《工业微生物学》第三章 33微生物的培养方法 微生物培养就是提供一个适宜特定微生物生长的理化环境,使其大量地繁殖。微生 物培养的目的各有不同,有些是以大量增殖微生物菌体为目标(如单细胞蛋白或胞内产 物),有些则是希望在微生物生长的同时,实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目 标的不同,在培养方法上也就存在许多差别。让所需的微生物大量繁殖,并进而产生大 量目标代谢产物的过程称为微生物发酵,这尤其是指工业上大规模的微生物培养。“培 养”和“发酵”两个概念经常是通用的,但它们与生物氧化中的“发酵”概念是截然不 同的。 从历史发展的角度来看,微生物培养技术的发展主要有以下特点 (1)从少量培养发展到大规模培养。 (2)从浅盘培养发展到厚层固体或深层(液体)培养。 (3)从以固体培养为主发展到以液体培养为主 (4)从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养 (5)从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 (6)从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养 (7)从单一微生物培养发展到混合微生物培养, (8)从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。 总之,微生物培养的形式丰富多样,各具特色,各有所长。根据微生物种类、培养 目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。良好的装置应在提供 丰富而均匀的营养物质的基础上,保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所 需的良好通气条件(除少数厌氧菌外),此外,还要为微生物提供一个适宜的物理化学 条件和严密的防止杂菌污染的措施。以下是一些实验室和工厂中常见的微生物培养方 331固体培养( solid- state culture) 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生 长,所以,又可称为表面培养( surface culture)。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和 保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌也可进行生产规模的固体发酵 3311实验室常见的固体培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养 方法用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后,在 固体培养基表面划线接种,见图33.1(1,2,3)和图33,2。也可以用涂布棒将少量的液体 培养物涂布在整个固体培养基表面,或将少量液体培养物与融化后降温至50-60·℃的固 体培养基混匀,倒入培养皿中,浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培 养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。 图331斜面接种和穿刺接种培养方法 斜面接种:1接种针火焰灼烧灭菌;2管口置近火焰处;3.用接种针蘸取菌样后,移到 斜面上划线;穿刺接种:4将蘸取菌样的穿刺接种针(头部无环)垂直插入固体培养基 内,再原路拔出 对微好氧微生物采取穿刺培养则更适宜于它们生长,见图3.3.1(4)。玻管中加入固 体培养基,灭菌后穿刺接种,然后塞上橡皮塞。越靠近培养基深处越缺氧,生长的菌厌
《工业微生物学》 第三章 1 3.3 微生物的培养方法 微生物培养就是提供一个适宜特定微生物生长的理化环境，使其大量地繁殖。微生 物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产 物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目 标的不同，在培养方法上也就存在许多差别。让所需的微生物大量繁殖，并进而产生大 量目标代谢产物的过程称为微生物发酵，这尤其是指工业上大规模的微生物培养。“培 养”和“发酵”两个概念经常是通用的，但它们与生物氧化中的“发酵”概念是截然不 同的。 从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主要有以下特点： （1）从少量培养发展到大规模培养。 （2）从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养。 （3）从以固体培养为主发展到以液体培养为主。 （4）从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养。 （5）从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 （6）从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养。 （7）从单一微生物培养发展到混合微生物培养。 （8）从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。 总之，微生物培养的形式丰富多样，各具特色，各有所长。根据微生物种类、培养 目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。良好的装置应在提供 丰富而均匀的营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必 需的良好通气条件（除少数厌氧菌外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学 条件和严密的防止杂菌污染的措施。以下是一些实验室和工厂中常见的微生物培养方 法： 3.3.1 固体培养（solid-state culture） 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养基质表面生 长，所以，又可称为表面培养(surface culture）。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和 保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌也可进行生产规模的固体发酵。 3.3.1.1 实验室常见的固体培养 实验室主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等固体培养 方法用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。用接种针挑取原始培养物后，在 固体培养基表面划线接种，见图 3.3.1(1,2,3) 和图 3.3.2。也可以用涂布棒将少量的液体 培养物涂布在整个固体培养基表面，或将少量液体培养物与融化后降温至 50~60℃的固 体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培 养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。 图 3.3.1 斜面接种和穿刺接种培养方法 斜面接种：1.接种针火焰灼烧灭菌；2.管口置近火焰处；3. 用接种针蘸取菌样后，移到 斜面上划线；穿刺接种：4.将蘸取菌样的穿刺接种针（头部无环）垂直插入固体培养基 内，再原路拔出 对微好氧微生物采取穿刺培养则更适宜于它们生长，见图 3.3.1(4)。玻管中加入固 体培养基，灭菌后穿刺接种，然后塞上橡皮塞。越靠近培养基深处越缺氧，生长的菌厌
