五章微生物的菌种选育 第五章微生物的菌种选育 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键,要使发酵工业产品的种类、产量和质量 有较大的改善,首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求 (1)遗传性状稳定 (2)生长速度快,不易被噬菌体等污染; 3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率; (4)目标产物最好能分泌到胞外,以降低产物抑制并利于产物分离; (5)尽可能减少产物类似物的产量,以提高目标产物的产量及利于产物分离 (6)培养基成分简单、来源广、价格低廉 (7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感; (8)对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及根据遗传学基础理论和方法 人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等 技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位,其中通过分子生物学手段 定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然,菌种选育的前提条件是从自然 界获得相应的原始菌种 5.1从自然界中获得新菌种 自然界中微生物资源极其丰富,土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的 主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多,至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物 的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件(高热、高压、低温、强碱、强酸及高 渗透压等)下生存的角度分析,微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研 究工作的不断深入,微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来,因此必须要有快 速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图5.11。 从以上表解可知,分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测 定等步骤 5.1.1采样 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素,确 定具体的时间、环境和目标物。 土壤是微生物的大本营,菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层,常以细菌和放线菌 为主:果园树根土层中,酵母菌含量较高;动植物残体及霉腐土层中,分布着较多的霉菌 此外,豆科植物根系土中,往往存在根瘤菌;河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌;油田 和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养 分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布,故在采土样时应予以重视。采 土样地点选好后,用小铲子去除表土,取离地面5~15cm处的土样几克,盛于预先灭菌的牛 皮纸袋中扎紧,并标明时间、地点和环境等情况,以备查考
第五章 微生物的菌种选育 1 第五章 微生物的菌种选育 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量 有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求： (1) 遗传性状稳定； (2) 生长速度快，不易被噬菌体等污染； (3) 目标产物的产量尽可能接近理论转化率； (4) 目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离； (5) 尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离； (6) 培养基成分简单、来源广、价格低廉； (7) 对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感； (8) 对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。 菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法， 人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等 技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段， 定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然，菌种选育的前提条件是从自然 界获得相应的原始菌种。 5.1 从自然界中获得新菌种 自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的 主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多，至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物 的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件（高热、高压、低温、强碱、强酸及高 渗透压等）下生存的角度分析，微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研 究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快 速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图 5.1.1。 