第九章微生物和酶制剂工业 9.1概述 酶是一种具有催化活性的蛋白质,因此酶具有催化剂的特点,即:能够加快特定反应 的速率但不能改变反应的平衡,在反应中不消耗,反应结束时回复到原来的形态;同时酶又 具有蛋白质的属性,即:酶由氨基酸通过肽键连接而成,只有在适当的温度,pH和离子强 度下才具有生物活性,有些酶还需要辅酶或者辅因子。由于酶催化反应能够在常温常压下进 行,而且具有很高的效率和专一性,酶的应用日益受到了人们的重视。 在细胞中有数以千计的酶同时催化着成千上万个反应,因此可以毫不夸张地说,酶是 一切生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了2000种,但是根据最简单的原核生物大肠 杆菌染色体的基因图谱分析,就可能包含3000-4500种不同酶蛋白的信息,所以还有更多的 酶有待于鉴别。 人类早在认识酶以前就知道利用酶为生产和生活服务,例如面粉发酵,酿造,鞣革及 制造奶酪等已经有几千年的历史,都是人类不自觉地利用酶的例子。1783年, Spallanzani 提出消化不是磨碎而是胃液在起作用的概念,对酶有了初步的认识:到了十九世纪人们已 经认识到了酶的存在,建立了酶的概念。1833年 Payer用乙醇抽提麦芽,并用于淀粉水解 和织物退浆;1887年Bˇ chner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳 1926年 Sumner第一次分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶:四十年代末,生产a-淀粉酶 的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产,标志着现代酶制剂工业的开始。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶;依据其用途可分为工业用、 分析用及药用:而且不同用途酶制剂产品的价格和生产规模也有很大的差别,见表9.1.1 由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制,实现大规模工业化的酶制剂生产,成本低、 效率高,因此在目前己经能够大规模工业化生产的100多种酶中,极大部分都是通过微生物 发酵生产的 表9.1.1商品酶的来源、用途及生产规模 工业用醇 分析用酶 药用酶 生产规模 以吨计 毫克一克 毫克克 粗酶制剂 纯结晶 纯结晶 微生物 微生物、动物、植物微生物、动物、植物 产品价格 9.1.1酶的分类和命名 我们知道,酶可以分为六个大类。根据酶委员会( Enzyme Commission)的命名规则,酶 的命名以酶委员会英文的头一个字母E.C.开始,后面跟随着四组数字,第一个数字表示酶 的大类,第二和第三个数字代表所催化的反应,第四个数字用于根据所催化的底物区分具有 类似功能的酶 1)氧化还原酶( Oxidoreductase)这类酶催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物 质的反应,常称为氧化酶或脱氢酶,如葡萄糖氧化酶及乙醇脱氢酶。氧化还原酶的前三 位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 1.(氧化还原酶) 1.醇 1.NAD或NADP 2.醛或酮
1 第九章 微生物和酶制剂工业 9．1 概述 酶是一种具有催化活性的蛋白质，因此酶具有催化剂的特点，即：能够加快特定反应 的速率但不能改变反应的平衡，在反应中不消耗, 反应结束时回复到原来的形态；同时酶又 具有蛋白质的属性，即：酶由氨基酸通过肽键连接而成，只有在适当的温度, pH 和离子强 度下才具有生物活性，有些酶还需要辅酶或者辅因子。由于酶催化反应能够在常温常压下进 行，而且具有很高的效率和专一性，酶的应用日益受到了人们的重视。 在细胞中有数以千计的酶同时催化着成千上万个反应，因此可以毫不夸张地说，酶是 一切生命活动的基础。目前已经知道的酶超过了 2000 种，但是根据最简单的原核生物大肠 杆菌染色体的基因图谱分析, 就可能包含 3000-4500 种不同酶蛋白的信息，所以还有更多的 酶有待于鉴别。 人类早在认识酶以前就知道利用酶为生产和生活服务，例如面粉发酵，酿造，鞣革及 制造奶酪等已经有几千年的历史，都是人类不自觉地利用酶的例子。1783 年，Spallanzani 提出消化不是磨碎而是胃液在起作用的概念，对酶有了初步的认识； 到了十九世纪人们已 经认识到了酶的存在，建立了酶的概念。1833 年 Payer 用乙醇抽提麦芽，并用于淀粉水解 和织物退浆；1887 年 Bchner 发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳； 1926 年 Sumner 第一次分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶；四十年代末，生产α-淀粉酶 的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。 商品酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶；依据其用途可分为工业用、 分析用及药用；而且不同用途酶制剂产品的价格和生产规模也有很大的差别，见表 9.1.1。 由于用微生物发酵的方法能够不受原料的限制，实现大规模工业化的酶制剂生产，成本低、 效率高，因此在目前已经能够大规模工业化生产的 100 多种酶中，极大部分都是通过微生物 发酵生产的。 表 9.1.1 商品酶的来源、用途及生产规模 工业用酶 分析用酶 药用酶 生产规模 以吨计 毫克-克 毫克-克 纯度 粗酶制剂 纯结晶 纯结晶 来源 微生物 微生物、动物、植物 微生物、动物、植物 产品价格 低 中—高 中—高 9．1．1 酶的分类和命名 我们知道，酶可以分为六个大类。根据酶委员会(Enzyme Commission)的命名规则，酶 的命名以酶委员会英文的头一个字母 E.C.开始，后面跟随着四组数字，第一个数字表示酶 的大类，第二和第三个数字代表所催化的反应，第四个数字用于根据所催化的底物区分具有 类似功能的酶。 1） 氧化还原酶(Oxidoreductase) 这类酶催化将氢或氧或电子从一种底物转移到另一种物 质的反应，常称为氧化酶或脱氢酶，如葡萄糖氧化酶及乙醇脱氢酶。氧化还原酶的前三 位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 1．（氧化还原酶） 1.醇 1.NAD+或 NADP+ 2.醛或酮 2.Fe3+
