图11.1.2所示是基因工程中广泛使用的载体DNA,pBR322。该载体有4,363个碱基对, 编码是从唯一的 EcoRI位点开始,将 GAATTC序列中的第一个T编码为1。图中显示了各种 酶切位点,其中黑体字表示唯一的酶切位点,其它则有两个酶切位点。图中还显示该质粒中 含有氨苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)两种抗性标记 基因工程微生物的构建包括如下基本步骤(图11.1.3):1)用限制性内切酶对质粒的特 定位点进行切割,形成粘性末端:2)用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源DNA分 子进行切割,两端形成与质粒上的粘性末端互补的单链;3)将切割好的质粒和基因片段混 合并通过DMA连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子;4)将重组质粒转化到 微生物细胞内。 细胞经基因工程改造后能够生产两大类产物:蛋白质和非蛋白质。微生物的DNA分子 与高等生物比要简单得多,特别是原核生物(如大肠杆菌),它们甚至没有细胞核,对外源 的质粒有很好的相容性,同时还具有培养基简单、生长速率快等优点,因此是进行基因工程 研究并应用于工业生产的首选宿主细胞 DNA 供体 载体 ○○○ 限制性酶 (1)得到所需基因,重组 基因片段 供体和载体DNA (2).将重组DNA传递入宿主细胞 (3).确认宿主细胞含有所需的重组DNA (4).基因表达并生产该基因所编码的蛋白质 图11.1.3基因工程的基本步骤:将基因从一个有机体传递到另一有机体 11.2基因传递和重排的自然机制 在微生物细胞中有一个完善的体系防止DNA的复制错误并修复受到损伤的DNA分子
4 图 11.1.2 所示是基因工程中广泛使用的载体 DNA,pBR322。该载体有 4,363 个碱基对， 编码是从唯一的 EcoRI 位点开始，将 GAATTC 序列中的第一个 T 编码为 1。图中显示了各种 酶切位点，其中黑体字表示唯一的酶切位点，其它则有两个酶切位点。图中还显示该质粒中 含有氨苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)两种抗性标记。 基因工程微生物的构建包括如下基本步骤(图 11.1.3)：1）用限制性内切酶对质粒的特 定位点进行切割，形成粘性末端；2）用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源 DNA 分 子进行切割，两端形成与质粒上的粘性末端互补的单链；3）将切割好的质粒和基因片段混 合并通过 DNA 连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子；4）将重组质粒转化到 微生物细胞内。 细胞经基因工程改造后能够生产两大类产物：蛋白质和非蛋白质。微生物的 DNA 分子 与高等生物比要简单得多，特别是原核生物（如大肠杆菌），它们甚至没有细胞核，对外源 的质粒有很好的相容性，同时还具有培养基简单、生长速率快等优点，因此是进行基因工程 研究并应用于工业生产的首选宿主细胞。 图 11.1.3 基因工程的基本步骤：将基因从一个有机体传递到另一有机体 11.2 基因传递和重排的自然机制 在微生物细胞中有一个完善的体系防止 DNA 的复制错误并修复受到损伤的 DNA 分子。 DNA DNA 供体 工 载体 克隆 限制性酶 （1）．得到所需基因，重组 基因片段 供体和载体 DNA （2）．将重组 DNA 传递入宿主细胞 （3）．确认宿主细胞含有所需的重组 DNA （4）．基因表达并生产该基因所编码的蛋白质
即使如此,在自然界中由于各种物理和化学因素的影响,如温度、pH、压力、离子强度、各 种化学物质、光及射线等,微生物细胞的基因会发生点突变、缺失突变、插入突变及抑制突 变等。这些物理和化学因素也经常用于传统的诱变育种 生态系统中共存的各种微生物之间会发生基因从一个有机体向另一个转移,使微生物 获得外源基因,第五章介绍的转化( Transformation)、转导( Transduction)和接合作用 ( Con jugation)等就能实现自然的基因重组 另一种与上述现象密切相关而且具有重要意义的现象是细胞内基因的重排,称为易位 子( Transposon)。易位子是一个或几个基因,具有从某一DNA分子“跳跃”到另一个DNA 分子、或在同一DNA分子内跳跃到另一位置的能力。易位子将其本身整合到新位置的能力与 受体DNA的同源性无关,其功能也不是为了编码蛋白质。当一个基因的两端与插入基因片段 联接时经常会出现易位子。许多易位子具有编码抗生素抗性的能力 易位子的重要功能是:1)当易位子装入一个基因中间时会诱导基因突变;2)易位子 能够将两个本来分开的基因带到一起:3)与质粒或者病毒引起的基因传递过程相结合,易 位子能够传递无关细菌之间基因的移动(例如,多抗生素抗性基因在新构建质粒中的移动)。 易位子突变是改变细胞性质非常有用的工具 上述基因传递方法虽然在自然界发生的频率不高,但是提供了将基因从一个细胞传递到另 个细胞的基本方法,也为进一步改善并发展新的基因传递过程创造了条件,是重组DNA技术 的重要基础 11.3基因工程的基本要素 基因工程是一些工具或要素的综合,至今基因工程仍没有一个非常精确的定义。