从以上表解可知，分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测 定等步骤。 5.1.1 采样 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确 定具体的时间、环境和目标物。 土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌 为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。 此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田 和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养 分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。采 土样地点选好后，用小铲子去除表土，取离地面 515cm 处的土样几克，盛于预先灭菌的牛 皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考
第五章微生物的菌种选育 各种水体也是工业微生物菌种的重要来源,许多具有光合作用能力的微生物及兼性或 专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。 调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 屎相 确定特定的增殖条件 匾殖培 确定定性或半定量的快速检测方法 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛(快速检测或一菌株1摇瓶培养测定) 碲迟复筛(一菌株3~5摇瓶) ↓结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面(3~5菌株) 生产性能试验 性能鉴定 毒性试验 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株 图5.1.1典型的微生物采样和筛选方法 随着工业的发展,许多人工合成物排入环境中。有证据表明微生物正在“学习”代谢 这些陌生的非天然“营养物”。各种污染物,甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到 对应的微生物,如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢 霉、木霉、假单胞菌、无色杄菌和产碱菌等14个属,共计49个种。污染源附近的土壤 水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物 理想的采样地点。 5.1.2增殖 在采集的样品中,一般待分离的菌种在数量上并不占优势,为提高分离的效率,常以 投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质,使所需菌种的 数量相对增加,这种方法称为増殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变
第五章 微生物的菌种选育 2 各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或 专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。 图 5.1.1 典型的微生物采样和筛选方法 随着工业的发展，许多人工合成物排入环境中。有证据表明微生物正在“学习”代谢 这些陌生的非天然“营养物”。各种污染物，甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到 对应的微生物，如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢 霉、木霉、假单胞菌、无色杆菌和产碱菌等 14 个属，共计 49 个种。污染源附近的土壤、 水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物 理想的采样地点。 5.1.2 增殖 在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以 投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的 数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变 调查研究并充分查阅资料 设计试验方案 确定采样的生态环境 采样 确定特定的增殖条件 增殖培养 确定定性或半定量的快速检测方法 纯种分离 原种斜面 确定发酵的基本条件 初筛（快速检测或一菌株 1 摇瓶培养测定） 筛选 复筛（一菌株 3~5 摇瓶） 结合初步的工艺条件 再复筛 较优菌株斜面（3~5 菌株） 生产性能试验 性能鉴定 毒性试验 菌种鉴定 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株