3烯-CH=CH 4.伯胺 4.其它 5.叔胺 6.NADH或 NADPH 2)转移酶( Transferase)转移酶催化基团转移反应,一般形式为: AX + B →BX+A 但不包括氧化还原反应和水解反应。前三位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 2.(转移酶) 1.一碳基团 转移基团的性质 2.醛基或酮基 3.酰基(-C0R) 4.葡萄糖基 7.磷酸基 8.含硫基团 3)水解酶( Hydrolase)水解酶催化水解反应, A-X+H20←>X-OH+HA 前两位数字的意义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 3.(水解酶) 1.酯键 糖苷键 4.肽键 5.除肽键外的C-N键 6.酸酐键 4)裂合酶 Lyase)裂合酶催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应,产物一般 含有一个双键,第二个数字代表所断裂键的类型,第三位数字代表所除去的基团。催化逆反 应的酶又称为合成酶。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 4.(裂合酶) 1.C 1.羧基 2.醛基 3.酮酸 5)异构酶( Isomerase)异构酶催化异构化反应,前三个数字的定义是 第一个数字 第二个数字 第三个数字 5.(异构酶) 1.消旋反应或差相异构化反应1.氨基酸 2.顺反(cis- trans)异构反应2.羟酸 3.分子内氧化还原反应 3.碳氢化合物 4分子内基团转移反应 6)连接酶( Ligase)连接酶催化各种键的合成,键的形成反应含能化合物(如ATP或核苷三 磷酸)键的断裂同时发生,反应的一般形式是 X +Y+ ATP X—Y+ADP+P1 或 X +Y+ ATP X-Y AMP PPI 连接酶的第二个数字代表所形成键的类型。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 6.(连接酶 1.C-0
2 3.烯-CH=CH- 3.O2 4.伯胺 4.其它 5.叔胺 6.NADH 或 NADPH 2)转移酶(Transferase) 转移酶催化基团转移反应，一般形式为： AX + B BX + A 但不包括氧化还原反应和水解反应。前三位数字的意义是： 第一个数字 第二个数字 第三个数字 2.(转移酶) 1.一碳基团 转移基团的性质 2.醛基或酮基 3.酰基(-CO-R) 4.葡萄糖基 7.磷酸基 8.含硫基团 3)水解酶(Hydrolase) 水解酶催化水解反应, A—X + H2O X—OH + HA 前两位数字的意义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 3.(水解酶) 1.酯键 2.糖苷键 4.肽键 5.除肽键外的 C-N 键 6.酸酐键 4）裂合酶(Lyase) 裂合酶催化除水解外的从底物中脱除基团的反应或其逆反应，产物一般 含有一个双键，第二个数字代表所断裂键的类型，第三位数字代表所除去的基团。催化逆反 应的酶又称为合成酶。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 4．（裂合酶） ` 1.C-C 1.羧基 2.C-O 2.醛基 3.C-N 3.酮酸 4.C-N 5）异构酶（Isomerase） 异构酶催化异构化反应, 前三个数字的定义是: 第一个数字 第二个数字 第三个数字 5.(异构酶) 1.消旋反应或差相异构化反应 1.氨基酸 2.顺反(cis-trans)异构反应 2.羟酸 3.分子内氧化还原反应 3.碳氢化合物 4.分子内基团转移反应 6）连接酶(Ligase) 连接酶催化各种键的合成，键的形成反应含能化合物（如 ATP 或核苷三 磷酸）键的断裂同时发生，反应的一般形式是： X + Y + ATP X—Y + ADP + PI 或 X + Y + ATP X—Y + AMP + PPI 连接酶的第二个数字代表所形成键的类型。 第一个数字 第二个数字 第三个数字 6.(连接酶) 1.C-O
以乙醇脱氢酶为例,它的酶编号为:EC1.1.1.1,说明它属于氧化还原酶,电子供体是 CH-OH,电子受体是NAD。因此它的正式命名应该是乙醇:NAD氧化还原酶 9.1.2主要的微生物藤制剂 目前,上述六大类中都有一些酶可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制剂及其生 产菌列于表9.1.2。 表9.1.2只列出了一小部分工业酶制剂,从中可以看到酶的用途已经渗透到各个工业 部门和人们的日常生活。以酶的工业应用为例,α-淀粉酶和糖化酶已经代替传统的酸法水 解用于从淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆:蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食 品、纺织、精细化学品及手性化合物斥分和合成等:由葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高 果玉米糖浆( High Fructose Corn Syrup,HFCS)年产量已超过1,000万吨:通过青霉素酰化 酶催化青霉素G分解生产6-APA已成为半合成抗生素最重要的中间体,等等。许多酶直接应 用于疾病的诊断和治疗,如链激酶,葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等。更多的酶则被用于科学 研究,可以毫不夸张地说,没有众多的工具酶,就没有人类基因组计划和以基因重组为核心 的现代生物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现,酶的应用领域将更加广 阔,微生物酶制剂工业也必将得到进一步发展。 表9.1.2部分典型的酶制剂及其生产菌 酶名称 酶类型典型生产菌名称 用途 中文 英文 淀粉酶 水解酶|Bc1 us subtilis淀粉水解 葡萄糖苷酶 Amy glucosidase水解酶「 Aspergil/ us niger葡萄糖生产 碱性蛋白酶[ Alkaline protease水解酶[5Stre1 nyes gr1s洗涤剂(pH80) 性蛋白酶 Protease 解酶|Baci/ lus subtilis洗涤剂(pH7.0) 脂肪酶 水解酶 Rhizopus japonicus洗涤剂等 纤维素酶 Cellulase 水解酶 Trichoderma reesei纤维素水解等 果胶酶 水解酶| Eriwinia carotovora食品加工等 葡萄糖异构酶「 Glucose isomerase异构酶「 Bacillus coagulans高果糖浆制造 霉素酰化酶 Penicillin acylase转移酶| Escherichia coli6-APA制造 天冬氨酸转氨| Aspartic acid 转移酶| Escherichia coli L-苯丙氨酸制造 酶 Transaminase 延胡索酸酶| Fumarase 裂合酶 L-苹果酸制造 葡萄糖氧化酶| Glucose oxidase氧化酶| Bakers east 酶电极制备 T4DNA连接酶|T4 DNA Ligase ‖连接酶|T4感染的Eco1分子生物学研究 漆酶 Laccase 氧化酶 Coliolus versicolor木质素降解 9.1.2产酶微生物的来源和特点 从表9.1.2中可以发现,能够生产酶的微生物菌种分布很广,属于原核生物和真核生物 的许多微生物都能用于酶制剂的生产。往往有许多种微生物能够用于同一种酶的生产,例如, 枯草杆菌,曲霉及根霉等都可以用于生产淀粉酶,产品都能够用于降解淀粉,但是每种微生 物所生产的淀粉酶分子量、最适pH、最适温度及反应速率等都会有所差别,表9.1.3所列 的数据就说明了这种差别。另外,同一种微生物能够产生几种不同的酶或能够催化类似反应、 但是作用位点不同的几种酶,例如,黑曲霉( Aspergillus niger)既能产生淀粉酶,又能