一般 认为,基因工程是通过细胞外操纵DNA分子,根据预先设计的控制因素,创造出人工基因或 新的基因组合 基因工程的基本方法如图11.3.1所示,包括:分离所需要的基因、基因重组、将重组 的基因转移到宿主细胞及重组基因在宿主细胞中的增殖等步骤 11.3.1目标基因的获得 基因工程的第一步是获得所需要的目标基因。一种最直接的方法是采用鸟枪法 ( Shotgun- cloning)。应用限制性酶将供体DNA切割成许多基因片段,然后,将这些基因 片段用凝胶电泳分离后任意克隆到大量的宿主细胞中,通常需要根据目标基因的某一特性建 立一种高效的筛选方法用于鉴别含有目标基因的宿主细胞。显然这种方法的工作量很大而效 率很低,现在已经很少采用 杂交方法具有较好的专一性。首先需要化学合成与目标基因的一部分互补的基因探针, 基因探针要比基因本身短得多,但是应该有足够的长度,这样就不会与其他DNA的序列互补。 因此,在设计基因探针前,至少应该知道目标基因的部分核苷序列或该基因所编码蛋白质的 部分氨基酸序列。由于基因密码具有兼并性,很难从蛋白质的氨基酸序列推演出真正的核苷 酸序列,因此需要设计多种探针。同时还需要将供体DNA分解为基因片段并分离成为单股 DNA,这样才能够与单链的探针反应 细菌作为宿主细胞具有生长速度快、培养简单而且成本低廉的优点,因此细菌是基因 工程首选的宿主细胞。但是对于哪些具有基因内区( Intron)的真核生物基因,由于细菌细胞 内没有将基因内区切割下来的功能,也不能进行mRNA的拼接,因此具有基因内区的真核生 物基因不能直接放到细菌中,即使转移进去了也不能表达所需要的蛋白质。为此可以从基因 供体微生物的细胞质中用杂交探针方法将对应于所需基因的mRNA分离出来,然后就可以应 用逆转录酶( Reverse transcriptase)合成具有对应核苷序列的DNA分子,这种DNA分子
5 即使如此，在自然界中由于各种物理和化学因素的影响，如温度、pH、压力、离子强度、各 种化学物质、光及射线等，微生物细胞的基因会发生点突变、缺失突变、插入突变及抑制突 变等。这些物理和化学因素也经常用于传统的诱变育种 生态系统中共存的各种微生物之间会发生基因从一个有机体向另一个转移，使微生物 获得外源基因，第五章介绍的转化（Transformation）、转导（Transduction）和接合作用 （Conjugation）等就能实现自然的基因重组。 另一种与上述现象密切相关而且具有重要意义的现象是细胞内基因的重排，称为易位 子（Transposon）。易位子是一个或几个基因，具有从某一 DNA 分子 “跳跃”到另一个 DNA 分子、或在同一 DNA 分子内跳跃到另一位置的能力。易位子将其本身整合到新位置的能力与 受体 DNA 的同源性无关，其功能也不是为了编码蛋白质。当一个基因的两端与插入基因片段 联接时经常会出现易位子。许多易位子具有编码抗生素抗性的能力。 易位子的重要功能是：1）当易位子装入一个基因中间时会诱导基因突变；2）易位子 能够将两个本来分开的基因带到一起；3）与质粒或者病毒引起的基因传递过程相结合，易 位子能够传递无关细菌之间基因的移动（例如，多抗生素抗性基因在新构建质粒中的移动）。 易位子突变是改变细胞性质非常有用的工具。 上述基因传递方法虽然在自然界发生的频率不高，但是提供了将基因从一个细胞传递到另一 个细胞的基本方法，也为进一步改善并发展新的基因传递过程创造了条件，是重组 DNA 技术 的重要基础。 11.3 基因工程的基本要素 基因工程是一些工具或要素的综合，至今基因工程仍没有一个非常精确的定义。一般 认为，基因工程是通过细胞外操纵 DNA 分子，根据预先设计的控制因素，创造出人工基因或 新的基因组合。 基因工程的基本方法如图 11.3.1 所示，包括：分离所需要的基因、基因重组、将重组 的基因转移到宿主细胞及重组基因在宿主细胞中的增殖等步骤。 11.3.1 目标基因的获得 基因工程的第一步是获得所需要的目标基因。一种最直接的方法是采用鸟枪法 （Shotgun-cloning）。应用限制性酶将供体 DNA 切割成许多基因片段，然后，将这些基因 片段用凝胶电泳分离后任意克隆到大量的宿主细胞中，通常需要根据目标基因的某一特性建 立一种高效的筛选方法用于鉴别含有目标基因的宿主细胞。显然这种方法的工作量很大而效 率很低，现在已经很少采用。 杂交方法具有较好的专一性。首先需要化学合成与目标基因的一部分互补的基因探针， 基因探针要比基因本身短得多，但是应该有足够的长度，这样就不会与其他 DNA 的序列互补。 因此，在设计基因探针前，至少应该知道目标基因的部分核苷序列或该基因所编码蛋白质的 部分氨基酸序列。由于基因密码具有兼并性，很难从蛋白质的氨基酸序列推演出真正的核苷 酸序列，因此需要设计多种探针。同时还需要将供体 DNA 分解为基因片段并分离成为单股 DNA，这样才能够与单链的探针反应。 细菌作为宿主细胞具有生长速度快、培养简单而且成本低廉的优点，因此细菌是基因 工程首选的宿主细胞。但是对于哪些具有基因内区(Intron)的真核生物基因，由于细菌细胞 内没有将基因内区切割下来的功能，也不能进行 mRNA 的拼接，因此具有基因内区的真核生 物基因不能直接放到细菌中，即使转移进去了也不能表达所需要的蛋白质。为此可以从基因 供体微生物的细胞质中用杂交探针方法将对应于所需基因的 mRNA 分离出来，然后就可以应 用逆转录酶（Reverse transcriptase）合成具有对应核苷序列的 DNA 分子，这种 DNA 分子