《工业微生物学》第三章 氧程度越高 对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境。一种方法是在斜面接种后,将培养管棉 塞上部截去或用火点着烧掉,用玻璃棒将管内部分的棉花压至离培养基lcm处,棉塞上 方再压入一含水的脱脂棉,加入1:1比例混合的焦性没食子酸和碳酸钠粉末,立即加上 橡胶塞。焦性没食子酸和碳酸钠在有水的情况下,缓慢作用,吸收氧气,放出CO2,造 成无氧环境,见图3.3.3。也可将厌氧微生物固体培养物放在真空干燥器内,用泵排出其 中的空气,并可进一步向其中充入氮气或95%氮气和5%二氧化碳的混合气体,再放置 一定的温度环境中培养 在划线起点 长出菌苔 在划线末端 单菌落 (b) 图33.2.平板划线培养方法 (a)平板划线的过程:1用接种针蘸取菌样;2在平板固体培养基表面划线;(b)平板 划线培养结果:在划线的起点,菌落相互重叠,在划线的末端,逐渐出现单菌落 未折前铝帽 升丁基橡胶塞 棉塞璃棒 橡胶塞 折后铝帽 塞入的橡胶塞 焦性没食子酸 湿棉球 厌氧培养物 无氧气相 固体培养基 吸氧反应 厌氧菌单菌落 图333一种厌氧菌的斜面培养法 图334 Hungate滚管技术 中的厌氧试管的剖面图 针对厌氧微生物有人采用一些专用的培养装置,如 (1) Hungate滚管技术主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮,并用高纯氮驱除小环 境中的空气,使培养基的配制、分装、灭菌和储存,以及菌种的接种、培养、观察、分 离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧的条件下,从而保证了厌氧菌的存活。用这种 方法制备的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。将菌接种到融化的培养基中,然后将特 制的试管(见图3.34)用丁基橡胶塞严密塞住后平放,置冰浴中均匀滚动,使含菌的培 养基布满在试管的内表面,犹如好氧菌在培养基平板表面一样,最后长出许多单菌落。 (2)厌氧培养皿用于厌氧培养的培养皿有几种设计:有的利用皿盖创造了一个狭窄的 空间,加上含有还原剂的培养基,达到无氧的培养目的(例如 Brewer皿,见图33.4) 有的利用皿底有两个相互隔开的空间,其中一个放焦性没食子酸,另一个放NaOH溶液
《工业微生物学》 第三章 2 氧程度越高。 对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境。一种方法是在斜面接种后，将培养管棉 塞上部截去或用火点着烧掉，用玻璃棒将管内部分的棉花压至离培养基 1cm 处，棉塞上 方再压入一含水的脱脂棉，加入 1:1 比例混合的焦性没食子酸和碳酸钠粉末，立即加上 橡胶塞。焦性没食子酸和碳酸钠在有水的情况下，缓慢作用，吸收氧气，放出 CO2，造 成无氧环境，见图 3.3.3。也可将厌氧微生物固体培养物放在真空干燥器内，用泵排出其 中的空气，并可进一步向其中充入氮气或 95%氮气和 5%二氧化碳的混合气体，再放置 一定的温度环境中培养。 (a) (b) 图 3.3.2. 平板划线培养方法 (a) 平板划线的过程：1.用接种针蘸取菌样；2. 在平板固体培养基表面划线；(b) 平板 划线培养结果：在划线的起点，菌落相互重叠，在划线的末端，逐渐出现单菌落 图 3.3.3 一种厌氧菌的斜面培养法 图.3.3.4Hungate 滚管技术 中的厌氧试管的剖面图 针对厌氧微生物有人采用一些专用的培养装置，如： （1）Hungate 滚管技术 主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环 境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和储存，以及菌种的接种、培养、观察、分 离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧的条件下，从而保证了厌氧菌的存活。用这种 方法制备的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。将菌接种到融化的培养基中，然后将特 制的试管（见图 3.3.4）用丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌的培 养基布满在试管的内表面，犹如好氧菌在培养基平板表面一样，最后长出许多单菌落。 （2）厌氧培养皿 用于厌氧培养的培养皿有几种设计：有的利用皿盖创造了一个狭窄的 空间，加上含有还原剂的培养基，达到无氧的培养目的（例如 Brewer 皿，见图 3.3.4）； 有的利用皿底有两个相互隔开的空间，其中一个放焦性没食子酸，另一个放 NaOH 溶液
《工业微生物学》 待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后,立即密闭。摇动使焦性没食子酸和NaOH溶液 接触,发生吸氧反应,从而造成无氧环境(例如 Spray皿和Bray皿,见图33.5)。 皿盖 焦性没食子酸 琼脂平板 狭窄空间 NaOH 焦性没食子酸 琼脂平板 Brewer皿 Spray皿 图33.5三钟厌氧培养皿 3)厌氧罐厌氧罐的类型很多,一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体,上面是一 个用螺旋夹紧密夹住的罐盖,盖内的中央有不锈钢丝织成的网袋,内放钯催化剂。罐内 放有含美蓝的氧化还原指示剂,见图33.6。使用时,先装入待培养物,然后密闭罐盖 接着抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气体(N:CO2:H2=8010:I0ⅴ/V 罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下,可被灌入的混合气体中的H2还原成水,从而造成 很高的无氧状态。真空度低于26664Pa(20mmHg)时,指示剂美蓝被还原成无色。罐内 一般可以放10只培养皿或其它液体培养物。