《工业微生物学》第三章 35消毒和灭菌 发酵是利用特定的一种或几种微生物的代谢活动,大量生产菌体或特定的代谢产 物。在此过程中,需要保证没有其它杂菌的侵染,否则,将可能产生以下一些不利的后 果 (1)杂菌消耗培养基成分,造成生产水平下降 (2)杂菌菌体大量繁殖及其代谢产生某些化合物会造成目标产物提取的难度增大,如 果污染杂菌有可能影响发酵液的过滤(滤速降低,滤渣含水量増髙),也会使溶媒提取 时易发生乳化现象 (3)杂菌产生某些对生产菌有毒害或者能分解预期产物的物质。这在抗生素发酵 中很常见,如某些杂菌会产β内酰胺酶,从而分解含β内酰胺结构的抗生素 (4)若是噬菌体污染,则会造成发酵菌体细胞的溶解 (5)若杂菌的生长速度超过生产菌,就会取而代之 正是由于上述原因,消毒和灭菌工作在发酵产业中起到决定性的作用。虽然,生产 上也有轻度染菌对生产和产品质量影响不大的情况,但这是有条件的极少数例外 灭菌( Sterilization)的英文字意为使之失去生殖能力,即杀死一切微生物(繁殖体 孢子)的措施,包括杂菌和生产菌、病原和非病原菌在内。实践中灭菌可分杀菌和溶菌 前者使菌体死亡,但形体尚存,后者使细胞溶化,消失。消毒( Disinfection)字意为去 除感染,消去毒害。即杀死引起感染的微生物。通常是杀死病原微生物。工业上指消除 杂菌,除去引起感染的微生物 消毒和灭菌都可以采用类似的各种物理和化学方法,但它们也存在一定的差异。消 毒偏向于利用一些化学因素,较为温和;而灭菌偏向于利用一些物理因素,较为剧烈 消毒的结果不一定灭菌,灭菌的结果应该无菌。 除杀死微生物以外,我们常采取一些抑制微生物生长的手段,即抑菌。它包括防腐 和化疗。 总之,灭菌、消毒和抑菌都是常用的控制有害微生物的措施。 杀菌 彻底杀灭-灭 溶菌 部分杀灭--消毒 控制有害菌措施 抑制霉腐微生物-防腐 抑制宿主体内病原菌-化疗 351常见的灭菌和消毒的物理方法 最常用的物理方法是高温灭菌(消毒)法。因为微生物的生物功能完全依赖于蛋白 质、核酸等生物大分子,而高温可引起这些活性大分子氧化或变性失活,从而导致微生 物死亡。 当环境温度超过微生物的最高生长温度,将会引起微生物死亡。不同微生物的最高 生长温度不同,不同生长阶段的微生物抗热性也不一样,因而可以根据不同对象,通过 控制热处理的温度和时间达到灭菌或消毒的目的。常见的高温灭菌(消毒)方法主要有 干热和湿热两大类: 火焰灼烧法 干热灭菌法 烘箱热空气灭菌法 高温灭菌(消毒)法 巴氏消毒法 湿热灭菌(消毒)法常压下煮沸消毒法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下(连续加压灭菌法
《工业微生物学》 第三章 1 3.5 消毒和灭菌 发酵是利用特定的一种或几种微生物的代谢活动，大量生产菌体或特定的代谢产 物。在此过程中，需要保证没有其它杂菌的侵染，否则，将可能产生以下一些不利的后 果： （1）杂菌消耗培养基成分，造成生产水平下降； （2）杂菌菌体大量繁殖及其代谢产生某些化合物会造成目标产物提取的难度增大，如 果污染杂菌有可能影响发酵液的过滤（滤速降低，滤渣含水量增高），也会使溶媒提取 时易发生乳化现象； （3）杂菌产生某些对生产菌有毒害或者能分解预期产物的物质。这在抗生素发酵 中很常见，如某些杂菌会产β内酰胺酶，从而分解含β内酰胺结构的抗生素； （4）若是噬菌体污染，则会造成发酵菌体细胞的溶解； （5）若杂菌的生长速度超过生产菌，就会取而代之。 