称为互补( Complementary)DNA或cDNA 随着DNA合成技术的发展,目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成,即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致,但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程,用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰,也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质,如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2载体DNA 分离得到了目标基因后,基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体DNA,质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是:在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的DNA分子 载体应该具有以下性质 1)在宿主细胞中具有自我复制的能力 2)能够与各种分子量的外来DNA片段结合而又不会影响本身的复制能力 3)载体DNA经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞 4)载体DNA应该含有至少一个选择性标记,这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体DNA 的细胞; 5)对于一种或几种限制性内切酶,载体DNA上只有一个目标切点 表11.3.1常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量拷贝数|自我转移能力「表型特征 (10°da)染色体 Col质ColE1 10-18 不能大肠杆菌EI(膜的变化) Col e2 10-18 不能 [大肠杆菌EII(Dase) ColE 10-18 不能 大肠杆菌EIII(核糖体 RNase) 性质粒|F 1-2 Flac R质粒[R1o0 70 能能能 F性须( f pilus) F性须,Lac操纵子 Cml, str, sul, tet Tet, st PSC101 粒[229的20不能高贝数 pBR345[0.7 约20不能 Colel改型 除质粒外,噬菌体λ、噬菌体M3及粘粒( Cosmids或称为装配型质粒)也能用于Ecol 的基因重组。噬菌粒载体是有M13噬菌体和质粒结合而成的新型载体,它克服了M3噬菌体 克隆外源DNA的能力十分有限(小于1,500bp)的缺点,而且分子量小,易于体外操作 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表11.3.1和表11.3.2。下面将以重组 E. coli为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作,克隆了外源DNA片段(一般 不会超过15kb)后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率 质粒可以通过转化进入E.col,一个被转化的E.coli细胞只能接受一个质粒,而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞,这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的E.coli细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约 6
6 称为互补（Complementary）DNA 或 cDNA。 随着 DNA 合成技术的发展，目标基因也可以根据所需蛋白质的氨基酸序列完全用化学 方法合成, 即使人工合成基因的核苷酸序列与天然基因不完全一致，但是它们编码得到的蛋 白质却是完全一样的。全化学合成基因的一个重要应用领域是蛋白质工程，用于对天然蛋白 质的结构进行改性和修饰，也可以用于生产完全人工设计的蛋白质。应用蛋白质工程生产的 蛋白质将具有天然蛋白质所没有的性质，如良好的稳定性、更好的专一性和催化效率及新的 催化能力等。 11.3.2 载体 DNA 分离得到了目标基因后，基因重组的第二步就是把目标基因装配到载体 DNA，质粒就是 一种典型的载体。载体的定义是： 在细胞群体中为目标基因片段提供增殖场所的 DNA 分子。 