也可以在罐内放入商品化的“ Gaspak”产 气袋,将袋口剪开一只角,加入适量的水后,即会自动放出H2和CO 螺旋夹钯催化剂粒 带0形垫的盖 充满无氧空气 厌氧度指示剂 (美蓝) 倒置的培养皿 物料进出口 图3.3.6厌氧罐的一般构造 图3.37手套厌氧箱的一般构造 (4)厌氧手套箱( anaerobic glove box)手套箱是由透明的材料制成的箱式结构,箱体结 构严密,可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满85%氮气、5%二氧化 碳和10%的氢气,同时,还用钯催化剂清除氧气,使箱内保持严格的无氧状态。物料可 以通过特殊的交换室进出,见图3.3.7 3312生产中常见的固体培养 在生产实践中,好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容 器的表面,这样,既可使菌体获得充足的氧气,又可以将生长过程中产生的热量及时释 改,这就是传统的曲法培养的基本原理 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮。将麸皮和水混合,必要时添加一些辅 助的营养物和缓冲剂,灭菌后待冷却到合适温度便可接种。疏松的麸皮培养基的多孔结 构便于空气透入,为好氧微生物提供生长必需的氧气。这时,固体培养基中的含水量控 制在40%-80%之间(典型的液体培养基含水量在95%以上),细菌和酵母菌将无法忍受 如此低水含量的环境,所以,固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。这也是
《工业微生物学》 第三章 3 待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭。摇动使焦性没食子酸和 NaOH 溶液 接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境（例如 Spray 皿和 Bray 皿，见图 3.3.5）。 图 3.3.5 三钟厌氧培养皿 （3）厌氧罐 厌氧罐的类型很多，一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上面是一 个用螺旋夹紧密夹住的罐盖，盖内的中央有不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂。罐内 放有含美蓝的氧化还原指示剂，见图 3.3.6。使用时，先装入待培养物，然后密闭罐盖， 接着抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气体（N2:CO2:H2 = 80:10:10V/V)。 罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气体中的 H2 还原成水，从而造成 很高的无氧状态。真空度低于 266.64Pa(20mmHg)时，指示剂美蓝被还原成无色。罐内 一般可以放 10 只培养皿或其它液体培养物。也可以在罐内放入商品化的“Gaspak”产 气袋，将袋口剪开一只角，加入适量的水后，即会自动放出 H2 和 CO2。 图 3.3.6 厌氧罐的一般构造 图 3.3.7 手套厌氧箱的一般构造 (4) 厌氧手套箱（anaerobic glove box）手套箱是由透明的材料制成的箱式结构，箱体结 构严密，可以通过与箱壁相连的手套进行箱内的操作。箱内充满 85% 氮气、5%二氧化 碳和 10%的氢气，同时，还用钯催化剂清除氧气，使箱内保持严格的无氧状态。物料可 以通过特殊的交换室进出，见图 3.3.7。 3.3.1.2 生产中常见的固体培养 在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容 器的表面，这样，既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释 放，这就是传统的曲法培养的基本原理。 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮。将麸皮和水混合，必要时添加一些辅 助的营养物和缓冲剂，灭菌后待冷却到合适温度便可接种。疏松的麸皮培养基的多孔结 构便于空气透入，为好氧微生物提供生长必需的氧气。这时，固体培养基中的含水量控 制在 40%~80%之间（典型的液体培养基含水量在 95%以上），细菌和酵母菌将无法忍受 如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。这也是
《工业微生物学》第三章 生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。 进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。接种时用的种子可以通过 逐级扩大培养获得。将接好种的麸皮培养基在曲盘里铺成薄层,就可放在有温度控制的 培养室(曲房)内培养。目前,一些酶制剂的工业生产仍采用此方法。也可以将接种后 的培养基放到缓慢转动的转鼓内培养。图3.3.8是以米为原料,米曲霉( Aspergillu onηze)固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水 的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。 输出管 加热器 水喷淋头 输入管 观察孔 「日= ====== 3#书蒸汽管 网板 图338转鼓式自动固体培养装置示意图 通风曲槽的机械化程度和生产效率比较高。它一般是一个面积10m2左右的曲槽, 曲槽上有曲架和适当材料编织成的筛板,筛板上可摊一层较厚(30cm左右)的曲料, 曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气,进行半无菌的固体培养,见图3.3.9。酱 油酿造和酒精发酵等一般都能用此方法 生产实践中对厌氧菌固体培养的例子还不多见。在我国传统的白酒生产中,一向用 大型深层地窖进行堆积式的固体发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌,但也可以算作 厌氧固体发酵的例子。 总之,固体培养的设备简单,生产成本低,但是pH、溶解氧和温度等不易控制, 耗费劳动力较多,占地面积大,容易污染,生产规模难以扩大 图3.39通风曲槽结构模式图 1曲床;2风道;3鼓风机;4电动机;5.入风口;6天窗;7帘子;8曲料;9.曲槽罩 332液体培养 liquid- state culture)