3 2.C-S 3.C-N 4.C-C 以乙醇脱氢酶为例，它的酶编号为：EC 1.1.1.1，说明它属于氧化还原酶，电子供体是 CH-OH，电子受体是 NAD+。因此它的正式命名应该是乙醇：NAD+氧化还原酶。 9.1.2 主要的微生物酶制剂 目前，上述六大类中都有一些酶可以通过微生物发酵生产。部分典型的酶制剂及其生 产菌列于表 9.1.2。 表 9.1.2 只列出了一小部分工业酶制剂，从中可以看到酶的用途已经渗透到各个工业 部门和人们的日常生活。以酶的工业应用为例, −淀粉酶和糖化酶已经代替传统的酸法水 解用于从淀粉生产葡萄糖及纺织品的退浆；蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶广泛用于洗涤剂、食 品、纺织、精细化学品及手性化合物斥分和合成等；由葡萄糖异构酶催化的从葡萄糖生产高 果玉米糖浆(High Fructose Corn Syrup, HFCS)年产量已超过 1,000 万吨；通过青霉素酰化 酶催化青霉素 G 分解生产 6-APA 已成为半合成抗生素最重要的中间体, 等等。许多酶直接应 用于疾病的诊断和治疗, 如链激酶, 葡萄糖氧化酶及乳酸脱氢酶等。更多的酶则被用于科学 研究, 可以毫不夸张地说, 没有众多的工具酶, 就没有人类基因组计划和以基因重组为核心 的现代生物技术。随着人们对酶的认识不断深入和更多的酶被发现, 酶的应用领域将更加广 阔, 微生物酶制剂工业也必将得到进一步发展。 表 9.1.2 部分典型的酶制剂及其生产菌 酶名称 酶类型 典型生产菌名称 用途 中文 英文 淀粉酶 Amylase 水解酶 Bacillus subtilis 淀粉水解 葡萄糖苷酶 Amyloglucosidase 水解酶 Aspergillus niger 葡萄糖生产 碱性蛋白酶 Alkaline protease 水解酶 Streptomyces grisus 洗涤剂（pH8.0） 中性蛋白酶 Protease 水解酶 Bacillus subtilis 洗涤剂（pH7.0） 脂肪酶 Lipas 水解酶 Rhizopus japonicus 洗涤剂等 纤维素酶 Cellulase 水解酶 Trichoderma reesei 纤维素水解等 果胶酶 Pectinase 水解酶 Eriwinia carotovora 食品加工等 葡萄糖异构酶 Glucose isomerlase 异构酶 Bacillus coagulans 高果糖浆制造 青霉素酰化酶 Penicillin acylase 转移酶 Escherichia coli 6-APA 制造 天冬氨酸转氨 酶 Aspartic acid Transaminase 转移酶 Escherichia coli L-苯丙氨酸制造 延胡索酸酶 Fumarase 裂合酶 L-苹果酸制造 葡萄糖氧化酶 Glucose oxidase 氧化酶 Bakers Yeast 酶电极制备 T4 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 连接酶 T4 感染的 E. coli 分子生物学研究 漆酶 Laccase 氧化酶 Coliolus versicolor 木质素降解 9.1.2 产酶微生物的来源和特点 从表 9.1.2 中可以发现，能够生产酶的微生物菌种分布很广，属于原核生物和真核生物 的许多微生物都能用于酶制剂的生产。往往有许多种微生物能够用于同一种酶的生产，例如， 枯草杆菌，曲霉及根霉等都可以用于生产淀粉酶，产品都能够用于降解淀粉，但是每种微生 物所生产的淀粉酶分子量、最适 pH、最适温度及反应速率等都会有所差别，表 9.1.3 所列 的数据就说明了这种差别。另外，同一种微生物能够产生几种不同的酶或能够催化类似反应、 但是作用位点不同的几种酶，例如，黑曲霉（Aspergillus niger）既能产生淀粉酶，又能
产生纤维素酶或蛋白酶:而枯草杆菌( Bacillus subtilis)产生的淀粉酶中,则可能包括 α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶及糖化酶等淀粉水解酶,如图9.1.1所示,它们在淀粉分 子中的作用位点却完全不同。还有一些酶制剂实际上是几种不同酶的混合物并通过它们的协 同作用完成催化作用。例如一般称为纤维素酶的商品酶制剂至少是三种酶的混合物:内切型 葡聚糖酶(EC3.2.1.4,也称为Cx酶、CMC酶或简称EG)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91,也 称为C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或简称CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.91,也称为 β-葡萄糖苷酶或简称BG)。Cx酶作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β-1,4糖苷键, 将纤维素大分子切割成带还原性末端的许多碎片;C酶作用于纤维分子末端,水解β-1,4糖 苷键,每次切下一个纤维二糖分子;纤维二糖酶则将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。正是在 这三种酶的共同作用下,将纤维素最终水解为葡萄糖。 表9.1.3不同微生物生产的淀粉酶性质比较 微生物 最适p最适温度,CB「分子量1 杆菌Bci/ us subtilis 68,000 B. licheniformis 7.0-9.0 70-90 62,650 B. licheniformis 5.0-8.0 22,500 涟霉菌 Streptomyces aureofaciens 4.6-5.3 40,000 微球菌 Micrococus halobius 6.0-7.0 50-55 根瘤菌 Bacteroides amylophi/s 6.3 92,000 黑曲霉 Aspergillus oryzae 5.5-5.9 52,600 毛霉 Mucor pusillus 3.5-4.0 65-70 48,000 施旺氏酵母 Schwanniomyces castellii 40,000 α-淀粉酶 支链淀粉酶 β-淀粉酶 糖化酶 图9.1.1各种淀粉酶在淀粉分子上的作用位点 利用微生物生产酶制剂的主要优点是 1)可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水平。通过对产酶 菌种的选育,可以使参与微生物分解代谢的酶活水平提高几千倍、合成代谢的酶活 提高几百倍,这样的例子并不少见: 2)由于微生物发酵的生产周期短,培养基价格低廉,酶制剂可以实现大规模、低成本 的工业化生产