载体应该具有以下性质： 1） 在宿主细胞中具有自我复制的能力； 2） 能够与各种分子量的外来 DNA 片段结合而又不会影响本身的复制能力； 3） 载体 DNA 经过细胞外重组后仍然能够顺利进入宿主细胞； 4） 载体 DNA 应该含有至少一个选择性标记，这样可以迅速而又可靠地筛选出含有载体 DNA 的细胞； 5） 对于一种或几种限制性内切酶，载体 DNA 上只有一个目标切点。 表 11.3.1 常用的质粒及其性质 质粒名称 分子量 (106 dal) 拷贝数 染色体 自我转移能力 表型特征 Col 质 粒 ColE1 4.2 10-18 不能 大肠杆菌 EI(膜的变化) Col E2 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EII(Dnase) ColE3 5.0 10-18 不能 大肠杆菌 EIII(核糖体 RNase) 性质粒 F 62 1-2 能 F 性须(F pilus) F’lac 95 1-2 能 F 性须,Lac 操纵子 R 质粒 R100 70 1-2 能 Cmlr ,Strr ,Sulr ,Tetr R64 78 少数 能 Tetr , Strr R6K 25 12 能 Ampr , Strr PSC101 5.8 1-2 不能 Tetr 重组体 质粒 pDM500 9.8 约 20 不能 黑腹果蝇组蛋白基因 pBR322 2.9 约 20 不能 高拷贝数 pBR345 0.7 约 20 不能 ColE1 改型 除质粒外，噬菌体、噬菌体 M13 及粘粒(Cosmids 或称为装配型质粒)也能用于 E.coli 的基因重组。噬菌粒载体是有 M13 噬菌体和质粒结合而成的新型载体，它克服了 M13 噬菌体 克隆外源 DNA 的能力十分有限（小于 1,500bp）的缺点，而且分子量小，易于体外操作。一 些基因工程常用的质粒和噬菌体列于表 11.3.1 和表 11.3.2。下面将以重组 E. coli 为例介 绍质粒的结构。 质粒的分子量以小一些为宜。小分子量的质粒有利于操作，克隆了外源 DNA 片段（一般 不会超过 15kb）后仍可有效地转化到宿主细胞。小分子量的质粒一般具有较高的拷贝数， 而且降低了限制性内切酶具有多重识别位点的机率。 质粒可以通过转化进入 E. coli，一个被转化的 E. coli 细胞只能接受一个质粒，而我 们需要的是含有大量相同质粒的细胞，这样就能利用大量的目标基因合成蛋白质。因此质粒 必须能够在生长中的 E. coli 细胞中增殖。为此在质粒的设计中必须插入一个含有大约
600bp长度的核苷酸片段的复制源区或称为复制起点( Origin of replication),该源区的 作用是控制细胞内质粒的复制和调节质粒的拷贝数,使胞内的质粒拷贝数保持在适当的水 平。对于E.coli而言,拷贝数在25-250的范围内比较适当。在某些情况下,会产生温度 敏感的突变株,当温度改变时会引起质粒的过量复制,使质粒拷贝数不断增加直至细胞死亡。 表11.31常用的噬菌体及其性质 噬菌体λ 载体名称 载体类型 克隆位点 克隆能力(kb)重组体的识别 插入型载体 0-10.1 NM641 插入型载体 EcoRI 0-9.7 清亮噬菌斑 Cheron 4 替换型载体 7.9-18.8 EMbL 3 替换型载体 BamHI 10.4-20.1 gtWES、1T5-622替换型载体 2.4-13.3 对Colb不敏感 入1059 BamHI 8.0-21.0 粘粒载体 「载体名称复制子分子量「选择记号 克隆位点 T克隆能力 (kb) pBI Amp, Kan BamHI, Clal,EcoRI, HindIII,32-45 PstI smal pHC79 pMBI6. Amp, Tet BamHI, Clal, EcoRl, HindIII,29-46 PstI sma l pHS262 BamHl, ecoRl. HindI olE115.8 I BamHI, EcoRI, BglII, SalI21-37 ColEl| 5.4 BamhI, hindiii. sali 1-47 MuA-10 pMBI. Tet EcoRI Ball, pyul, pvull 噬菌粒载体 菡粒质粒。单链噬菌体『辅助嗽菌体「大肠杆崮寄主菌株 pUC8 71/18 pRSAlO1 M13变异株 XS127,XS101 pUC118/pUC119 pUC18/pUC19 M13 M13KO7 MV1184 M13KO7 -l-Blue Lac:不能合成半乳糖苷酶;Bio:不能合成生物素;Spiˉ:对P噬菌粒的抑制作用呈抗性 Amp:氨苄青霉素抗性;Kan:卡那霉素抗性Tet:四环素抗性. 质粒中必须含有选择性标记。最常用的是含有抗生素抗性标记,这样只要将基因工程 细胞放到含有一定浓度抗生素的培养基中培养,就只有含质粒细胞才能生长,而无质粒的细 胞将被抗生素杀死。这种方法既能正确、快捷地筛选出含质粒细胞,加速实验室硏究的进程, 又能够在基因工程菌的大规模培养中使用。只要在培养基中加入一定浓度的抗生素就能够始 终保持只有含质粒细胞才能生长。选择性标记的另一种方法是筛选出营养缺陷型的宿主细 胞,使宿主细胞只能在添加了该细胞生长所必需的某种物质的培养基中才能生长,而在重组 的质粒中则包含产生该酶的基因,使得质粒所表达的酶能够弥补营养缺陷型宿主细胞不能合 成该种酶的缺陷,因此含质粒细胞可以在不加该酶的培养基中生长,无质粒细胞则不能 如果基因工程菌的目标产品是蛋白质,蛋白质的产量与质粒的拷贝数有关,但是两者 并不一定严格成正比关系,例如,当质粒的拷贝数从25增加到50时,蛋白质产量可能会增 加一倍,如拷贝数进一步增加到100,蛋白质的增加量就不到一倍了。有些质粒属于低拷贝 数质粒,因为在细胞分裂前质粒DNA只能复制12次,每个细胞中就只有几个质粒。有些是 松弛型质粒,质粒DNA可以重复复制只止达到适当的拷贝数,细胞内的质粒数可以达到