《工业微生物学》 第三章 4 生产实践中固体培养主要用于霉菌进行食品酿造及其酶制剂生产的原因。 进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。接种时用的种子可以通过 逐级扩大培养获得。将接好种的麸皮培养基在曲盘里铺成薄层，就可放在有温度控制的 培养室（曲房）内培养。目前，一些酶制剂的工业生产仍采用此方法。也可以将接种后 的培养基放到缓慢转动的转鼓内培养。图 3.3.8 是以米为原料，米曲霉（ Asperigillus oryzae）固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水 的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。 图 3.3.8 转鼓式自动固体培养装置示意图 通风曲槽的机械化程度和生产效率比较高。它一般是一个面积 10m2 左右的曲槽， 曲槽上有曲架和适当材料编织成的筛板，筛板上可摊一层较厚（30cm 左右）的曲料， 曲架下部不断通以低温、潮湿的新鲜过滤空气，进行半无菌的固体培养，见图 3.3.9。酱 油酿造和酒精发酵等一般都能用此方法。 生产实践中对厌氧菌固体培养的例子还不多见。在我国传统的白酒生产中，一向用 大型深层地窖进行堆积式的固体发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌，但也可以算作 厌氧固体发酵的例子。 总之，固体培养的设备简单，生产成本低，但是 pH、溶解氧和温度等不易控制， 耗费劳动力较多，占地面积大，容易污染，生产规模难以扩大。 图 3.3.9 通风曲槽结构模式图 1.曲床；2.风道；3.鼓风机；4.电动机；5.入风口；6.天窗；7.帘子；8.曲料；9. 曲槽罩 3.3.2 液体培养(liquid-state culture）
《工业微生物学》 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好 氧性的,而且微生物只能利用溶解氧,所以,如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度 至关重要。常温(20℃)常压下达到平衡时,氧在水中的溶解度仅为62ml/(028mmol) 这些氧只能保证氧化8.3mg(0046mmol)葡萄糖,仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的 1%。除葡萄糖外,培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天 所以,对好氧菌而言,生长的限制因子几乎总是氧。在好氧微生物静止培养中常常将培 养液装成浅层进行浅层液体培养( shallow liquid culture),使氧不至于成为限制因子。但 大多数液体培养都是采用更先进的深层培养( submerged culture)。 液体培养中,一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。 具体可采取以下措施 (1)浅层液体培养 (2)利用摇床作三角瓶的振荡培养。 (3)从深层液体培养器底部通入加压空气,并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀 喷出。 (4)对培养液进行机械搅拌,并在培养器壁上设置挡扳,以降低气泡直径,增加相界 面积。 (5)提高罐压。 3321实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四类 (1)试管液体培养 此法的通气效果一般较差,仅适用于培养兼性厌氧菌,以及进行微生物的各种生理 生化试验 (2)浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液,其通气量与装裝液量、棉塞通气程度密切相关。通气 量对微生物的生长速度和生长量有很大关系,该方法一般也仅适于兼性厌氧菌 (3)摇瓶培养( shaking flask culture) 将装有液体培养基的三角瓶(摇瓶),上盖8~12层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止 空气中杂菌或杂质进入瓶内,而空气可以透过棉塞供微生物呼吸之用。为使菌体获得充 足的氧,一般装液量为三角瓶的10%以下,如250m三角瓶装10-20ml培养液。有时, 为提高搅拌效果,増加通气量,也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在 摇瓶机(摇床)上以一定速度保温振荡培养。摇床有旋转式和往复式二类。摇瓶培养不 仅操作简便,而且可以将许多摇瓶(在大摇床上可多达上百个)同时在相同的温度和振 荡速度等条件下进行培养试验。还采用适当的传感器可以随时监测微生物生长过程中的 各种变化。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等, 也常在发酵工业中用于种子培养。 (4)台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多。一般都有多 种自动控制和记录装置。如配置有pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极,有加热或冷却 装置,有补料、消泡和pH调节用的酸或碱储罐及其自动记录装置,甚至计算机控制 因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近,所以,它是实验室模拟生产实践的试验工具 见图3.3.10。 实验室中,用液体培养基进行厌氧菌培养时,一般采用加有机还原剂(如巯基乙醇、 半胱氨酸、维生素C等)或无机还原剂(铁丝等)的深层液体培养基,其上方封以凡士 林-石蜡层,以保证氧化还原电位Eh°保持在-150mV~-420mV的范围内。如放在厌氧罐 中培养,则效果更好
《工业微生物学》 第三章 5 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好 氧性的，而且微生物只能利用溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度 至关重要。常温（20℃）常压下达到平衡时，氧在水中的溶解度仅为 6.2ml/L(0.28mmol)。 这些氧只能保证氧化 8.3mg(0.046mmol）葡萄糖，仅相当于培养基中常用葡萄糖浓度的 1%。除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养分一般都可保证微生物使用几小时至数天。 所以，对好氧菌而言，生长的限制因子几乎总是氧。在好氧微生物静止培养中常常将培 养液装成浅层进行浅层液体培养（shallow liquid culture），使氧不至于成为限制因子。但 大多数液体培养都是采用更先进的深层培养（submerged culture)。 液体培养中，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。 具体可采取以下措施： （1）浅层液体培养。 （2）利用摇床作三角瓶的振荡培养。 （3）从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀 喷出。 （4） 对培养液进行机械搅拌，并在培养器壁上设置挡扳，以降低气泡直径，增加相界 面积。 （5）提高罐压。 3.3.2.1 实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四类。 (1) 试管液体培养 此法的通气效果一般较差，仅适用于培养兼性厌氧菌，以及进行微生物的各种生理 生化试验。 (2) 浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气 量对微生物的生长速度和生长量有很大关系，该方法一般也仅适于兼性厌氧菌。 (3) 摇瓶培养（shaking flask culture） 将装有液体培养基的三角瓶（摇瓶），上盖 8~12 层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止 空气中杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以透过棉塞供微生物呼吸之用。为使菌体获得充 足的氧，一般装液量为三角瓶的 10%以下，如 250ml 三角瓶装 10~20ml 培养液。有时， 为提高搅拌效果，增加通气量，也可在三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在 摇瓶机（摇床）上以一定速度保温振荡培养。摇床有旋转式和往复式二类。摇瓶培养不 仅操作简便，而且可以将许多摇瓶（在大摇床上可多达上百个）同时在相同的温度和振 荡速度等条件下进行培养试验。还采用适当的传感器可以随时监测微生物生长过程中的 各种变化。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等， 也常在发酵工业中用于种子培养。 (4) 台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多。一般都有多 种自动控制和记录装置。如配置有 pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却 装置，有补料、消泡和 pH 调节用的酸或碱储罐及其自动记录装置，甚至计算机控制。 因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实验室模拟生产实践的试验工具， 见图 3.3.10。 实验室中，用液体培养基进行厌氧菌培养时，一般采用加有机还原剂（如巯基乙醇、 半胱氨酸、维生素 C 等）或无机还原剂（铁丝等）的深层液体培养基，其上方封以凡士 林-石蜡层，以保证氧化还原电位 Eh 0 保持在-150mV~-420mV 的范围内。如放在厌氧罐 中培养，则效果更好
《工业微生物学》第三章 图3.3.10台式发酵罐 3322生产中常见的液体培养 液体培养生产效率高,适于机械化和自动化,所以,它是当前微生物发酵工业的主 要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型。静置培养适于厌氧菌发酵,如 酒精、丙酮冂醇、乳酸等发酵。通气发酵适于好氧菌发酵,如抗生素、氨基酸、核苷酸 等发酵 (1)浅盘培养( shallow pan culture) 容器中盛装浅层液体静止培养,没有通气搅拌设备,全靠液体表面与空气接触进行 氧气交换。这是最为原始的液体培养形式,劳动强度大,生产效率低,易污染。早期的 青霉素和柠檬酸发酵曾采用过浅盘培养。当时生产一千克青霉素就需要100万个容积为 升的培养瓶。 轴承支架 画电动机,排出气:进科补料 排气管 窥镜 L~手孔热水(夹套 取样管 冷却水出口 挡板 夹套 搅拌桨 通风管 放料口 冷却水进口冷水(夹套 样分析 无菌空气 出料一提取 图3.3.11通用式发酵罐的构造及其运行原理 (2)发酵罐深层培养 液体深层培养的主体设备是发酵罐。典型的发酵罐构造及其运转原理见图33.1l 罐体为碳钢或不锈钢材料,圆筒形直立,扁球形的底和盖,高径比1:2~2.5,有几组搅 拌浆,沿罐壁有等周角分布的垂直挡板,培养过程产生的热量用夹套冷却,夹套内有螺 旋形导流片以提高夹套内冷却水的动程度,增大传热系数。根据发酵产物和目标的不同, 发酵罐容积有大有小,见表33.1。大型发酵罐的容积有50-500m3,常采用列管式换热 器代替夹套进行冷却,这是因为罐体越大,单位体积培养液所具有的周壁面积越小,不 能满足传热的需要。气升式发酵罐体积可以很大,最大的是英国ICI(帝国化学工业公
《工业微生物学》 第三章 6 图 3.3.10 台式发酵罐 3.3.2.2 生产中常见的液体培养 液体培养生产效率高，适于机械化和自动化，所以，它是当前微生物发酵工业的主 要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型。静置培养适于厌氧菌发酵，如 酒精、丙酮/丁醇、乳酸等发酵。通气发酵适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸 等发酵。 (1) 浅盘培养(shallow pan culture) 容器中盛装浅层液体静止培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行 氧气交换。这是最为原始的液体培养形式，劳动强度大，生产效率低，易污染。早期的 青霉素和柠檬酸发酵曾采用过浅盘培养。当时生产一千克青霉素就需要 100 万个容积为 一升的培养瓶。 图 3.3.11 通用式发酵罐的构造及其运行原理 (2) 发酵罐深层培养 液体深层培养的主体设备是发酵罐。典型的发酵罐构造及其运转原理见图 3.3.11。 罐体为碳钢或不锈钢材料，圆筒形直立，扁球形的底和盖，高径比 1: 2~2.5，有几组搅 拌浆，沿罐壁有等周角分布的垂直挡板，培养过程产生的热量用夹套冷却，夹套内有螺 旋形导流片以提高夹套内冷却水的动程度，增大传热系数。根据发酵产物和目标的不同， 发酵罐容积有大有小，见表 3.3.1。大型发酵罐的容积有 50~500m3，常采用列管式换热 器代替夹套进行冷却，这是因为罐体越大，单位体积培养液所具有的周壁面积越小，不 能满足传热的需要。气升式发酵罐体积可以很大，最大的是英国 ICI（帝国化学工业公