4 产生纤维素酶或蛋白酶；而枯草杆菌（Bacillus subtilis）产生的淀粉酶中，则可能包括 -淀粉酶、-淀粉酶、支链淀粉酶及糖化酶等淀粉水解酶，如图 9.1.1 所示,它们在淀粉分 子中的作用位点却完全不同。还有一些酶制剂实际上是几种不同酶的混合物并通过它们的协 同作用完成催化作用。例如一般称为纤维素酶的商品酶制剂至少是三种酶的混合物: 内切型 葡聚糖酶(EC3.2.1.4, 也称为 Cx 酶、CMC 酶或简称 EG) 、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91, 也 称为 C1 酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或简称 CBH)和纤维二糖酶(EC3.2.1.91, 也称为 -葡萄糖苷酶或简称 BG)。Cx 酶作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解-1,4 糖苷键, 将纤维素大分子切割成带还原性末端的许多碎片；C1 酶作用于纤维分子末端，水解-1,4 糖 苷键，每次切下一个纤维二糖分子；纤维二糖酶则将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。正是在 这三种酶的共同作用下，将纤维素最终水解为葡萄糖。 表 9.1.3 不同微生物生产的淀粉酶性质比较 微生物 最适 pH 最适温度,C 分子量 杆菌 Bacillus subtilis 6.0 60 68,000 B. licheniformis 7.0-9.0 70-90 62,650 B. licheniformis 5.0-8.0 76 22,500 链霉菌 Streptomyces aureofaciens 4.6-5.3 40 40,000 微球菌 Micrococus halobius 6.0-7.0 50-55 89,000 根瘤菌 Bacteroides amylophilus 6.3 43 92,000 黑曲霉 Aspergillus oryzae 5.5-5.9 40 52,600 毛霉 Mucor pusillus 3.5-4.0 65-70 48,000 施旺氏酵母 Schwanniomyces castellii 6.0 60 40,000 图 9.1.1 各种淀粉酶在淀粉分子上的作用位点 利用微生物生产酶制剂的主要优点是： 1） 可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水平。通过对产酶 菌种的选育, 可以使参与微生物分解代谢的酶活水平提高几千倍、合成代谢的酶活 提高几百倍，这样的例子并不少见； 2） 由于微生物发酵的生产周期短, 培养基价格低廉，酶制剂可以实现大规模、低成本 的工业化生产； -淀粉酶 支链淀粉酶 -淀粉酶 糖化酶
3)微生物的筛选方法比较简单,而且已经很成熟,因此有可能在较短的时间内从成千 个菌株中筛选出高产菌种; 4)同样的反应可以用来源于不同微生物所产的性质略有不同的酶催化,因此生物反应 器的操作条件选择具有一定的灵活性和适应性,以便与前后工序相配合 5)微生物发酵生产的酶比活高,有利于酶的分离和提纯 正是由于以上优点,利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本,提高了酶制剂 的生产能力,从而推动了工业规模酶制剂生产和酶制剂应用的进展 一般而言,水解酶都是胞外酶,而其它酶通常属于胞内酶。极大部分酶都属于结构(组 成)酶,即微生物的DNA分子中存在着编码该酶蛋白的基因,在细胞生长过程中就会产生这 些酶并参于细胞代谢过程,但是酶的产量受到细胞的调节和控制;其中有些属于诱导酶,即 需要在培养基中添加特殊的诱导剂才会产生的酶。野生微生物的产酶水平一般都不高,不能 直接用于酶制剂的工业化生产,必须进行菌种选育以提高产酶水平。 虽然每一种微生物的代谢过程都需要数以千计的酶参与,但是不是每一种微生物都适 合于酶的工业化生产。传统的产酶菌种都是从土壤中筛选得到的,首先获得具有产某种酶能 力的微生物,然后通过各种诱变育种方法提高它的产酶水平,直至达到工业化生产的要求 对于产酶的菌种,一般应该符合如下的要求 1)菌种的遗传性能应该比较稳定; 2)菌种具有较高的生长速率; 3)除了蛋白酶生产菌种外,其它产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低,以防止目标酶被 蛋白酶水解 4)目标酶制剂的产量较高 随着分子生物学和重组DNA技术的发展,越来越多的酶已经知道了其氨基酸序列和空间 结构,因此可以通过基因重组获得基因工程菌生产酶制剂。 9.2合成的调节和控制 酶是一种蛋白质。根据生物化学和分子生物学的研究,蛋白质的合成是一个十分复杂 的过程,涉及到三种RNA(tRNA,mRNA及rRNA),几种核苷酸(ATP,GTP等),一系列的酶和 蛋白辅助因子,总共大约有200种细胞成分参与了蛋白质的合成过程。因此与蛋白质合成有 关的调节和控制因素都会影响酶的产量。微生物细胞产生的酶可以分为两大类:胞外酶和胞 内酶。胞外酶一般都属于水解酶,是微生物为了利用环境中的大分子底物(如淀粉、纤维素、 蛋白质等)而释放到胞外的,这样即使水解酶的胞外浓度很高,在细胞内这类酶仍能维持在 较低水平,所受到的调节和控制相对要少一些,因此许多野生菌种(如Gram阳性菌及霉菌等) 也能达到较高的产水解酶水平。胞内酶的作用是催化在细胞内发生的一系列反应,由于胞内 的代谢中间产物或终产物浓度都必须保持在适当的细胞生理浓度的范围内,催化这些反应 的酶活性或浓度必然会受到更多因素的调节和控制。因此如果要生产胞内酶,就必须研究它 们在合成过程中的调节和控制机理,找出解除调节和控制的方法,才能使胞内酶过量积累 9.2.1合成的基因水平调节和控制 9.2.1.1原核生物中酶合成的基因水平调节 在原核生物中,对蛋白质生物合成过程调节起关键作用的是mRNA,mRNA又受到转录的 控制,因此转录水平的调节是主要的,翻译水平的调节影响则比较小。原核生物的转录控制 主要通过操纵子( Operon)实现,在操纵子上有一个启动子( Promoter)位点,在开始转录前 RNA聚合酶与启动子结合。在起动子和酶的结构基因之间有一个调节区,它的作用是控制操 纵子转录的频率。调节区有如下两种形式