7 600bp 长度的核苷酸片段的复制源区或称为复制起点（Origin of replication），该源区的 作用是控制细胞内质粒的复制和调节质粒的拷贝数，使胞内的质粒拷贝数保持在适当的水 平。对于 E. coli 而言，拷贝数在 25-250 的范围内比较适当。在某些情况下，会产生温度 敏感的突变株，当温度改变时会引起质粒的过量复制，使质粒拷贝数不断增加直至细胞死亡。 表 11.3.1 常用的噬菌体及其性质 噬菌体 载体名称 载体类型 克隆位点 克隆能力(kb) 重组体的识别 BV2 插入型载体 BamHI 0-10.1 No NM641 插入型载体 EcoRI 0- 9.7 清亮噬菌斑 Cheron 4 替换型载体 EcoRI 7.9-18.8 Lac - ,Bio- EMBL 3 替换型载体 BamHI 10.4-20.1 Spi- gtWES.T5-622 替换型载体 EcoRI 2.4-13.3 对 ColIb 不敏感 1059 替换型载体 BamHI 8.0-21.0 Spi- 粘粒载体 载体名称 复制子 分子量 (kb) 选择记号 克隆位点 克隆能力 (kb) c2XB pMBI 6.8 Ampr ,Kanr BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII, PstI,SmaI 32-45 pHC79 pMBI 6.4 Ampr ,Tetr BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII, PstI,SmaI 29-46 pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI,EcoRI,HindII 34-50 pJC74 ColE1 15.8 Ampr BamHI,EcoRI,BglII,SalI 21-37 pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31-47 MuA-10 pMBI 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuII 32-48 噬菌粒载体 噬菌粒 质粒 单链噬菌体 辅助噬菌体 大肠杆菌寄主菌株 pMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 VX M13 M13 变异株 XS127,XS101 pUC118/pUC119 pUC18/pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL-1-Blue Lac- :不能合成半乳糖苷酶;Bio- :不能合成生物素;Spi- :对 P2 噬菌粒的抑制作用呈抗性. Amp r :氨苄青霉素抗性;Kanr :卡那霉素抗性 Tetr :四环素抗性. 质粒中必须含有选择性标记。最常用的是含有抗生素抗性标记，这样只要将基因工程 细胞放到含有一定浓度抗生素的培养基中培养，就只有含质粒细胞才能生长，而无质粒的细 胞将被抗生素杀死。这种方法既能正确、快捷地筛选出含质粒细胞，加速实验室研究的进程， 又能够在基因工程菌的大规模培养中使用。只要在培养基中加入一定浓度的抗生素就能够始 终保持只有含质粒细胞才能生长。选择性标记的另一种方法是筛选出营养缺陷型的宿主细 胞，使宿主细胞只能在添加了该细胞生长所必需的某种物质的培养基中才能生长，而在重组 的质粒中则包含产生该酶的基因，使得质粒所表达的酶能够弥补营养缺陷型宿主细胞不能合 成该种酶的缺陷，因此含质粒细胞可以在不加该酶的培养基中生长，无质粒细胞则不能。 如果基因工程菌的目标产品是蛋白质，蛋白质的产量与质粒的拷贝数有关，但是两者 并不一定严格成正比关系，例如，当质粒的拷贝数从 25 增加到 50 时，蛋白质产量可能会增 加一倍，如拷贝数进一步增加到 100，蛋白质的增加量就不到一倍了。有些质粒属于低拷贝 数质粒，因为在细胞分裂前质粒 DNA 只能复制 1-2 次，每个细胞中就只有几个质粒。有些是 松弛型质粒，质粒 DNA 可以重复复制只止达到适当的拷贝数，细胞内的质粒数可以达到