五章微生物的菌种选育 为人工环境中的优势菌,便于将它们从样品中分离 5.1.3纯化 增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因 素,但其它微生物并没有死去,只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖 故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物 菌种,必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多,大体可将它们分为 个层次,一个层次较粗放,一般只能达到“菌落纯”的水平,从“种”的水平来说是纯的, 其方法有划线分离法,涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速,即用接种针挑 取微生物样品在固体培养基表面划线,适当条件下培养后,获得单菌落:涂布分离法与划 线法类似,用涂布棒蘸取培养液,或先将少量培养液滴在固体培养基表面,再用涂布棒在 固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀,获得纯种的机率较 大。该法是将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液(事先在培养液中加入无菌的玻璃 珠搅拌打散细胞团,再经过滤处理,效果更佳。)混匀后,再浇注成平板以获取单菌落。另 层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种 方法的具体操作的方法很多,最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分 离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌,则可 用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植,也可用无菌毛细管插入菌丝尖端 以获取单细胞。在具体的工作中,究竟采取哪种方法,应视微生物的实际情况和实验条件 而定 为了提高分离筛选工作的效率,除增殖培养时,应控制增殖条件外,在纯种分离时, 也应控制适宜的培养条件,并选用特异的检出方法和筛选方案 5.1.4性能鉴定 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以 淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株,它们都具备一些共性,但只有经过进 步的生产性能测定,才能确定哪些菌株更符合生产要求 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上,从自然界直接获得的野生型菌 种往往低产甚至不产所需的产物,只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产 所以,我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌 株 52基因突变和微生物菌种选育 5.2.1遗传的物质基础 在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任,是一个在历 史上争论了很久的问题。十九世纪50年代孟德尔( Gregor Mendel)提出是“因子”( factor) 行使着遗传功能,后来进一步确认因子就是摩尔根( Thomas Hunt Morgan)提出的“基因” (gene),并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的,生物体的 主要物质是蛋白质,但组成蛋白质的有20种氨基酸,它的排列组合方式是个天文数字。而 核酸只是由4种碱基构成的,与蛋白质相比,它的排列方式要简单得多。所以,当时人们
第五章 微生物的菌种选育 3 为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。 5.1.3 纯化 增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因 素，但其它微生物并没有死去，只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。 故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物 菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二 个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的， 其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑 取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划 线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在 固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较 大。该法是将降至 60℃左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃 珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。另 一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种 方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分 离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可 用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端， 以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件 而定。 为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时， 也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。 