5 3） 微生物的筛选方法比较简单，而且已经很成熟，因此有可能在较短的时间内从成千 个菌株中筛选出高产菌种； 4） 同样的反应可以用来源于不同微生物所产的性质略有不同的酶催化，因此生物反应 器的操作条件选择具有一定的灵活性和适应性，以便与前后工序相配合； 5） 微生物发酵生产的酶比活高，有利于酶的分离和提纯。 正是由于以上优点, 利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本, 提高了酶制剂 的生产能力, 从而推动了工业规模酶制剂生产和酶制剂应用的进展。 一般而言，水解酶都是胞外酶，而其它酶通常属于胞内酶。极大部分酶都属于结构(组 成)酶，即微生物的 DNA 分子中存在着编码该酶蛋白的基因，在细胞生长过程中就会产生这 些酶并参于细胞代谢过程，但是酶的产量受到细胞的调节和控制；其中有些属于诱导酶，即 需要在培养基中添加特殊的诱导剂才会产生的酶。野生微生物的产酶水平一般都不高,不能 直接用于酶制剂的工业化生产，必须进行菌种选育以提高产酶水平。 虽然每一种微生物的代谢过程都需要数以千计的酶参与，但是不是每一种微生物都适 合于酶的工业化生产。传统的产酶菌种都是从土壤中筛选得到的，首先获得具有产某种酶能 力的微生物，然后通过各种诱变育种方法提高它的产酶水平，直至达到工业化生产的要求。 对于产酶的菌种，一般应该符合如下的要求： 1） 菌种的遗传性能应该比较稳定； 2） 菌种具有较高的生长速率； 3） 除了蛋白酶生产菌种外，其它产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，以防止目标酶被 蛋白酶水解； 4） 目标酶制剂的产量较高。 随着分子生物学和重组 DNA 技术的发展，越来越多的酶已经知道了其氨基酸序列和空间 结构，因此可以通过基因重组获得基因工程菌生产酶制剂。 9.2 酶合成的调节和控制 酶是一种蛋白质。根据生物化学和分子生物学的研究, 蛋白质的合成是一个十分复杂 的过程, 涉及到三种 RNA(tRNA, mRNA 及 rRNA), 几种核苷酸(ATP, GTP 等), 一系列的酶和 蛋白辅助因子, 总共大约有 200 种细胞成分参与了蛋白质的合成过程。因此与蛋白质合成有 关的调节和控制因素都会影响酶的产量。微生物细胞产生的酶可以分为两大类: 胞外酶和胞 内酶。胞外酶一般都属于水解酶, 是微生物为了利用环境中的大分子底物(如淀粉、纤维素、 蛋白质等)而释放到胞外的, 这样即使水解酶的胞外浓度很高, 在细胞内这类酶仍能维持在 较低水平, 所受到的调节和控制相对要少一些, 因此许多野生菌种(如 Gram 阳性菌及霉菌等) 也能达到较高的产水解酶水平。胞内酶的作用是催化在细胞内发生的一系列反应, 由于胞内 的代谢中间产物或终产物浓度都必须保持在适当的细胞生理浓度的范围内, 催化这些反应 的酶活性或浓度必然会受到更多因素的调节和控制。因此如果要生产胞内酶, 就必须研究它 们在合成过程中的调节和控制机理, 找出解除调节和控制的方法, 才能使胞内酶过量积累。 9.2.1 酶合成的基因水平调节和控制 9.2.1.1 原核生物中酶合成的基因水平调节 在原核生物中, 对蛋白质生物合成过程调节起关键作用的是 mRNA, mRNA 又受到转录的 控制, 因此转录水平的调节是主要的, 翻译水平的调节影响则比较小。原核生物的转录控制 主要通过操纵子(Operon)实现, 在操纵子上有一个启动子(Promoter)位点, 在开始转录前 RNA 聚合酶与启动子结合。在起动子和酶的结构基因之间有一个调节区, 它的作用是控制操 纵子转录的频率。调节区有如下两种形式:
1)操纵子模式。这种模式属于负控制,调节区敞开让RNA聚合酶通过,当它与组遏蛋 白结合后关闭。操纵子模式控制的典型代表是乳糖(lac)操纵子(见图9.2.1),大肠杆菌的 乳糖操纵子含有三个结构基因,分别表达β一半乳糖苷酶()、半乳糖苷渗透酶(Y)和硫代半 乳糖苷转乙酰酶(A),这些基因的表达受到阻遏蛋白的控制,阻遏蛋白的结构基因则位于乳 糖操纵子的第二个转录单元中,1ac阻遏蛋白由四个紧密结合在一起的分子量同为38,000 的子单元组成,作用区域位于启动子P和Z基因之间。一旦与操纵子(0)结合,lac阻遏蛋 白就很难解离,加入诱导剂后不能直接取代阻遏蛋白,而是通过与阻遏蛋白和操纵子的复合 物作用,使其结构不稳定并发生构型变化,然后才能取而代之,使酶的结构基因发生转录 环腺苷一磷酸(cAMP)、cAMP/CRP(环腺苷酸受体蛋白)复合物及RNA聚合酶(RNA)则将分别 键合到启动子各自的位点上 CAMP RNA阻遇子 I P 38,000 135,000 30,00032,000 阻遇子 半乳糖苷酶 渗透酶转乙酰酶 图92.1乳糖操纵子原理示意图 ind RNAp 调节子 微菌异构菌差向异构 图9.22阿拉伯糖操纵子控制原理示意图 2)启动子模式。这种模式属于正控制,调节区本身是关闭的,不允许RNA聚合酶通过,只有 当它与活化蛋白结合后,操纵子打开使RNA聚合酶得以通过,转录随之开始。启动子模式的 典型代表是如图9.2.2所示的阿拉伯糖(ara)操纵子。ara操纵子中包括三种与L-阿拉伯糖 6
6 1)操纵子模式。这种模式属于负控制, 调节区敞开让 RNA 聚合酶通过, 当它与组遏蛋 白结合后关闭。操纵子模式控制的典型代表是乳糖(lac)操纵子(见图 9.2.1), 大肠杆菌的 乳糖操纵子含有三个结构基因, 分别表达−半乳糖苷酶(Z)、半乳糖苷渗透酶(Y)和硫代半 乳糖苷转乙酰酶(A), 这些基因的表达受到阻遏蛋白的控制, 阻遏蛋白的结构基因则位于乳 糖操纵子的第二个转录单元中, lac 阻遏蛋白由四个紧密结合在一起的分子量同为 38,000 的子单元组成, 作用区域位于启动子 P 和 Z 基因之间。一旦与操纵子(O)结合, lac 阻遏蛋 白就很难解离, 加入诱导剂后不能直接取代阻遏蛋白，而是通过与阻遏蛋白和操纵子的复合 物作用, 使其结构不稳定并发生构型变化, 然后才能取而代之, 使酶的结构基因发生转录； 环腺苷一磷酸(cAMP)、cAMP/CRP（环腺苷酸受体蛋白）复合物及 RNA 聚合酶(RNAP)则将分别 键合到启动子各自的位点上。 图 9.2.1 乳糖操纵子原理示意图 图 9.2.2 阿拉伯糖操纵子控制原理示意图 2)启动子模式。这种模式属于正控制, 调节区本身是关闭的, 不允许 RNA 聚合酶通过, 只有 当它与活化蛋白结合后, 操纵子打开使 RNA 聚合酶得以通过, 转录随之开始。启动子模式的 典型代表是如图 9.2.2 所示的阿拉伯糖(ara)操纵子。ara 操纵子中包括三种与 L-阿拉伯糖