《工业微生物学》 司)的甲醇蛋白发酵罐,容积达到3000mn3,发酵时装液可达2100m3。从罐底部通入空 巨大的气泡浮力使发酵液高速循环流动,内套管装有19层多孔挡板以提高空气利 用率,罐内没有机械传动部分。 表33.1各种发酵产物的发酵罐体积大 1~20,000 诊断用酶,分子生物学试剂 40~80,000 些酶和抗生素 00~150,000 青霉素,氨基糖苷类抗生素,蛋白酶,淀 粉酶,氨基酸 450 谷氨酸 发酵罐可以为微生物提供丰富而均匀的营养,良好的通气搅拌,适宜的温度和酸碱 度,并能防止杂菌污染。为此,发酵罐配备有培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压 缩过滤系统和补料系统。 液体深层培养是在青霉素等抗生素发酵中发展起来的技术。由于生产效率较髙,易 于控制,产品质量稳定,因而在发酵工业中被广泛应用。但是,深层培养耗费的动力较 多,设备较为复杂,需要较大的投资。 大型发酵罐的发酵一般需分几级进行,使发酵的种子逐级扩大,以提高发酵罐的利 用率和节约能源等。罐的级数一般是根据菌体繁殖速度以及发酵罐的容积而确定的。谷 氨酸发酵生产多采用二级培养:;而生长较慢的青霉素和链霉素生产菌种一般需要三级培 养。图33.,12是商品酵母菌的三级培养过程。在菌种室,酵母菌的斜面种子经摇瓶培养 活化,在发酵车间,经过两级种子罐培养,再转移到下一级发酵罐中完成发酵。 迄今为止,能作大规模液体培养的厌氧菌仅局限于丙酮/丁醇发酵一种。由于丙酮丁 醇梭菌是严格厌氧菌,不需要通气和搅拌装置,工艺简单,便于扩大发酵罐体积,并有 利于实行连续培养技术。 斜面种子摇瓶培养液\奶种子罐 二级种子罐 菌种室 发酵车间 发酵生产罐 图3.312商品酵母菌的三级培养过程 333连续培养 从微生物群体生长规律的分析可知,分批培养中,营养物不断消耗,代谢产物不断 积累,微生物所处的环境不断在改变,造成微生物生长不能长久地处于对数生长期。若 改变培养方法,在对数生长期的培养容器中不断添加新鲜的培养基,同时不断放出代谢 物,使微生物所需的营养及时得到补充,有害的代谢产物又能够及时排除,菌体的生长 不受影响地始终处于对数生长期,这就是连续培养。要达到连续培养的目的,就要在分 批培养的基础上,引入有效的营养物补充和代谢物排出的控制装置。连续培养的控制方 式主要有两类:恒化培养( hemostatic culture)和恒浊培养( (turbidostatic culture) 3331恒化培养 保持培养液的流速不变,使培养罐内的营养物质浓度基本恒定,并使微生物始终在 低于其最高生长速度的条件下进行繁殖,这种连续培养方式称为恒化培养。所涉及的培 养和控制装置称为恒化器( chemostat),见图3313(a)
《工业微生物学》 第三章 7 司）的甲醇蛋白发酵罐，容积达到 3000 m3，发酵时装液可达 2100m3。从罐底部通入空 气，巨大的气泡浮力使发酵液高速循环流动，内套管装有 19 层多孔挡板以提高空气利 用率，罐内没有机械传动部分。 表 3.3.1 各种发酵产物的发酵罐体积大小 发酵罐体积（升） 发酵产物 1~20，000 40~80,000 100~150,000 ~450 诊断用酶，分子生物学试剂 一些酶和抗生素 青霉素，氨基糖苷类抗生素，蛋白酶，淀 粉酶，氨基酸 谷氨酸 发酵罐可以为微生物提供丰富而均匀的营养，良好的通气搅拌，适宜的温度和酸碱 度，并能防止杂菌污染。为此，发酵罐配备有培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压 缩过滤系统和补料系统。 液体深层培养是在青霉素等抗生素发酵中发展起来的技术。由于生产效率较高，易 于控制，产品质量稳定，因而在发酵工业中被广泛应用。但是，深层培养耗费的动力较 多，设备较为复杂，需要较大的投资。 大型发酵罐的发酵一般需分几级进行，使发酵的种子逐级扩大，以提高发酵罐的利 用率和节约能源等。罐的级数一般是根据菌体繁殖速度以及发酵罐的容积而确定的。谷 氨酸发酵生产多采用二级培养；而生长较慢的青霉素和链霉素生产菌种一般需要三级培 养。图 3.3.12 是商品酵母菌的三级培养过程。在菌种室，酵母菌的斜面种子经摇瓶培养 活化，在发酵车间，经过两级种子罐培养，再转移到下一级发酵罐中完成发酵。 迄今为止，能作大规模液体培养的厌氧菌仅局限于丙酮/丁醇发酵一种。由于丙酮丁 醇梭菌是严格厌氧菌，不需要通气和搅拌装置，工艺简单，便于扩大发酵罐体积，并有 利于实行连续培养技术。 图 3.3.12 商品酵母菌的三级培养过程 3.3.3 连续培养 从微生物群体生长规律的分析可知，分批培养中，营养物不断消耗，代谢产物不断 积累，微生物所处的环境不断在改变，造成微生物生长不能长久地处于对数生长期。若 改变培养方法，在对数生长期的培养容器中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢 物，使微生物所需的营养及时得到补充，有害的代谢产物又能够及时排除，菌体的生长 不受影响地始终处于对数生长期，这就是连续培养。要达到连续培养的目的，就要在分 批培养的基础上，引入有效的营养物补充和代谢物排出的控制装置。连续培养的控制方 式主要有两类：恒化培养(chemostatic culture)和恒浊培养(turbidostatic culture)。 3.3.3.1 恒化培养 保持培养液的流速不变，使培养罐内的营养物质浓度基本恒定，并使微生物始终在 低于其最高生长速度的条件下进行繁殖，这种连续培养方式称为恒化培养。所涉及的培 养和控制装置称为恒化器（chemostat），见图 3.3.13(a)
《工业微生物学》 营养物质浓度对微生物的生长有很大影响。但当营养物浓度高到一定程度后,就不 再影响微生物的生长速度,只有在营养物浓度低时才会影响生长速度,而且在一定范围 内,生长速度与营养物浓度成正相关,营养物浓度越高,生长速度越快,见图3.3.14 恒化培养中,必须将某种必需的营养物质限制在较低的浓度,使其成为限制性底物,而 其它的营养物质均需过量,使微生物的生长速度主要决定于生长限制因子。恒化培养中, 制性底物的供给速率与微生物的消耗速率达到平衡,使恒化器中的化学组成能够保持 稳定。恒化器培养既可以获得一定生长速度的均一菌体,又可获得虽低于最高菌体产量 却能保持稳定菌体浓度的菌液 能作为恒化连续培养的生长限制因子的物质有很多,这些物质必须是微生物生长所 必需的,在一定浓度范围内能决定该微生物的生长速度。常用的生长限制因子有作为氮 源的氨或氨基酸,作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸,以及生长因子和无机盐等 用不同浓度的生长限制因子进行恒化培养,可以获得不同生长速度的培养物。恒化 培养主要用于实验室中与生长速度有关的理论研究。另外,在遗传学研究中,利用它作 长时间的培养,以便从中分离出不同的变种。在生理学研究中,也利用它来观察微生物 在不同生活条件下的生理变化。恒化培养也是研究自然条件下微生物的生态体系的实验 模型,因为自然条件下的微生物一般处于低营养浓度的环境中。 图33.13实验室连续培养系统示意图 (a)恒化培养系统;(b)恒浊培养系统;1无菌培养基储存容器;2流速控制阀; 3培养室;4排出管;5光源;6光电池;7流出液 长速度 营养物浓度(mg/m 图3314营养物浓度对细菌生长速度的影响 3332恒浊培养 根据体系中微生物的生长密度,不断调整流加培养液的流速,以取得菌体密度和生 长速度恒定的微生物细胞的培养方式称为恒浊培养。所涉及的培养和控制装置称为恒浊 器( turbidostat),见图3.3.13(b)。恒浊器中由浊度计检测培养室中的菌液密度,借光电 效应产生的电流信号变化来自动调节培养液流进和培养物流出的速度。当培养液的流速