5.1.4 性能鉴定 菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以 淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一 步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。 直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌 种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。 所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌 株。 5.2 基因突变和微生物菌种选育 5.2.1 遗传的物质基础 在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任，是一个在历 史上争论了很久的问题。十九世纪 50 年代孟德尔(Gregor Mendel)提出是“因子”（factor） 行使着遗传功能，后来进一步确认因子就是摩尔根（Thomas Hunt Morgan）提出的“基因” （gene），并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的，生物体的 主要物质是蛋白质，但组成蛋白质的有 20 种氨基酸，它的排列组合方式是个天文数字。而 核酸只是由 4 种碱基构成的，与蛋白质相比，它的排列方式要简单得多。所以，当时人们
第五章微生物的菌种选育 自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪40年代,由于先后有 个著名实验的论证,人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质 5.2.1.1遗传物质化学本质的确证 1)肺炎链球菌转化实验 8 = RⅡ型活菌 健康 健康 ② 健康 病死 SⅢ型活菌 健康 健康 SⅢ型加热杀死 8 健康 疠死 RI型活菌 病死 8 混合培养 DNA分离 SⅢ型活菌 图5.2.1肺炎链球菌的转化现象 肺炎链球菌( Streptococcus pneumoniae),旧称肺炎双球菌( Diplococcus pneumoniae) 的菌体外有多糖的荚膜包围,它对菌体有保护作用,这种含有荚膜的菌株称为光滑型 ( Smooth,即S型),它可使人患肺炎,也可使小鼠患败血症而死亡,另有一类肺炎双球菌 的突变菌株,没有荚膜保护,称为粗糙型( Rough,即R型),它在动物体内易被吞噬细胞 吞噬,对动物不具毒力,不能杀死小鼠。1928年,英国医生格里菲斯( Griffith)发现将
第五章 微生物的菌种选育 4 自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪 40 年代，由于先后有三 个著名实验的论证，人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质。 5.2.1.1 遗传物质化学本质的确证 1) 肺炎链球菌转化实验 图 5.2.1 肺炎链球菌的转化现象 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）,旧称肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 的菌体外有多糖的荚膜包围，它对菌体有保护作用，这种含有荚膜的菌株称为光滑型 （Smooth，即 S 型），它可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡，另有一类肺炎双球菌 的突变菌株，没有荚膜保护，称为粗糙型（Rough，即 R 型），它在动物体内易被吞噬细胞 吞噬，对动物不具毒力，不能杀死小鼠。1928 年，英国医生格里菲斯（Griffith）发现将
五章微生物的菌种选育 血清ⅠI型的R型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的血清II型的S型菌株混合后,注射小鼠, 能毒死小鼠,并从死鼠血中可以分离到血清II型的S型菌株。这现象被认为是血清ⅠI 型的S型菌株使Ⅰ型R型菌株发生了转化( Transformation)。就是说血清I型的R型菌 株从己被杀死的血清III型的S型菌株中获得了遗传物质,见图5.2.1。 1944年艾弗里( Avery)证实了转化现象的化学本质。他将S型菌株中的蛋白质、核酸 和荚膜等成分分离纯化后,分别再与R型菌株混合,发现只有DNA才能使R型菌株转化成S 型菌株,分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子,进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖 和RNA无关,只与DM有关,而且DNMA纯度越高,转化效率也越高。其结果见表5.2.1。另 外,经元素分析、血清学分析和一系列物理特性(如超速离心、电泳、紫外吸收)等测定 的结果也证明DNA是遗传信息载体。DNA的转化效率是非常高的,已知其最低作用浓度为 1×10°μg/m1,这是目前任何化学方法都无法检出的浓度。 表5.2.1.肺炎链球菌S型菌株的细胞成分转化R型菌株(活)试验 田胞组分 处理条件 S菌的DNA 未处理 长出S型菌株 S菌的DNA 蛋白酶等(除DNA酶) 长出S型菌株 S菌的DNA NA酶 只长出R型菌株 S菌的RNA 未处理 只长出R型菌株 S菌的蛋白质 未处理 只长出R型菌株 S菌的荚膜多糖 未处理 只长出R型菌株