转化为D-木酮糖-5-磷酸有关的酶(arB、A和D)、两种传递酶及一种低分子量渗透酶(araE) 的结构基因,操纵子的控制区如图9.2.2的放大部分所示。当araC基因表达的蛋白质是阻 遏蛋白构型(C)并与操纵子的活性位点结合时,酶的结构基因转录不能进行,而且占据了 两个cAMP/CRP复合物的结合位点。加入诱导剂后,使C"改变成了活化型(C"),cAMP/CRP 复合物也重新与操纵子结合,在两者的共同作用下,酶的转录开始 阻遇蛋白 阻遏蛋白 阻退蛋白 RNA I RNA G C 转录 氨基水解酶亚胺水解酶阻遏蛋白尿狗酸酶组氨酸酶 图9.2.3 Salmonella typhimurium中醇合成的双操纵子自诱导模型 除了以上两类由诱导剂引起的酶合成调节机理外,原核生物中还存在着自发的阻遏蛋 白-控制的诱导机制,典型例子是在沙门氏菌 Salmonella typhimurium中与组氨酸酶(hut) 有关的双操纵子模型(见图9.2.3)。两个操纵子的核苷序列不完全相同,右面操纵子与阻遏 蛋白的结合能力比左面的强3-4倍,位于左面操纵子中的hu基因编码阻遏蛋白,该蛋白 与操纵子结合,完全阻遏了右面操纵子的转录,但是左面的操纵子仍能够进行少量的转录 由于细胞中总是存在着生理浓度的组氨酸及组氨酸酶,因此会产生少量的尿狗酸,尿狗酸则 是操纵子的诱导剂,它使阻遏蛋白失活,两个操纵子就能够启动结构基因的转录并导致酶蛋 白表达。与此同时,加C基因表达的阻遏蛋白量也增加,因此系统将处于一个动态平衡中。 9.32真核微生物产酶的基因水平调节和控制 真核微生物产酶的基因水平调节和控制与原核生物有很大的差别,其调节和控制机理 也要复杂得多 真核微生物mRNA的两端都经过了修饰,其中5’端是甲基化的核苷酸片段,有一个含三 个磷酸基团的鸟嘌呤残基通过独特的5°-5°键连接截断了mRNA最后第二个碱基。这个5’-帽 通过削弱5外切核苷酸酶的活性从而加强了皿RNA的稳定性,有利于7-甲基鸟嘌呤与核糖体 的结合,提高了翻译的效率。mRNA的3端含有一个很长的腺苷残基(PlA),其功能是为蛋 白质的键合提供位点,有利于在细胞质中的传递和稳定性。这种两端修饰过的RNA称为核 RNA(hRNA),只有经过内切核酸酶的加工才能成为mRNA,因此与原核生物相比多了一个调 节和控制步骤。 在真核微生物中同样存在转录控制。以酵母为例,已经证实细胞色素C基因(cyc1)和 与嘧啶生物合成有关的ura3基因都受到转录控制,存在着与原核生物中类似的操纵子,但 真核生物的操纵子一般都属于正控制。图9.2.4显示了酵母细胞中的半乳糖利用系统,该系 统包括三种酶:一种激酶(ga11)、尿嘧啶转移酶(gal9)、差向异构酶(gal10)和一种传递 蛋白的结构基因
7 转化为 D-木酮糖-5-磷酸有关的酶(araB、A 和 D)、两种传递酶及一种低分子量渗透酶(araE) 的结构基因, 操纵子的控制区如图 9.2.2 的放大部分所示。当 araC 基因表达的蛋白质是阻 遏蛋白构型(Crep)并与操纵子的活性位点结合时, 酶的结构基因转录不能进行，而且占据了 两个 cAMP/CRP 复合物的结合位点。加入诱导剂后, 使 C rep 改变成了活化型(Cind), cAMP/CRP 复合物也重新与操纵子结合, 在两者的共同作用下, 酶的转录开始。 图 9.2.3 Salmonella typhimurium 中酶合成的双操纵子自诱导模型 除了以上两类由诱导剂引起的酶合成调节机理外, 原核生物中还存在着自发的阻遏蛋 白-控制的诱导机制, 典型例子是在沙门氏菌 Salmonella typhimirium 中与组氨酸酶(hut) 有关的双操纵子模型(见图 9.2.3)。两个操纵子的核苷序列不完全相同, 右面操纵子与阻遏 蛋白的结合能力比左面的强 3-4 倍, 位于左面操纵子中的 hutC 基因编码阻遏蛋白, 该蛋白 与操纵子结合, 完全阻遏了右面操纵子的转录，但是左面的操纵子仍能够进行少量的转录。 由于细胞中总是存在着生理浓度的组氨酸及组氨酸酶, 因此会产生少量的尿狗酸, 尿狗酸则 是操纵子的诱导剂, 它使阻遏蛋白失活, 两个操纵子就能够启动结构基因的转录并导致酶蛋 白表达。与此同时, hutC 基因表达的阻遏蛋白量也增加, 因此系统将处于一个动态平衡中。 9.3.2 真核微生物产酶的基因水平调节和控制 真核微生物产酶的基因水平调节和控制与原核生物有很大的差别, 其调节和控制机理 也要复杂得多。 真核微生物 mRNA 的两端都经过了修饰, 其中 5’端是甲基化的核苷酸片段, 有一个含三 个磷酸基团的鸟嘌呤残基通过独特的 5’-5’键连接截断了 mRNA 最后第二个碱基。这个 5’-帽 通过削弱 5’外切核苷酸酶的活性从而加强了 mRNA 的稳定性, 有利于 7-甲基鸟嘌呤与核糖体 的结合，提高了翻译的效率。mRNA 的 3’端含有一个很长的腺苷残基(PolyA), 其功能是为蛋 白质的键合提供位点, 有利于在细胞质中的传递和稳定性。这种两端修饰过的 RNA 称为核 RNA(hmRNA), 只有经过内切核酸酶的加工才能成为 mRNA, 因此与原核生物相比多了一个调 节和控制步骤。 在真核微生物中同样存在转录控制。以酵母为例, 已经证实细胞色素 C 基因(cyc 1)和 与嘧啶生物合成有关的 ura 3 基因都受到转录控制, 存在着与原核生物中类似的操纵子, 但 真核生物的操纵子一般都属于正控制。图 9.2.4 显示了酵母细胞中的半乳糖利用系统, 该系 统包括三种酶: 一种激酶(gal 1)、尿嘧啶转移酶(gal 9)、差向异构酶(gal 10)和一种传递 蛋白的结构基因
80(1) 81(c),a4 阻 21 a110 激囌 转穗 差向异构孽 图924酵母细胞中半乳糖利用系统 该系统的调节基因是:gal4、80(i)和81(c),其中基因80(i)编码的阻遏蛋白将遏制 基因81(c),基因81(c)和gal4组成了一个操纵子。gal4编码的蛋白则对三种酶的结构 基因都具有激活作用 链孢霉 Neurospora cras能够用于胞外碱性蛋白酶的生产,产酶的控制机理非常复 杂,低浓度的蛋白质能够诱导产酶,氮源、硫源和碳源分别通过各自的调节基因(∝ys3、am 和一个未知基因)对酶的合成进行控制,只有当链孢霉处于氮、硫或碳飢饿状态时才能解除 阻遏,开始合成碱性蛋白酶 通过基因水平酶合成调节和控制机理的研究可以为产酶菌种的选育和产酶工艺条件的 优化提供方向,这样就能够大大加快菌种选育的进度,并大幅度提高酶的产量 9.3微生物中酶生物合成调节和控制在菌种选育中的应用 9.3.1产酶菌种的筛选 产酶菌种的筛选是酶制剂工业化生产的第一步,也是最关键的一步。已知的产酶菌种 可以从菌种库或从事该种酶硏究的科硏单位获得。如果没有这样的条件,就必须从自然界筛 选。对于水解酶,可以从具有水解酶产生条件的工厂或场所附近的土样中筛选,例如:从酿 造厂附近的土样中可以筛选得到产淀粉酶活力较高的菌株;从腐烂的木材中能够筛选到产纤 维素酶的菌株等。筛选用的培养基中应该含有这种酶所催化反应的底物或诱导物,最好能够 用简便的方法鉴别出产物生成,如:透明圈法、变色圈法等,以提高筛选工作的效率。但是 也有例外,例如有些蛋白酶生产菌(B. licheniformis)的透明圈很小而液体深层发酵的产酶 水平却很高。 9.32微生物产酶的诱导及组成型变异株的选育 许多微生物虽然具有目的酶的结构基因,但是如果培养基中不含该酶所催化反应的底 物,结构基因将处于无活性状态,即酶的合成受到阻遏。一旦加入底物,结构基因将被激活, 酶的合成开始。这种现象称为“诱导”,这种酶称为“诱导酶( Induced enzyme)”。许多参与 分解代谢的酶都属于诱导酶,诱导剂一般是该酶所催化反应的底物。例如:淀粉或糊精能够 诱导淀粉酶的产生;蔗糖是转化酶的诱导剂:尿素则是脲酶的诱导剂等。某些诱导剂的诱导 作用非常强,半乳糖苷可以使E.coli产生β-半乳糖苷酶的活力提高约1,000倍,该酶在 E.coli细胞中的含量可以达到胞内蛋白质总量的百分之几 些底物的类似物对酶来说是无活性或低活性的,但是往往具有很强的产酶诱导作用 表9.3.1列出了一些典型的底物类似物。除了底物外,有些酶催化反应的产物也能够起诱导 作用,表9.3.2列出了一些产物诱导产酶的例子