《工业微生物学》 第三章 8 营养物质浓度对微生物的生长有很大影响。但当营养物浓度高到一定程度后，就不 再影响微生物的生长速度，只有在营养物浓度低时才会影响生长速度，而且在一定范围 内，生长速度与营养物浓度成正相关，营养物浓度越高，生长速度越快，见图 3.3.14。 恒化培养中，必须将某种必需的营养物质限制在较低的浓度，使其成为限制性底物，而 其它的营养物质均需过量，使微生物的生长速度主要决定于生长限制因子。恒化培养中， 限制性底物的供给速率与微生物的消耗速率达到平衡，使恒化器中的化学组成能够保持 稳定。恒化器培养既可以获得一定生长速度的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量， 却能保持稳定菌体浓度的菌液。 能作为恒化连续培养的生长限制因子的物质有很多，这些物质必须是微生物生长所 必需的，在一定浓度范围内能决定该微生物的生长速度。常用的生长限制因子有作为氮 源的氨或氨基酸，作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸，以及生长因子和无机盐等。 用不同浓度的生长限制因子进行恒化培养，可以获得不同生长速度的培养物。恒化 培养主要用于实验室中与生长速度有关的理论研究。另外，在遗传学研究中，利用它作 长时间的培养，以便从中分离出不同的变种。在生理学研究中，也利用它来观察微生物 在不同生活条件下的生理变化。恒化培养也是研究自然条件下微生物的生态体系的实验 模型，因为自然条件下的微生物一般处于低营养浓度的环境中。 图 3.3.13 实验室连续培养系统示意图 (a) 恒化培养系统；(b)恒浊培养系统；1.无菌培养基储存容器；2.流速控制阀； 3.培养室；4.排出管；5.光源；6.光电池；7.流出液 图 3.3.14 营养物浓度对细菌生长速度的影响 3.3.3.2 恒浊培养 根据体系中微生物的生长密度，不断调整流加培养液的流速，以取得菌体密度和生 长速度恒定的微生物细胞的培养方式称为恒浊培养。所涉及的培养和控制装置称为恒浊 器（turbidostat），见图 3.3.13(b)。恒浊器中由浊度计检测培养室中的菌液密度，借光电 效应产生的电流信号变化来自动调节培养液流进和培养物流出的速度。当培养液的流速
《工业微生物学》第三章 低于微生物的生长速度时,即培养室菌液密度超过预定值,就加大培养液的流速,使浊 度下降。反之亦然。以此来维持培养物的浊度,使之始终处于同一水平。这类培养器的 工作精度是由浊度测量和控制的灵敏度决定的。 恒浊培养中,微生物生长速度主要受流速控制,但也与菌种、培养基成分和其它培 养条件有关。恒浊培养可以不断提供具有一定生理状态的、始终以最高生长速度生长的 微生物细胞。并可在一定范围内控制不同的菌液密度。在生产实践中,为了获得大量菌 体或与菌体生长同步产生的初级代谢产物都可以采用恒浊培养。恒浊培养与恒化培养的 比较见表33.2 表332恒化培养与恒浊培养的比较 装置控制对象生长限|培养液流速|生长速度 应用范围 恒化器培养液流速有 恒定低于最高生不同生长速实验室为主 长速度 度的菌体 恒浊器菌液密度|无 不恒定最高生长速大量菌体或|生产为主 与菌体生长 平行的代谢 3333多级连续培养 连续培养也可以分级进行。以获取菌体或与菌体生长同步产生的代谢产物为目标 时,只要用单级连续培养器就可以满足研究或生产的需要。若要获取与菌体生长不同步 的次级代谢产物,就应该根据菌体和产物的产生规律,设计与其相适应的多级连续培养 装置,第一级发酵罐以培养菌体为主,后几级发酵罐则以大量生产代谢产物为主。 我国采用的丙酮厅醇两级连续发酵法就是一个成功的例子。丙酮/丁醇梭菌的生长 可以分为两个阶段,前期较短,以产菌体为主,生长温度以37℃为宜;后期较长,以产 丙酮冂醇为主,温度以33℃为宜。针对该菌特点,第一级发酵罐保持37℃,pH43,培 养液的稀释率为0.125/小时。第二级发酵罐为3℃,pH4.3,稀释率为0.04/小时。这样 的生产流程可连续运转一年以上,并达到比单级连续发酵高得多的生产效率 表333包埋固定化细胞的例子 细胞 载体 应用 S cerevisiae 角叉(菜)胶或聚丙烯酰胺将葡萄糖转化成乙醇 E aerogenes k-角叉(菜)胶 将葡萄糖转化成2,3丁二醇 k-角叉(菜)胶 将富马酸转化成天冬氨酸 Trichoderma reesei Z. mobilis k-角叉(菜)胶 纤维素生产 Acetobacter sp 海藻酸钙 将葡萄糖转化成乙醇 Morinda citrifolia 海藻酸钙 将葡萄糖转化成葡萄糖酸 JoDI 海藻酸钙 形成蒽醌 Nocardia rhodopus 海藻酸钙 苯酚降解 聚氨基甲酸乙酯 睾丸激素转化 rhodotorula minuta 聚氨基甲酸乙酯 青霉素G转化成6-APA 将琥珀酸酯转化成醇 3334固定化细胞连续培养 近年来,细胞固定化技术在微生物培养中的应用研究非常活跃,这给连续培养技术 赋予了新的形式。固定化细胞培养与游离细胞培养相比,有以下一些优势: (1)固定化可提供较高的细胞密度 (2)固定化减少了细胞的流失,使细胞可以反复利用。 (3)固定化可以提供对细胞有利的微环境
《工业微生物学》 第三章 9 低于微生物的生长速度时，即培养室菌液密度超过预定值，就加大培养液的流速，使浊 度下降。反之亦然。以此来维持培养物的浊度，使之始终处于同一水平。这类培养器的 工作精度是由浊度测量和控制的灵敏度决定的。 恒浊培养中，微生物生长速度主要受流速控制，但也与菌种、培养基成分和其它培 养条件有关。恒浊培养可以不断提供具有一定生理状态的、始终以最高生长速度生长的 微生物细胞。并可在一定范围内控制不同的菌液密度。在生产实践中，为了获得大量菌 体或与菌体生长同步产生的初级代谢产物都可以采用恒浊培养。恒浊培养与恒化培养的 比较见表 3.3.2。 表 3.3.2 恒化培养与恒浊培养的比较 装置 控制对象 生长限 制因子 培养液流速 生长速度 产物 应用范围 恒化器 培养液流速 有 恒定 低于最高生 长速度 不同生长速 度的菌体 实验室为主 恒浊器 菌液密度 无 不恒定 最高生长速 度 大量菌体或 与菌体生长 平行的代谢 产物 生产为主 3.3.3.3 多级连续培养 连续培养也可以分级进行。以获取菌体或与菌体生长同步产生的代谢产物为目标 时，只要用单级连续培养器就可以满足研究或生产的需要。若要获取与菌体生长不同步 的次级代谢产物，就应该根据菌体和产物的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养 装置，第一级发酵罐以培养菌体为主，后几级发酵罐则以大量生产代谢产物为主。 我国采用的丙酮/丁醇两级连续发酵法就是一个成功的例子。丙酮/丁醇梭菌的生长 可以分为两个阶段，前期较短，以产菌体为主，生长温度以 37℃为宜；后期较长，以产 丙酮/丁醇为主，温度以 33℃为宜。针对该菌特点，第一级发酵罐保持 37℃，pH4.3，培 养液的稀释率为 0.125/小时。第二级发酵罐为 33℃，pH4.3，稀释率为 0.04/小时。这样 的生产流程可连续运转一年以上，并达到比单级连续发酵高得多的生产效率。 表 3.3.3 包埋固定化细胞的例子 细胞 载体 应用 S. cerevisiae E. aerogenes E. coli Trichoderma reesei Z. mobilis Acetobacter sp. Morinda citrifolia Canada tropicallis Nocardia rhodocrous E. coli Rhodotorula minuta -角叉（菜）胶或聚丙烯酰胺 -角叉（菜）胶 -角叉（菜）胶 -角叉（菜）胶 海藻酸钙 海藻酸钙 海藻酸钙 海藻酸钙 聚氨基甲酸乙酯 聚氨基甲酸乙酯 将葡萄糖转化成乙醇 将葡萄糖转化成 2,3 丁二醇 将富马酸转化成天冬氨酸 纤维素生产 将葡萄糖转化成乙醇 将葡萄糖转化成葡萄糖酸 形成蒽醌 苯酚降解 睾丸激素转化 青霉素 G 转化成 6-APA 将琥珀酸酯转化成醇 3.3.3.4 固定化细胞连续培养 近年来，细胞固定化技术在微生物培养中的应用研究非常活跃，这给连续培养技术 赋予了新的形式。固定化细胞培养与游离细胞培养相比 ，有以下一些优势： （1）固定化可提供较高的细胞密度。 （2）固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用。 （3）固定化可以提供对细胞有利的微环境