第五章 微生物的菌种选育 5 血清 II 型的 R 型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的血清 III 型的 S 型菌株混合后，注射小鼠， 能毒死小鼠，并从死鼠血中可以分离到血清 III 型的 S 型菌株。这现象被认为是血清 III 型的 S 型菌株使 II 型 R 型菌株发生了转化(Transformation)。就是说血清 II 型的 R 型菌 株从已被杀死的血清 III 型的 S 型菌株中获得了遗传物质，见图 5.2.1。 1944 年艾弗里（Avery）证实了转化现象的化学本质。他将 S 型菌株中的蛋白质、核酸 和荚膜等成分分离纯化后，分别再与 R 型菌株混合，发现只有 DNA 才能使 R 型菌株转化成 S 型菌株，分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子，进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖 和 RNA 无关，只与 DNA 有关，而且 DNA 纯度越高，转化效率也越高。其结果见表 5.2.1。另 外，经元素分析、血清学分析和一系列物理特性（如超速离心、电泳、紫外吸收）等测定 的结果也证明 DNA 是遗传信息载体。DNA 的转化效率是非常高的，已知其最低作用浓度为 110-5μg/ml，这是目前任何化学方法都无法检出的浓度。 表 5.2.1. 肺炎链球菌 S 型菌株的细胞成分转化 R 型菌株（活）试验 细胞组分 处理条件 结果 S 菌的 DNA S 菌的 DNA S 菌的 DNA S 菌的 RNA S 菌的蛋白质 S 菌的荚膜多糖 未处理 蛋白酶等（除 DNA 酶） DNA 酶 未处理 未处理 未处理 长出 S 型菌株 长出 S 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株 只长出 R 型菌株
五章微生物的菌种选育 用35S标记的噬菌体 用32P标记的噬菌体 闺甲p QEf ↓与细菌混合 与细菌混合 用捣碎器打散 用捣碎器打散 3d流体 oQ上清液(菌体) 含15%放射性 沉淀〈细菌) 含25%放射性 含85%放射性 图5.22侯喜一蔡斯( Hershey-Chase)的噬菌体感染试验示意图 2)噬菌体感染试验 1952年,侯喜( Hershey)和蔡斯( Chase)两人利用同位素对大肠杆菌噬菌体T2的吸 附、增殖和释放过程进行了示踪研究。因为蛋白质含有硫元素(S),不含磷元素(P),而 DNA含有磷元素(P),不含硫元素(S),所以可以用P或S标记T2的核酸或蛋白质,分别 得到P标记的T2和S标记的T2。将标记的噬菌体和大肠杆菌混合,经短时间(如10分钟) 保温后,T2完成了吸附和侵入过程,然后在组织捣碎机中剧烈搅拌,使吸附在菌体表面的噬 菌体外壳脱离细胞并均匀分布。接着进行离心沉淀,再分别测定沉淀物和上清液中的同位 素标记。结果发现,几乎所有的P都和细菌一起出现在沉淀物中,而几乎所有的S都在上 清液中,见图5.2.2。这意味着大肠杆菌噬菌体T侵染大肠杆菌时,噬菌体的蛋白外壳完全 留在菌体外,而只有DNA进入胞内。随后,菌体裂解释放出了具有与亲代同样蛋白质外壳 的完整的子代噬菌体,这说明了只有核酸才是其全部遗传信息的载体。 3)病毒重建实验弗朗克-康勒托( Fraenkel- Conrad)等于1956年在植物病毒领域中所 作的著名的病毒重建实验也证明了烟草花叶病毒(TMV)的主要感染成分是其核酸(这里是 RNA,因为该病毒不含DNA),而病毒的外壳主要是起保护核心RNA的作用 他们通过普通的TM与毒株霍氏车前花叶病毒(HR)的核酸和蛋白质的拆开和相互对 换重建的过程,同样令人信服地证实了核酸是TM的遗传物质基础
第五章 微生物的菌种选育 6 图 5.2.2 侯喜-蔡斯（Hershey-Chase）的噬菌体感染试验示意图 2) 噬菌体感染试验 1952 年，侯喜（Hershey）和蔡斯（Chase）两人利用同位素对大肠杆菌噬菌体 T2 的吸 附、增殖和释放过程进行了示踪研究。因为蛋白质含有硫元素（S），不含磷元素（P），而 DNA 含有磷元素（P），不含硫元素（S），所以可以用 P 32 或 S 35 标记 T2 的核酸或蛋白质，分别 得到 P 32 标记的 T2和 S 35 标记的 T2。将标记的噬菌体和大肠杆菌混合，经短时间(如 10 分钟) 保温后，T2 完成了吸附和侵入过程，然后在组织捣碎机中剧烈搅拌，使吸附在菌体表面的噬 菌体外壳脱离细胞并均匀分布。接着进行离心沉淀，再分别测定沉淀物和上清液中的同位 素标记。结果发现，几乎所有的 P 32 都和细菌一起出现在沉淀物中，而几乎所有的 S 35 都在上 清液中，见图 5.2.2。这意味着大肠杆菌噬菌体 T2 侵染大肠杆菌时，噬菌体的蛋白外壳完全 留在菌体外，而只有 DNA 进入胞内。随后，菌体裂解释放出了具有与亲代同样蛋白质外壳 的完整的子代噬菌体，这说明了只有核酸才是其全部遗传信息的载体。 3) 病毒重建实验 弗朗克-康勒托（Fraenkel-Conrat）等于 1956 年在植物病毒领域中所 作的著名的病毒重建实验也证明了烟草花叶病毒（TMV）的主要感染成分是其核酸（这里是 RNA，因为该病毒不含 DNA），而病毒的外壳主要是起保护核心 RNA 的作用。 他们通过普通的 TMV 与毒株霍氏车前花叶病毒（HR）的核酸和蛋白质的拆开和相互对 换重建的过程，同样令人信服地证实了核酸是 TMV 的遗传物质基础
五章微生物的菌种选育 普通TMV 2 去污剂处理 0 弱碱处理 3.杂种病毒 TMV抗体处理 HR抗体处理 杂种病 HR型彩症 被钝化 HR毒株的外 ④闺 壳和RNA 从病斑上再分离 出来的病毒颗粒 普通TMⅤ的 有fR的外壳和RNA 外壳和RNA 图5.23病毒拆开重建实验 烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理,可以将其蛋白外壳与RNA分开,重新将 蛋白外壳与RNA混合,病毒粒子又会重建。将普通的TMN外壳与毒株霍氏车前花叶病毒 的RNA混合构成杂种病毒,TMV抗体处理会使其钝化,不能引起病斑,而用⊕抗体处理, 则不会影响杂种病毒的感染性,这说明杂种病毒的外壳确实是TMV病毒的外壳。杂种病毒 感染烟草后,在烟叶上出现HR的病斑,而且从中分离到具H外壳的R病毒,这表明是TMV 的RNA、而不是蛋白质携带着病毒的所有遗传信息,见图52.3。 52.1.2核酸的结构与复制 核酸有二种类型,即DNA和RNA,它们都是由单核苷酸通过磷酸二酯键聚合而成的。核 苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。DNA具双螺旋结构:RNA大多单链只局部为双螺旋结构。DNA 的复制为半保留复制。在真核生物中,DNA复制有多个起点,即有数个复制叉,在原核生物 中,只有一个固定的复制起点。细菌的复制为双向复制。有些病毒如X174和噬菌体是以 滚环方式复制的。 基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位,是一个具有特定核苷酸顺序的 核酸片段,每个基因约有1000个碱基对,6.7×10道尔顿,即为一个冈崎片段。由于各种 微生物所含的核酸分子的大小不同,使得它所含基因的数量差异较大。大肠杆菌DNA中约 有7,500个基因,噬菌体T2约有360个基因,而最小的RMNA噬菌体MS2却只有三个基因 有关基因的概念和种类还在不断地更新和发展。例如:一个基因决定一个酶,一个基 因决定一个多肽,一个基因是一个交换单位或突变单位或重组单位或功能单位等:另外还