10-100个。松弛型质粒更适宜于作为载体DNA。 穿梭质粒载体( Shuttle plasmid vector)是指一类由人工构建的具有两种不同复制起 点和选择标记,因而可以在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体能够 携带着外源DNA序列在不同物种的细胞之间,特别是在原核和真核细胞之间往返穿梭,因此 在基因工程的研究工作中十分有用。常见的穿梭质粒载体有用于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿 梭质粒载体(如pⅣV14和pEBl10)、用于大肠杆菌-酵母穿梭质粒载体(由大肠杆菌的质粒与 酵母的Yip,Yrp,Ycp的Yep质粒构成)和大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体等。利用穿梭质 粒载体,能够方便地在大肠杄菌中进行重组DNA操作和増殖,然后再返回到其它宿主细胞中 进行表达。 要使质粒中的目标基因开始转录,质粒中必须装配适当的启动子( Promotor)。启动子 受到诱导时,目标基因开始转录,并开始合成蛋白质,因此启动子对蛋白质的合成具有很大 的影响。用于大肠杆菌的部分启动子列于表11.3.3 表11.3.3用于Ecol的强启动子 启动子名称 诱导方法 特征 Lacuv5 添加IPTG (约5%) 上 诱导引起细胞死亡 (>30%) Ipp-OmpA 用于释放型蛋白质 20%) Ipp-5 最强的启动子 色氨酸饥饿 比较弱 在42°C生长 (>30%) λp/cl 加色氨酸 容易诱导,适合大生产(24%) Att-nutl-p-att-N在42℃C培养10分钟诱导前无产物生成(om/off启动子) T7启动子 加IPTG或病毒感染 (>35%) T4启动子 病毒感染 诱导抑制产物降解的方法 WHoa 不适合于大规模生产时诱导 注:挂号内数字是被诱导细胞内结累的产物占细胞总蛋白质的百分数 一个理想的启动子应该是受到很好调节的强启动子。同时,宿主细胞的基底蛋白质生产 水平应该是零,如果这种蛋白质对宿主细胞有毒时尤其重要。另外启动子对诱导剂的响应应 该迅速、诱导剂价格低、使用安全。诱导方法不但能够在试验室小试中应用,还应考虑在工 业规模的可行性。例如温度诱导在小规模时较容易实现,但是在大发酵罐中要改变温度会产 生严重的滞后,会对细胞产生热冲击响应及增加蛋白水解酶的活力。另外许多化学诱导剂价 格昂贵,而且如果残留在产品中会造成健康问题。某些启动子需要营养缺陷进行诱导,因此 存在着怎样精确地控制诱导的问题 与质粒中的启动子相对应的是目标基因转录的终止子( Terminator)。如果采用强启动 子,就必需有强终止子与之匹配。终止子的作用是:在目标基因被转录后当读到特定的操纵 子时会释放出RNA聚合酶以结束转录。如果终止子不够强,RNA聚合酶得不到及时释放,不 但会造成不需要基因的转录,而且会干扰控制质粒拷贝数的基因单元,严重时还会发生质粒 复制失控和细胞死亡 有些宿主细胞,如枯草杆菌,能够合成蛋白酶,因此目标蛋白质合成后会受到蛋白酶的 攻击而水解。为了防止这种现象,在质粒的设计时可以采用两种方法:一是设计一个杂交基 因用于合成不易受到蛋白酶攻击的融合蛋白质,融合蛋白质分子中的主要部分是目标蛋白 质,另一小部分是宿主细胞本身能够合成的某种蛋白质,它们之间的连接键在下游过程中应 该能被很容易地断开,而且两种蛋白质的分离也不应成为问题:第二种方法是在质粒中加入
8 10-100 个。松弛型质粒更适宜于作为载体 DNA。 穿梭质粒载体(Shuttle plasmid vector)是指一类由人工构建的具有两种不同复制起 点和选择标记，因而可以在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体能够 携带着外源 DNA 序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核细胞之间往返穿梭，因此 在基因工程的研究工作中十分有用。常见的穿梭质粒载体有用于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿 梭质粒载体(如 pHV14 和 pEB10)、用于大肠杆菌-酵母穿梭质粒载体（由大肠杆菌的质粒与 酵母的 Yip, Yrp,Ycp 的 Yep 质粒构成）和大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体等。利用穿梭质 粒载体，能够方便地在大肠杆菌中进行重组 DNA 操作和增殖，然后再返回到其它宿主细胞中 进行表达。 要使质粒中的目标基因开始转录，质粒中必须装配适当的启动子（Promotor）。启动子 受到诱导时，目标基因开始转录，并开始合成蛋白质，因此启动子对蛋白质的合成具有很大 的影响。用于大肠杆菌的部分启动子列于表 11.3.3。 表 11.3.3 用于 E. coli 的强启动子 启动子名称 诱导方法 特征 LacUV5 添加 IPTG （约 5%） Tac 同上 诱导引起细胞死亡 （>30%） Ipp-OmpA 同上 用于释放型蛋白质 (20%) Ippp -5 同上 最强的启动子 (47%) Trp 色氨酸饥饿 比较弱 (约 10%) pL 在 42C 生长 （>30%） pL/cltrp 加色氨酸 容易诱导，适合大生产 （24%） Att-nutL-p-att-N 在 42C 培养 10 分钟 诱导前无产物生成（on/off 启动子） T7 启动子 加 IPTG 或病毒感染 同上 （>35%） T4 启动子 病毒感染 诱导抑制产物降解的方法 PhoA 磷酸盐饥饿 不适合于大规模生产时诱导 注：挂号内数字是被诱导细胞内结累的产物占细胞总蛋白质的百分数 一个理想的启动子应该是受到很好调节的强启动子。