8 图 9.2.4 酵母细胞中半乳糖利用系统 该系统的调节基因是: gal 4、80(i)和 81(c), 其中基因 80(i)编码的阻遏蛋白将遏制 基因 81(c), 基因 81(c)和 gal 4 组成了一个操纵子。gal 4 编码的蛋白则对三种酶的结构 基因都具有激活作用。 链孢霉 Neurospora crassa 能够用于胞外碱性蛋白酶的生产, 产酶的控制机理非常复 杂, 低浓度的蛋白质能够诱导产酶, 氮源、硫源和碳源分别通过各自的调节基因(cys 3、amr 和一个未知基因)对酶的合成进行控制, 只有当链孢霉处于氮、硫或碳飢饿状态时才能解除 阻遏, 开始合成碱性蛋白酶。 通过基因水平酶合成调节和控制机理的研究可以为产酶菌种的选育和产酶工艺条件的 优化提供方向, 这样就能够大大加快菌种选育的进度, 并大幅度提高酶的产量。 9．3 微生物中酶生物合成调节和控制在菌种选育中的应用 9.3.1 产酶菌种的筛选 产酶菌种的筛选是酶制剂工业化生产的第一步，也是最关键的一步。已知的产酶菌种 可以从菌种库或从事该种酶研究的科研单位获得。如果没有这样的条件，就必须从自然界筛 选。对于水解酶，可以从具有水解酶产生条件的工厂或场所附近的土样中筛选，例如：从酿 造厂附近的土样中可以筛选得到产淀粉酶活力较高的菌株；从腐烂的木材中能够筛选到产纤 维素酶的菌株等。筛选用的培养基中应该含有这种酶所催化反应的底物或诱导物，最好能够 用简便的方法鉴别出产物生成，如：透明圈法、变色圈法等，以提高筛选工作的效率。但是 也有例外，例如有些蛋白酶生产菌(B. licheniformis)的透明圈很小而液体深层发酵的产酶 水平却很高。 9.3.2 微生物产酶的诱导及组成型变异株的选育 许多微生物虽然具有目的酶的结构基因，但是如果培养基中不含该酶所催化反应的底 物，结构基因将处于无活性状态，即酶的合成受到阻遏。一旦加入底物，结构基因将被激活， 酶的合成开始。这种现象称为“诱导”，这种酶称为“诱导酶(Induced enzyme)”。许多参与 分解代谢的酶都属于诱导酶，诱导剂一般是该酶所催化反应的底物。例如：淀粉或糊精能够 诱导淀粉酶的产生；蔗糖是转化酶的诱导剂；尿素则是脲酶的诱导剂等。某些诱导剂的诱导 作用非常强，半乳糖苷可以使 E. coli 产生-半乳糖苷酶的活力提高约 1,000 倍，该酶在 E. coli 细胞中的含量可以达到胞內蛋白质总量的百分之几。 一些底物的类似物对酶来说是无活性或低活性的, 但是往往具有很强的产酶诱导作用。 表 9.3.1 列出了一些典型的底物类似物。除了底物外，有些酶催化反应的产物也能够起诱导 作用，表 9.3.2 列出了一些产物诱导产酶的例子
表9.3.1底物类似物诱导产酶 底物 底物类似物诱导剂 β-半乳糖苷酶 乳糖 异丙基βD硫代半乳糖苷 青霉素β内酰胺酶 苄基青霉素 甲氧基苯青霉素 cis- trans异构酶马来酸 二酸 脂族酰胺酶 乙酰胺 酪氨酸酶 L-酪氨酸 D-酪氨酸,D苯丙氨酸 纤维素酶 槐二糖 表9.3.2产物诱导产藤 微生物 底物 产物诱导剂 糖化酶 Aspergillus niger 麦芽糖,异麦芽糖 淀粉酶 淀粉 麦芽糊精 stearothermophilus 葡聚糖酶 Penicillum sp 糊精 异麦芽糖 支链淀粉酶 Klebsiella aerogenes支链淀粉 麦芽糖 脂肪酸 内切聚半乳糖醛酸酶 外切聚半乳糖醛酸酶| Acrocylindrium sp. 聚半乳糖醛酸半乳糖醛酸 果胶脂酶 氨酸氧化 Pseudomonas sp. 色氨酸 犬尿氨酸 组氨酸酶 Klebsiella aerogenes组氨酸 尿犬酸 尿素羧化酶 Saccharomyces cerevisiae尿素 脲基甲酸 有些辅酶也能够诱导酶的产生,例如,在培养基中添加维生素B可以增加丙酮酸脱羧 酶的产量:维生素B的加入则会起到强化酪氨酸苯酚裂合酶的产生。 通过诱变育种方法可以消除微生物产酶对诱导剂的依赖性。诱变的目的是使酶合成的调 节基因发生突变,但是不会影响结构基因,因此这样的诱变育种方法又称为调节突变。调节 突变的机理一种是通过调节基因的突变,消除了阻遏酶合成阻遏蛋白的能力:第二种机理是 使操纵子基因发生突变,从而防止了操纵子基因与阻遏蛋白的键合,这样即使能够在胞内合 成阻遏蛋白,但调节酶合成的操纵子无法启动,酶就能够被大量合成。一种本来需要诱导剂 诱导才能产酶的微生物,经过诱变育种后不再需要诱导剂的突变菌株称为组成型变异株。这 类变异株的选育方法很多,下面是几个诱变育种的成功实例:1)经过诱变处理的Ecol 在恒化器中进行培养,通过进口培养基中限制加入诱导剂β-半乳糖苷, Novick和 Horiuchi 筛选出了不需要加入诱导剂就能够产生高水平β-半乳糖苷酶的变异株:2)在只含有一种碳 源(不是诱导剂)的平板上筛选出产酶的变异株,利用这种方法, Jayaraman等人用2-硝基 苯-α-1-阿拉伯糖苷为唯一碳源筛选出了β-半乳糖苷酶的变异株: Hynes和 Pateman用类 似的方法以丙烯酰胺为唯一氮源筛选出了产乙酰胺酶的变异株。 9.3.3酶合成的反馈阻遏及其解除 某些酶能够在细胞的生长过程中合成,但是随着代谢途径中终端产物的结累或者在培 养介质中加入该物质,酶的合成将受到阻遏。这种低分子量的终端产物(或称为共阻遏物) 会与一种胞内蛋白质(阻遏物蛋白)结合,然后被调节基因编码,产生阻遏物,该阻遏物就 会切断结构基因对酶蛋白的表达。这类酶称为可阻遏的酶 催化分解代谢的一些酶会受到直接或间接产物的阻遏。图9.3.1显示了纤维素酶的调