第五章 微生物的菌种选育 7 图 5.2.3 病毒拆开-重建实验 烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理，可以将其蛋白外壳与 RNA 分开，重新将 蛋白外壳与 RNA 混合，病毒粒子又会重建。将普通的 TMV 外壳与毒株霍氏车前花叶病毒 HR 的 RNA 混合构成杂种病毒，TMV 抗体处理会使其钝化，不能引起病斑，而用 HR 抗体处理， 则不会影响杂种病毒的感染性，这说明杂种病毒的外壳确实是 TMV 病毒的外壳。杂种病毒 感染烟草后，在烟叶上出现 HR 的病斑，而且从中分离到具 HR 外壳的 HR 病毒，这表明是 TMV 的 RNA、而不是蛋白质携带着病毒的所有遗传信息，见图 5.2.3。 5.2.1.2 核酸的结构与复制 核酸有二种类型，即 DNA 和 RNA，它们都是由单核苷酸通过磷酸二酯键聚合而成的。核 苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。DNA 具双螺旋结构；RNA 大多单链只局部为双螺旋结构。DNA 的复制为半保留复制。在真核生物中，DNA 复制有多个起点，即有数个复制叉，在原核生物 中，只有一个固定的复制起点。细菌的复制为双向复制。有些病毒如X174 和噬菌体是以 滚环方式复制的。 基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，是一个具有特定核苷酸顺序的 核酸片段，每个基因约有 1000 个碱基对，6.7105 道尔顿，即为一个冈崎片段。由于各种 微生物所含的核酸分子的大小不同，使得它所含基因的数量差异较大。大肠杆菌 DNA 中约 有 7,500 个基因，噬菌体 T2 约有 360 个基因，而最小的 RNA 噬菌体 MS2却只有三个基因。 有关基因的概念和种类还在不断地更新和发展。例如：一个基因决定一个酶，一个基 因决定一个多肽，一个基因是一个交换单位或突变单位或重组单位或功能单位等；另外还
第五章微生物的菌种选育 有一个基因是一个互补群:一个基因是一个顺反子等概念。基因的功能有明确的分工,如: 决定蛋白结构的结构基因,控制结构基因表达的调控基因,包括启动基因、操纵基因、调 节基因和抑制基因等。 总之,基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列(通常是指DNA 序列)。它包括编码蛋白质多肽链的核酸序列,也包括保证转录所必需的核酸调控序列以及 5和3端的非翻译序列 基因不仅存在在染色体上,还存在于细胞中的染色体外的遗传因子(质粒, Plasmid) 上,这些染色体外的遗传因子见图5.2.4 核染色体∫原核生物的染色体 真核生物的染色体 遗传物质类型 真核生物的“质粒”细胞质基因(质体)线粒体叶绿体 中心体动体 核外遗传因子 共生生物:卡巴颗粒 酵母菌:2um质粒 原核生物质粒F因子R因子(ol质粒Ti质粒, 巨大质粒,降解性质粒 图5.24染色体内和染色体外的遗传因子 质粒( plasmid)是游离于染色体外,具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA ( circular covalently closed dnA,或 CCcDNA),分子量变化较大,在10-10ta范围内 在细胞质中,环状质粒DNA自身卷曲,呈现超螺旋结构,见图5.2.5。只要两条链中的一条 链上有个切口,超螺旋就会变成一个开口的环形状态,若两条链上都有一个切口,就会变 成线性结构,线性状态的质粒DMA一般更容易整合到宿主DMA中。质粒携带着某些染色体 所没有的基因,赋予细菌等原核生物对其生存并非必不可少的某些特殊功能,如:接合、 产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解毒物等。质粒是一个复制子( replicon),它的复制若 与核染色体复制同步,称严紧型复制控制( Stringent replication control),一般细胞内 只含1~2个这种质粒:另一类质粒复制与核染色体复制不同步,称松驰型复制控制( Relaxed replication control),一般细胞内含10~15个甚至更多的这类质粒。少数质粒可以在不 同的菌株之间转移,如F因子和R因子等。含质粒的细胞遇丫啶类染料、丝裂霉素C、紫外 线、利福平、重金属离子或高温等因素处理时,由于质粒的复制受到抑制,而核染色体的 复制仍继续进行,可以使子代细胞中的质粒消除。某些质粒具有与核染色体DNA发生整合 的功能,如F因子,这类质粒称为附加体( Episome)。质粒还具有重组的功能,可在质粒 之间、质粒与核染色体之间发生重组。 整合( Integretion)则是指质粒、温和性噬菌体或转化因子等非染色体DM并入染色 体DNA中的过程。质粒有以下一些常见的类型: (1)F因子( fertility factor)或称为致育因子或性因子,它决定细菌的性别,与细菌