同时，宿主细胞的基底蛋白质生产 水平应该是零，如果这种蛋白质对宿主细胞有毒时尤其重要。另外启动子对诱导剂的响应应 该迅速、诱导剂价格低、使用安全。诱导方法不但能够在试验室小试中应用，还应考虑在工 业规模的可行性。例如温度诱导在小规模时较容易实现，但是在大发酵罐中要改变温度会产 生严重的滞后, 会对细胞产生热冲击响应及增加蛋白水解酶的活力。另外许多化学诱导剂价 格昂贵, 而且如果残留在产品中会造成健康问题。某些启动子需要营养缺陷进行诱导，因此 存在着怎样精确地控制诱导的问题。 与质粒中的启动子相对应的是目标基因转录的终止子（Terminator）。如果采用强启动 子，就必需有强终止子与之匹配。终止子的作用是：在目标基因被转录后当读到特定的操纵 子时会释放出 RNA 聚合酶以结束转录。如果终止子不够强，RNA 聚合酶得不到及时释放，不 但会造成不需要基因的转录，而且会干扰控制质粒拷贝数的基因单元，严重时还会发生质粒 复制失控和细胞死亡。 有些宿主细胞，如枯草杆菌，能够合成蛋白酶，因此目标蛋白质合成后会受到蛋白酶的 攻击而水解。为了防止这种现象，在质粒的设计时可以采用两种方法: 一是设计一个杂交基 因用于合成不易受到蛋白酶攻击的融合蛋白质，融合蛋白质分子中的主要部分是目标蛋白 质，另一小部分是宿主细胞本身能够合成的某种蛋白质，它们之间的连接键在下游过程中应 该能被很容易地断开，而且两种蛋白质的分离也不应成为问题；第二种方法是在质粒中加入
段信号肽基因,这样产生的蛋白质上将有一段信号肽,可以使蛋白质释放到周质体或胞外 以避免胞内蛋白酶的攻击,信号肽本身则会在通过细胞壁时与目标蛋白质断开。但是信号肽 与蛋白质的结合并不能保证蛋白质释放到胞外,有时根本不释放,有时则可能会释放到周质 体中。目前还没有建立起信号肽选择及保证蛋白质释放的一般方法。 宿主细胞在分裂时,质粒在子代细胞中的分布是任意的,有些子代细胞中可能不含质粒 这种现象如图11.3.2所示,称为分离不稳定性( Segragational instability)。为了防止 不含质粒细胞的产生,在构建质粒时可以考虑加入称为par和cer的位点。它们的作用是使 子代细胞中质粒的分布更均匀。Par的功能可能与促进质粒与膜之间形成复合体有关,而cer 则能够防止多聚体质粒的形成。 总之,质粒的构建是一个非常 复杂而细致的工作,质粒构建的好 坏对基因工程菌的培养及产物的积 正常 累都具有重要的影响,并能进一步(O 影响到基因工程产物的分离和提 纯。质粒的构建一方面需要有分子 生物学的理论指导,另一方面也需 要有丰富的研究工作经验 不正常 11.3.3基因重组 载体DNA都有详细的DNA图谱, 显示了限制性酶切位点,典型的有 从E.coli得到的EcoR1酶切点和 从 Bacillus amylofacieus得到的图1.3.2基因工程细胞的分裂不稳定性 BamH酶切点。这样就可以用限制 性酶根据需要进行质粒的切割。限 制性酶在切割载体时往往会留下 个由几个核苷酸组成的单股DNA粘合端( Sticky ends),它能与具有互补粘合端的DNA会发 生缔合。这样,将切割后的载体和供体DNA混合,就能够使载体DM与供体DMA发生缔合 再在DNA连接酶的作用下就可以将接口永久地结合在一起,这样就完成了DMA的重组过程。 图11.3.3说明了这一过程 11.3.4质粒的转化 经DNA重组得到的含有目标基因的质粒必须放到一个宿主细胞中,这个过程通常由基 因转化的方法实现,只有当转化方法的实现有困难时才会考虑其它方法。当选择大肠杆菌为 宿主细胞时,典型的质粒转化包括以下步骤(图11.3.3): 1)预先培养大肠杆菌,离心收集培养好的细胞 2)将收集的大肠杆菌重新悬浮到经过预冷的0.1mol/ L Cacl2溶液(4C)中获得感受 态细胞; 3)在上述细胞悬浮液中加入重组质粒,保持4°C放置约30分钟 4)将温度提高到约40°C,保持1-5分钟 5)再次将温度降低到4°C,保持约5分钟。 经过以上过程后,重组质粒就能顺利地转化到大肠杆菌中。 在构建质粒时得到的往往是混合物,如:某些载体虽然被打开但未与供体DMA结合就 自行闭合,有些载体中可能放入了多拷贝的供体DNA,也可能在某些载体中装入了载体DNA
9 一段信号肽基因，这样产生的蛋白质上将有一段信号肽，可以使蛋白质释放到周质体或胞外 以避免胞内蛋白酶的攻击，信号肽本身则会在通过细胞壁时与目标蛋白质断开。但是信号肽 与蛋白质的结合并不能保证蛋白质释放到胞外，有时根本不释放，有时则可能会释放到周质 体中。目前还没有建立起信号肽选择及保证蛋白质释放的一般方法。 宿主细胞在分裂时，质粒在子代细胞中的分布是任意的，有些子代细胞中可能不含质粒。 这种现象如图 11.3.2 所示，称为分离不稳定性（Segragational instability）。为了防止 不含质粒细胞的产生，在构建质粒时可以考虑加入称为 par 和 cer 的位点。它们的作用是使 子代细胞中质粒的分布更均匀。Par 的功能可能与促进质粒与膜之间形成复合体有关，而 cer 则能够防止多聚体质粒的形成。 总之，质粒的构建是一个非常 复杂而细致的工作，质粒构建的好 坏对基因工程菌的培养及产物的积 累都具有重要的影响，并能进一步 影响到基因工程产物的分离和提 纯。质粒的构建一方面需要有分子 生物学的理论指导，另一方面也需 要有丰富的研究工作经验。 