9 表 9.3.1 底物类似物诱导产酶 酶 底物 底物类似物诱导剂 -半乳糖苷酶 乳糖 异丙基--D-硫代半乳糖苷 青霉素-内酰胺酶 苄基青霉素 二甲氧基苯青霉素 马来酸 cis-trans 异构酶 马来酸 丙二酸 脂族酰胺酶 乙酰胺 N-甲基乙酰胺 酪氨酸酶 L-酪氨酸 D-酪氨酸，D-苯丙氨酸 纤维素酶 纤维素 槐二糖 表 9.3.2 产物诱导产酶 酶 微生物 底物 产物诱导剂 糖化酶 Aspergillus niger 淀粉 麦芽糖，异麦芽糖 淀粉酶 Bacillus stearothermophilus 淀粉 麦芽糊精 葡聚糖酶 Penicillum sp. 糊精 异麦芽糖 支链淀粉酶 Klebsiella aerogenes 支链淀粉 麦芽糖 脂酶 Geotrichum candidum 脂肪 脂肪酸 内切聚半乳糖醛酸酶 外切聚半乳糖醛酸酶 果胶脂酶 Acrocylindrium sp. 聚半乳糖醛酸 半乳糖醛酸 色氨酸氧化酶 Pseudomonas sp. 色氨酸 犬尿氨酸 组氨酸酶 Klebsiella aerogenes 组氨酸 尿犬酸 尿素羧化酶 Saccharomyces cerevisiae 尿素 脲基甲酸 有些辅酶也能够诱导酶的产生，例如，在培养基中添加维生素 B1 可以增加丙酮酸脱羧 酶的产量；维生素 B6 的加入则会起到强化酪氨酸苯酚裂合酶的产生。 通过诱变育种方法可以消除微生物产酶对诱导剂的依赖性。诱变的目的是使酶合成的调 节基因发生突变，但是不会影响结构基因，因此这样的诱变育种方法又称为调节突变。调节 突变的机理一种是通过调节基因的突变，消除了阻遏酶合成阻遏蛋白的能力；第二种机理是 使操纵子基因发生突变，从而防止了操纵子基因与阻遏蛋白的键合, 这样即使能够在胞内合 成阻遏蛋白, 但调节酶合成的操纵子无法启动, 酶就能够被大量合成。一种本来需要诱导剂 诱导才能产酶的微生物, 经过诱变育种后不再需要诱导剂的突变菌株称为组成型变异株。这 类变异株的选育方法很多，下面是几个诱变育种的成功实例: 1）经过诱变处理的 E.coli 在恒化器中进行培养，通过进口培养基中限制加入诱导剂-半乳糖苷，Novick 和 Horiuchi 筛选出了不需要加入诱导剂就能够产生高水平-半乳糖苷酶的变异株；2）在只含有一种碳 源（不是诱导剂）的平板上筛选出产酶的变异株，利用这种方法，Jayaraman 等人用 2-硝基 苯--1-阿拉伯糖苷为唯一碳源筛选出了-半乳糖苷酶的变异株； Hynes 和 Pateman 用类 似的方法以丙烯酰胺为唯一氮源筛选出了产乙酰胺酶的变异株。 9.3.3 酶合成的反馈阻遏及其解除 某些酶能够在细胞的生长过程中合成，但是随着代谢途径中终端产物的结累或者在培 养介质中加入该物质，酶的合成将受到阻遏。这种低分子量的终端产物（或称为共阻遏物） 会与一种胞内蛋白质（阻遏物蛋白）结合，然后被调节基因编码，产生阻遏物，该阻遏物就 会切断结构基因对酶蛋白的表达。这类酶称为可阻遏的酶。 催化分解代谢的一些酶会受到直接或间接产物的阻遏。图 9.3.1 显示了纤维素酶的调
节模型。从图中可以看到,胞内的纤维二糖诱导纤维素酶的合成,而胞内的葡萄糖会阻遏纤 维素酶基因的转录和翻译。此外,纤维二糖的水解产物葡萄糖和葡萄糖的氧化产物葡萄糖酸 内脂及葡萄糖酸对葡萄糖苷酶存在反馈抑制,因此有利于纤维素酶的合成。分泌到胞外的纤 维素酶催化纤维素底物水解,产生胞外纤维二糖,而胞外纤维二糖必须通过主动输送才能进 入胞内并进一步水解为葡萄糖。可以预料,跨膜输送对纤维素酶的合成也将具有重要的作 在纤维素酶的工业化生产实践中,已经证明在培养基中添加表面活性剂(如吐温-80)会 著提高纤维素酶的产量。 培养介质细胞壁 细胞质 抑制 葡萄糖 送 i萄糖苷酶葡萄糖氧化酶 纤缂二糖 葡菊糖 葡糖酸内脂+葡糖酸 诱冄削 诱导剂阻遏 剂蛋白质 纤维素 导___阻遏 转录和翻译 胞外纤维素 细胞结合的纤维素酶 图9.3.1 Trichoderma viride纤维素酶合成的调节模型 虽然蛋白酶是由氨基酸合成的,但是蛋白酶的生物合成却受到氨基酸的阻遏。如果在 培养基中含有氨基酸,细菌产蛋白酶的能力就很差:反之,不加氨基酸时却会大幅度提高蛋 白酶产量。已经有实验事实证明氨基酸的存在对细胞膜的渗透性有影响,妨碍了蛋白酶的释 放。也有一些实验证明氨基酸的阻遏作用发生在转录水平,而且可能与细菌中mRNA的存在 形式有关 对于尿酶、硝酸还原酶、核糖核酸酶及精氨酸酶而言,因为这些酶能够催化含氮化合 物的降解生成氨,在培养介质中限制氨的加入将有利于酶的合成。在利用 Bacillus licheniformis生产谷氨酸脱氢酶时,因为谷氨酸是该酶催化反应的产物,在培养基中添加 谷氨酸无疑会增加胞内谷氨酸浓度,加重反馈抑制作用。如果用葡萄糖或马来酸代替谷氨酸 或酪蛋白水解液作为碳源,就能使谷氨酸脱氢酶的产量提高约20倍。为了避免终端氨基酸 产物在胞内积累,可以在培养基中加入该氨基酸代谢途径中某些关键酶的抑制剂,例如在微 生物培养基中加入2-噻唑丙氨酸可以使细胞中参与组氨酸合成的十种酶的活力降低约30 倍 种更为有效的避免终端产物在胞内积累的方法是选育营养缺陷型菌株。这样,只要 限制供给营养缺陷型菌株必须的生长因子,就能够降低胞内终端产物浓度,大幅度地提髙酶 的产量,表9.3.3列出了一些典型的例子。某些部分营养缺陷型菌株(即,能够在最低培养 基中缓慢生长而又能受到生长因子刺激生长的菌株)也能显著提高酶的产量,例如 Moved
10 节模型。从图中可以看到，胞内的纤维二糖诱导纤维素酶的合成，而胞内的葡萄糖会阻遏纤 维素酶基因的转录和翻译。此外，纤维二糖的水解产物葡萄糖和葡萄糖的氧化产物葡萄糖酸 内脂及葡萄糖酸对葡萄糖苷酶存在反馈抑制，因此有利于纤维素酶的合成。分泌到胞外的纤 维素酶催化纤维素底物水解，产生胞外纤维二糖，而胞外纤维二糖必须通过主动输送才能进 入胞内并进一步水解为葡萄糖。可以预料，跨膜输送对纤维素酶的合成也将具有重要的作用。 在纤维素酶的工业化生产实践中，已经证明在培养基中添加表面活性剂（如吐温-80）会显 著提高纤维素酶的产量。 图 9.3.1 Trichoderma viride 纤维素酶合成的调节模型 虽然蛋白酶是由氨基酸合成的, 但是蛋白酶的生物合成却受到氨基酸的阻遏。如果在 培养基中含有氨基酸，细菌产蛋白酶的能力就很差；反之, 不加氨基酸时却会大幅度提高蛋 白酶产量。已经有实验事实证明氨基酸的存在对细胞膜的渗透性有影响, 妨碍了蛋白酶的释 放。也有一些实验证明氨基酸的阻遏作用发生在转录水平，而且可能与细菌中 mRNA 的存在 形式有关。 对于尿酶、硝酸还原酶、核糖核酸酶及精氨酸酶而言，因为这些酶能够催化含氮化合 物的降解生成氨，在培养介质中限制氨的加入将有利于酶的合成。在利用 Bacillus licheniformis 生产谷氨酸脱氢酶时，因为谷氨酸是该酶催化反应的产物，在培养基中添加 谷氨酸无疑会增加胞内谷氨酸浓度，加重反馈抑制作用。如果用葡萄糖或马来酸代替谷氨酸 或酪蛋白水解液作为碳源，就能使谷氨酸脱氢酶的产量提高约 20 倍。为了避免终端氨基酸 产物在胞内积累，可以在培养基中加入该氨基酸代谢途径中某些关键酶的抑制剂，例如在微 生物培养基中加入 2-噻唑丙氨酸可以使细胞中参与组氨酸合成的十种酶的活力降低约 30 倍。 一种更为有效的避免终端产物在胞内积累的方法是选育营养缺陷型菌株。这样，只要 限制供给营养缺陷型菌株必须的生长因子，就能够降低胞内终端产物浓度，大幅度地提高酶 的产量，表 9.3.3 列出了一些典型的例子。某些部分营养缺陷型菌株（即，能够在最低培养 基中缓慢生长而又能受到生长因子刺激生长的菌株）也能显著提高酶的产量，例如 Moyed 培养介质 细胞壁 细胞质 反馈抑制 葡萄糖 主动输送 葡萄糖苷酶 葡萄糖氧化酶 纤维二糖 纤维二糖 葡萄糖 葡糖酸内脂+葡糖酸 反馈抑制 诱导剂 诱导剂-阻遏 剂蛋白质 纤维素 诱导 阻遏 转录和翻译 酶释放 胞外纤维素酶 细胞结合的纤维素酶