第五章 微生物的菌种选育 8 有一个基因是一个互补群；一个基因是一个顺反子等概念。基因的功能有明确的分工，如： 决定蛋白结构的结构基因，控制结构基因表达的调控基因，包括启动基因、操纵基因、调 节基因和抑制基因等。 总之，基因是合成有功能的蛋白质多肽链或 RNA 所必需的全部核酸序列（通常是指 DNA 序列）。它包括编码蛋白质多肽链的核酸序列，也包括保证转录所必需的核酸调控序列以及 5’和 3’端的非翻译序列。 基因不仅存在在染色体上，还存在于细胞中的染色体外的遗传因子（质粒, Plasmid） 上，这些染色体外的遗传因子见图 5.2.4。 图 5.2.4 染色体内和染色体外的遗传因子 质粒（plasmid）是游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状 DNA （circular covalently closed DNA ，或 cccDNA)，分子量变化较大，在 106 108 Da 范围内。 在细胞质中，环状质粒 DNA 自身卷曲，呈现超螺旋结构，见图 5.2.5。只要两条链中的一条 链上有个切口，超螺旋就会变成一个开口的环形状态，若两条链上都有一个切口，就会变 成线性结构，线性状态的质粒 DNA 一般更容易整合到宿主 DNA 中。质粒携带着某些染色体 所没有的基因，赋予细菌等原核生物对其生存并非必不可少的某些特殊功能，如：接合、 产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解毒物等。质粒是一个复制子(replicon)，它的复制若 与核染色体复制同步，称严紧型复制控制(Stringent replication control)，一般细胞内 只含 12 个这种质粒；另一类质粒复制与核染色体复制不同步，称松驰型复制控制(Relaxed replication control)，一般细胞内含 1015 个甚至更多的这类质粒。少数质粒可以在不 同的菌株之间转移，如 F 因子和 R 因子等。含质粒的细胞遇丫啶类染料、丝裂霉素 C、紫外 线、利福平、重金属离子或高温等因素处理时，由于质粒的复制受到抑制，而核染色体的 复制仍继续进行，可以使子代细胞中的质粒消除。某些质粒具有与核染色体 DNA 发生整合 的功能，如 F 因子，这类质粒称为附加体（Episome）。质粒还具有重组的功能，可在质粒 之间、质粒与核染色体之间发生重组。 整合（integretion）则是指质粒、温和性噬菌体或转化因子等非染色体 DNA 并入染色 体 DNA 中的过程。质粒有以下一些常见的类型： （1）F 因子（fertility factor） 或称为致育因子或性因子，它决定细菌的性别，与细菌 核染色体 原核生物的染色体 真核生物的染色体 遗传物质类型 真核生物的“质粒” 细胞质基因（质体）线粒体 叶绿体 中心体 动体 核外遗传因子 共生生物：卡巴颗粒 酵母菌：2m 质粒 原核生物质粒 F 因子 R 因子 Col 质粒 Ti 质粒， 巨大质粒，降解性质粒
五章微生物的菌种选育 接合作用有关。分子量62×10Da,约等于核染色体DNA的2%,它足以编码94个中等大小的 多肽,而其中三分之一的基因与接合作用有关。 (2)R因子( resistance factor)又称抗药性质粒,是分布最广、研究得最充分的质 粒之一。它能赋予宿主抵抗各种抗生素或生长抑制剂的功能。研究表明,细菌的耐抗生素 的性状主要是由于R因子在菌株之间迅速转移所致 双螺旋共价闭合环 (超螺旋) 1一个裂口 开环双螺旋 两个裂口 线状双螺旋 图5.25DNA的三种存在形式 多数R因子是由相连的二个DNA片段组成,其一称RTF质粒( resistance transfer factor,抗性转移因子),它含调节DNA复制和转移的基因;其二是抗性决定质粒 (r- determinant),含有抗性基因,如:青霉素抗性(pen'),氨苄青霉素抗性(Am),氯 霉素抗性(Cam),四环素抗性(Str),卡那霉素抗性(Kan')及磺胺药物抗性(SuI)等。 由RTF质粒和抗性决定质粒结合而形成R因子的过程见图5.2.6。 RFT质粒 r决定质粒 含转移和复制基因)(含抗药性基因〕 R因子(R质粒 图52.6R因子的结构组成(IS因子为转座因子,它可使RTF质粒与r决定质粒结合) 此外,R因子能自行重组,即来自两种不同耐药菌株的R因子基因整合在一起,构成 多重耐药菌株。R因子也是借助性线毛进行接合而传递的,在R因子和F因子之间也能发生
第五章 微生物的菌种选育 9 接合作用有关。分子量 62106 Da，约等于核染色体 DNA 的 2%，它足以编码 94 个中等大小的 多肽，而其中三分之一的基因与接合作用有关。 （2）R 因子（resistance factor）又称抗药性质粒，是分布最广、研究得最充分的质 粒之一。它能赋予宿主抵抗各种抗生素或生长抑制剂的功能。研究表明，细菌的耐抗生素 的性状主要是由于 R 因子在菌株之间迅速转移所致。 图 5.2.5 DNA 的三种存在形式 多数 R 因子是由相连的二个 DNA 片段组成，其一称 RTF 质粒（resistance transfer factor, 抗性转移因子），它含调节 DNA 复制和转移的基因；其二是抗性决定质粒 （r-determinant），含有抗性基因，如：青霉素抗性（pen r），氨苄青霉素抗性（Ampr），氯 霉素抗性（Camr），四环素抗性（Strr），卡那霉素抗性（Kanr）及磺胺药物抗性（Sulr）等。 由 RTF 质粒和抗性决定质粒结合而形成 R 因子的过程见图 5.2.6。 图 5.2.6 R 因子的结构组成（IS 因子为转座因子，它可使 RTF 质粒与 r 决定质粒结合） 此外，R 因子能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的 R 因子基因整合在一起，构成 多重耐药菌株。R 因子也是借助性线毛进行接合而传递的，在 R 因子和 F 因子之间也能发生