11.3.3 基因重组 载体DNA都有详细的DNA图谱， 显示了限制性酶切位点，典型的有 从 E. coli 得到的 EcoR 1 酶切点和 从 Bacillus amylofacieus 得到的 Bam H1 酶切点。这样就可以用限制 性酶根据需要进行质粒的切割。限 制性酶在切割载体时往往会留下一 个由几个核苷酸组成的单股 DNA 粘合端（Sticky ends），它能与具有互补粘合端的 DNA 会发 生缔合。这样，将切割后的载体和供体 DNA 混合，就能够使载体 DNA 与供体 DNA 发生缔合， 再在 DNA 连接酶的作用下就可以将接口永久地结合在一起，这样就完成了 DNA 的重组过程。 图 11.3.3 说明了这一过程。 11.3.4 质粒的转化 经 DNA 重组得到的含有目标基因的质粒必须放到一个宿主细胞中，这个过程通常由基 因转化的方法实现，只有当转化方法的实现有困难时才会考虑其它方法。当选择大肠杆菌为 宿主细胞时，典型的质粒转化包括以下步骤(图 11.3.3)： 1） 预先培养大肠杆菌，离心收集培养好的细胞； 2） 将收集的大肠杆菌重新悬浮到经过预冷的 0.1mol/L CaCl2 溶液（4 0 C）中获得感受 态细胞； 3） 在上述细胞悬浮液中加入重组质粒，保持 4 0 C 放置约 30 分钟； 4） 将温度提高到约 400 C，保持 1-5 分钟； 5） 再次将温度降低到 4 0 C，保持约 5 分钟。 经过以上过程后，重组质粒就能顺利地转化到大肠杆菌中。 在构建质粒时得到的往往是混合物，如：某些载体虽然被打开但未与供体 DNA 结合就 自行闭合，有些载体中可能放入了多拷贝的供体 DNA，也可能在某些载体中装入了载体 DNA 正常 不正常 图 11.3.2 基因工程细胞的分裂不稳定性
混合物中的DNA污染物,因此需要建立起有效的筛选方法筛选出具有正确载体-供体组合的 转化细胞。一般而言,在大多数载体DMA的设计中都考虑了选择性标记,如抗生素抗性或营 养缺陷型标记等,这样,只要细胞能够在含抗生素平板或基本培养基平板上生长,就证明它 含有所需要的质粒。进一步的筛选工作是需要确认供体DNA片段的存在并能够成功地表达其 所代表的功能蛋白质,常用的筛选方法有同位素标记和荧光标记等。 用限制性栈EcoR1不对称切断 GAATTC 供体DNA 载体DNA 粘性未端 具有粘性未端的供体 和载体DNA分子 (b) 用DNA连接酶 将两个 共价连接 杂交DNA分子 图11.3.3基因重组步骤示意图 在基因克隆时一个很重要的问题是基因数目的扩增以便于基因的测序和分析、基因图 谱的编制、致病机体的基因诊断、生物进化研究等,为此一种称之为聚合酶链式反应 ( Polymerase chain reaction,简称PCR)的技术得到了迅速的发展。PCR扩增技术的基本 要求是待扩増基因两端各有一段引物的核苷酸序列(一般小于20个核苷酸)应该已知。扩 增的方法是将含基因的溶液加热引起双股DNA的两条互补链分离,然后加入经化学合成并与 目标基因上的引物互补的片段使之与目标基因的引物键合,随和加入耐高温的DNA聚合酶 ( Tag polymerase)和四种脱氧核苷酸,就会以单股DNA链为模板迅速地合成与之互补的链 这样一个循环下来原基因就有了两个拷贝,两个循环后成为四个拷贝等。依此类推,一台 CR扩增仪一天至少能做30个循环,产生2~个基因拷贝。PCR扩增已经成了基因工程不可 缺少的研究工具。 11.4宿主细胞的选择原则 基因工程的成功与否常常取决于最初对宿主细胞和表达系统的选择。表11.4.1总结并
10 混合物中的 DNA 污染物，因此需要建立起有效的筛选方法筛选出具有正确载体-供体组合的 转化细胞。一般而言，在大多数载体 DNA 的设计中都考虑了选择性标记，如抗生素抗性或营 养缺陷型标记等，这样，只要细胞能够在含抗生素平板或基本培养基平板上生长，就证明它 含有所需要的质粒。进一步的筛选工作是需要确认供体 DNA 片段的存在并能够成功地表达其 所代表的功能蛋白质，常用的筛选方法有同位素标记和荧光标记等。 图 11.3.3 基因重组步骤示意图 在基因克隆时一个很重要的问题是基因数目的扩增以便于基因的测序和分析、基因图 谱的编制、致病机体的基因诊断、生物进化研究等，为此一种称之为聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction, 简称 PCR）的技术得到了迅速的发展。PCR 扩增技术的基本 要求是待扩增基因两端各有一段引物的核苷酸序列（一般小于 20 个核苷酸）应该已知。扩 增的方法是将含基因的溶液加热引起双股 DNA 的两条互补链分离，然后加入经化学合成并与 目标基因上的引物互补的片段使之与目标基因的引物键合，随和加入耐高温的 DNA 聚合酶 （Taq polymerase）和四种脱氧核苷酸，就会以单股 DNA 链为模板迅速地合成与之互补的链， 这样一个循环下来原基因就有了两个拷贝，两个循环后成为四个拷贝等。依此类推，一台 PCR 扩增仪一天至少能做 30 个循环，产生 2 30 个基因拷贝。PCR 扩增已经成了基因工程不可 缺少的研究工具。 11.4 宿主细胞的选择原则 基因工程的成功与否常常取决于最初对宿主细胞和表达系统的选择。表 11.4.1 总结并