《工业微生物学》第三章 (4)某些情况下,固定化可以使菌株的遗传性状稳定 (5)可以保护某些细胞免受剪切损伤 (6)简化了下游的细胞分离步骤 细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段,将微生物细胞限制在载 体的内部或表面。目前,最常用的是利用聚合物进行细胞的包埋。包埋法不会损伤细胞 但它容易造成严重的营养物和代谢产物的传质量阻力,因此应尽量采用多孔材料,形成 的颗粒要尽可能小。包埋材料有琼脂、海藻酸盐、k-角叉(菜)胶、聚丙烯酰胺、壳聚 糖、明胶和胶原等:微胶囊是由半透膜形成的中空球体,营养物和产物通过膜进出,因 为细胞悬浮在微囊中,所以,球内扩散限制较低。许多材料可以用于做微胶囊,如尼龙 火棉胶、聚苯乙烯、丙烯酸盐、硫酸纤维素和聚脲等,见表3.3.3 最简单的包裹方法是采用中空纤维反应器,将细胞接种到纤维外侧,营养液在纤维 管内部流动,通过管壁扩散到细胞侧,代谢产物可以通过管壁扩散到营养液流动相。载 体表面吸附法的应用也较为普遍,细胞吸附量及其牢固程度主要与细胞和载体表面性质 有关。微孔载体材料可以获得较高的细胞吸附量。丝状菌体除了可以通过静电、氢键和 范德华力等与载体相互吸引外,还能靠菌丝紧紧缠绕在载体上,较适合采用吸附法进行 固定。细胞吸附的材料主要有多孔玻璃、多孔硅石、氧化铝、陶瓷、明胶、壳聚糖、活 性炭、木片、聚丙烯、离子交换树脂(DEAE- Sephadex, CMC-)和 Sepharose等。细胞表 面固定也可以通过化学共价偶联,见表334。由于细胞和载体表面的反应基团较难相配, 偶联试剂对细胞有较大毒性,所以,共价固定化方法较少使用于活细胞 表334细胞表面固定的例子 细胞 载 一应用 帆乳酸杆菌( Lactobacillus s)明胶(吸附) 将葡萄糖转化成乳酸 Clostridium acetobutylicum)离子交换树脂(吸附) 将葡萄糖转化成醋酸和丁醇 Sephadex(吸附) 链霉素 氧化钛(共价固定) (B. subtillis) (Solanum aviculare) 琼脂糖(共价固定) 聚苯氧(共价固定) 形成糖碱类固醇(ster 补料 补料 循环室 循环室 产物 产物 泵 交替通入空气 图3315填充床和流化床固定化细胞反应器示意图 分批培养时,只按实线运行;连续培养时,按实线和虚线运行 因为固定化载体常常是易碎的,以及固定的细胞容易脱落等原因,固定化细胞培养 器(或称反应器)中的剪切力也不宜过高,一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。 机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装 在反应器内,一端流入培养基,另一端放出发酵液,而固定化微生物细胞始终停留在反 应器内。固定化细胞反应器可以进行连续培养,也可以是分批培养,见图3.3.11。这里 指的连续培养并不一定是严格意义上的恒浊培养或恒化培养,只是指培养可以不间断地
《工业微生物学》 第三章 10 （4）某些情况下，固定化可以使菌株的遗传性状稳定。 （5）可以保护某些细胞免受剪切损伤。 （6）简化了下游的细胞分离步骤。 细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载 体的内部或表面。目前，最常用的是利用聚合物进行细胞的包埋。包埋法不会损伤细胞， 但它容易造成严重的营养物和代谢产物的传质量阻力，因此应尽量采用多孔材料，形成 的颗粒要尽可能小。包埋材料有琼脂、海藻酸盐、k-角叉（菜）胶、聚丙烯酰胺、壳聚 糖、明胶和胶原等；微胶囊是由半透膜形成的中空球体，营养物和产物通过膜进出，因 为细胞悬浮在微囊中，所以，球内扩散限制较低。许多材料可以用于做微胶囊，如尼龙、 火棉胶、聚苯乙烯、丙烯酸盐、硫酸纤维素和聚脲等，见表 3.3.3。 最简单的包裹方法是采用中空纤维反应器，将细胞接种到纤维外侧，营养液在纤维 管内部流动，通过管壁扩散到细胞侧，代谢产物可以通过管壁扩散到营养液流动相。载 体表面吸附法的应用也较为普遍，细胞吸附量及其牢固程度主要与细胞和载体表面性质 有关。微孔载体材料可以获得较高的细胞吸附量。丝状菌体除了可以通过静电、氢键和 范德华力等与载体相互吸引外，还能靠菌丝紧紧缠绕在载体上，较适合采用吸附法进行 固定。细胞吸附的材料主要有多孔玻璃、多孔硅石、氧化铝、陶瓷、明胶、壳聚糖、活 性炭、木片、聚丙烯、离子交换树脂（DEAE-Sephadex,CMC-）和 Sepharose 等。细胞表 面固定也可以通过化学共价偶联，见表 3.3.4。由于细胞和载体表面的反应基团较难相配， 偶联试剂对细胞有较大毒性，所以，共价固定化方法较少使用于活细胞。 表 3.3.4 细胞表面固定的例子 细胞 载体 应用 乳酸杆菌（Lactobacillus sp) (Clostridium acetobutylicum) (Streptomyces) E.coli (B.subtillis) (Solanum aviculare) 明胶（吸附） 离子交换树脂（吸附） Sephadex（吸附） 氧化钛（共价固定） 琼脂糖（共价固定） 聚苯氧（共价固定） 将葡萄糖转化成乳酸 将葡萄糖转化成醋酸和丁醇 链霉素 形成糖碱类固醇（ steroid glycoalkaloids) 图 3.3.15 填充床和流化床固定化细胞反应器示意图 分批培养时，只按实线运行；连续培养时，按实线和虚线运行 因为固定化载体常常是易碎的，以及固定的细胞容易脱落等原因，固定化细胞培养 器（或称反应器）中的剪切力也不宜过高，一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。 机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装 在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反 应器内。固定化细胞反应器可以进行连续培养，也可以是分批培养，见图 3.3.14。这里 指的连续培养并不一定是严格意义上的恒浊培养或恒化培养，只是指培养可以不间断地