第五章微生物的菌种选育 重组,但R因子不能整合到核染色体上,所以它不是附加体而是一种稳定的质粒。 R因子在细胞内的数量可从1至2个到几十个不等,分属严紧型和松弛型复制控制。后 者经氯霉素处理后,拷贝数甚至可达2000-3000个。因为R因子对多种抗生素有抗性,因 此,可作为菌株筛选时的遗传标记,也可用作基因转移的载体。 (3)col因子( Colicinogenic factor)又称为产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生使 其它原核生物致死的蛋白质类细菌毒素。Col因子是控制这类细菌毒素产生的质粒。大肠杆 菌素( colicin)是一种由大肠杆菌的某些菌株所分泌的细菌毒素,它能通过抑制复制、转录、 翻译或能量代谢等而专一性地杀死其它肠道细菌,其分子量约4×10°~810Da,负责编码大 肠杆菌素。Col因子分两类,分别以ColE1和 Colle为代表。前者分子量小,约为5×10Da 是多拷贝和非转移性的:后者的分子量约为80×105Da,只有1~2个拷贝,可通过性线毛转 移。但由于Col因子有较弱的阻遏系统,它不能象F因子或R因子那样在群体中快速传播。 凡带Col因子的菌株,由于质粒本身编码一种免疫蛋白,从而对大肠杆菌素有免疫作 用,不受其伤害 (4)∏质粒( Tumor inducing plasmid)或称诱癌质粒。细菌侵入植物细胞后,细菌溶解, Tⅰ质粒与植物细胞核染色体发生整合,破坏控制细胞分裂的激素调节系统,从而使植物细 胞转变成癌细胞,(双子叶植物的根瘤)。Ti质粒长200kb,是大型质粒,当前T质粒已成 为植物遗传工程研究的重要载体,一些具重要性状的外源基因可借DNA重组技术插入到T 质粒中,并进一步使之整合到植物染色体上,以改变植物的遗传性,达到培育植物优良品 种的目的。 (5)巨大质粒(mega质粒)为近年来在根瘤菌属( Rhizobium)中发现的一种质粒,分子 量为200~300X10°Da,比一般的质粒大几十倍至几百倍,故称巨大质粒。质粒上有一系列固 氮基因。 (6)降解性质粒只在假单胞菌属( Pseudomonas)中发现。它们的降解性质粒可为一系列 能降解复杂物质的酶编码,从而能利用一般细菌所难以分解的物质为碳源。这些质粒以其 所分解的底物命名,例如有CAM(分解樟脑)质粒,OCT(辛烷)质粒,XYL(二甲苯)质粒, SAL(水杨酸)质粒,ML(扁桃酸)质粒,NAP(萘)质粒和ToL(甲苯)质粒等 有关质粒的起源众说纷纭。它可能是从原噬菌体演化来的,但也可能是一个相反的过 程。质粒与噬菌体之间有很多相似之处,见表5.2.2。 表5.22.质粒与噬菌体的特征比较 [质粒 噬菌体 F因子R因子Co01因子温和性「烈性 独立复制 经细胞间接触而转移 或 能整合到核染色体 能获得宿主染色体基因 5.2.2基因突变 突变( Mutation)指生物的遗传性突然发生变异,并影响生物正常遗传的表型和性状 的现象。这种突变是突然发生的,可遗传的
第五章 微生物的菌种选育 10 重组，但 R 因子不能整合到核染色体上，所以它不是附加体而是一种稳定的质粒。 R 因子在细胞内的数量可从 1 至 2 个到几十个不等，分属严紧型和松弛型复制控制。后 者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达 2000-3000 个。因为 R 因子对多种抗生素有抗性，因 此，可作为菌株筛选时的遗传标记，也可用作基因转移的载体。 （3）Col 因子（Colicinogenic factor）又称为产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生使 其它原核生物致死的蛋白质类细菌毒素。Col 因子是控制这类细菌毒素产生的质粒。大肠杆 菌素(colicin)是一种由大肠杆菌的某些菌株所分泌的细菌毒素，它能通过抑制复制、转录、 翻译或能量代谢等而专一性地杀死其它肠道细菌, 其分子量约 4104 8104 Da，负责编码大 肠杆菌素。Col 因子分两类，分别以 ColE1 和 ColIb 为代表。前者分子量小，约为 5106 Da， 是多拷贝和非转移性的；后者的分子量约为 80106 Da，只有 12 个拷贝，可通过性线毛转 移。但由于 Col 因子有较弱的阻遏系统，它不能象 F 因子或 R 因子那样在群体中快速传播。 凡带 Col 因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作 用，不受其伤害。 （4）Ti 质粒（Tumor inducing plasmid）或称诱癌质粒。细菌侵入植物细胞后，细菌溶解， Ti 质粒与植物细胞核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使植物细 胞转变成癌细胞，（双子叶植物的根瘤）。Ti 质粒长 200kb，是大型质粒，当前 Ti 质粒已成 为植物遗传工程研究的重要载体，一些具重要性状的外源基因可借 DNA 重组技术插入到 Ti 质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变植物的遗传性，达到培育植物优良品 种的目的。 （5）巨大质粒（mega 质粒）为近年来在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子 量为 200300X106 Da，比一般的质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒。质粒上有一系列固 氮基因。 （6）降解性质粒 只在假单胞菌属(Pseudomonas)中发现。它们的降解性质粒可为一系列 能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质为碳源。这些质粒以其 所分解的底物命名，例如有 CAM（分解樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒， SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和 TOL（甲苯）质粒等。 有关质粒的起源众说纷纭。它可能是从原噬菌体演化来的，但也可能是一个相反的过 程。质粒与噬菌体之间有很多相似之处，见表 5.2.2。 表 5.2.2. 质粒与噬菌体的特征比较 质粒 噬菌体 F 因子 R 因子 Col 因子 温和性 烈性 独立复制 经细胞间接触而转移 能整合到核染色体 能获得宿主染色体基因 + + + + + + - - + +或- - - + +或- + + + - - - 5.2.2 基因突变 突变（Mutation）指生物的遗传性突然发生变异，并影响生物正常遗传的表型和性状 的现象。这种突变是突然发生的，可遗传的