正是由于上述原因，消毒和灭菌工作在发酵产业中起到决定性的作用。虽然，生产 上也有轻度染菌对生产和产品质量影响不大的情况，但这是有条件的极少数例外。 灭菌（Sterilization）的英文字意为使之失去生殖能力，即杀死一切微生物（繁殖体 孢子）的措施，包括杂菌和生产菌、病原和非病原菌在内。实践中灭菌可分杀菌和溶菌。 前者使菌体死亡，但形体尚存，后者使细胞溶化，消失。消毒（Disinfection）字意为去 除感染，消去毒害。即杀死引起感染的微生物。通常是杀死病原微生物。工业上指消除 杂菌，除去引起感染的微生物。 消毒和灭菌都可以采用类似的各种物理和化学方法，但它们也存在一定的差异。消 毒偏向于利用一些化学因素，较为温和；而灭菌偏向于利用一些物理因素，较为剧烈。 消毒的结果不一定灭菌，灭菌的结果应该无菌。 除杀死微生物以外，我们常采取一些抑制微生物生长的手段，即抑菌。它包括防腐 和化疗。 总之，灭菌、消毒和抑菌都是常用的控制有害微生物的措施。 3.5.1 常见的灭菌和消毒的物理方法 最常用的物理方法是高温灭菌（消毒）法。因为微生物的生物功能完全依赖于蛋白 质、核酸等生物大分子，而高温可引起这些活性大分子氧化或变性失活，从而导致微生 物死亡。 当环境温度超过微生物的最高生长温度，将会引起微生物死亡。不同微生物的最高 生长温度不同，不同生长阶段的微生物抗热性也不一样，因而可以根据不同对象，通过 控制热处理的温度和时间达到灭菌或消毒的目的。常见的高温灭菌（消毒）方法主要有 干热和湿热两大类： 杀菌 彻底杀灭---灭菌 杀灭 溶菌 部分杀灭---消毒 控制有害菌措施 抑制霉腐微生物---防腐 抑制 抑制宿主体内病原菌---化疗 火焰灼烧法 干热灭菌法 烘箱热空气灭菌法 高温灭菌（消毒）法 巴氏消毒法 湿热灭菌（消毒）法 常压下 煮沸消毒法 间歇灭菌法 常规加压灭菌法 加压下 连续加压灭菌法
《工业微生物学》 对于不能进行高温处理的物品可以采取过滤除菌、紫外线、γ射线照射等物理方法, 或采取化学控菌的方法。 3511千热灭菌法( dry heat sterilization) 干热灭菌时,微生物主要由于氧化作用而死亡。干热灭菌的Qo值(即温度升高10 ℃时的生长速度常数与原来温度时的生长速度常数的比值)通常约为2~3 1)灼烧法( incineration)这是最简单、最彻底的干热灭菌方法,它将被灭菌物品放在 火焰中灼烧,使所有的生物质碳化。但是,该法对被灭菌物品的破坏极大,适用的范围 较小。常用于实验室接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌,也用于工业发酵罐接 种时的火环保护。 2)烘箱热空气法(hat- air oven)将物品放入烘箱内,然后升温至150-170℃,维持1~2 小时。一般的营养体在100℃,维持1小时即会死亡,芽孢在160℃,维持2小时才会 全部死亡。所以,经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、陶瓷 和金属物品的灭菌。其优点是灭菌后物品干燥,缺点是操作所需时间长,易损坏物品, 对液体的样品不适用 352湿热灭菌法( Moist heat sterilization) 湿热灭菌时,微生物死亡与细胞蛋白质等大分子变性有关,其Q1o值比干热灭菌的 高,对芽孢(在100~135℃)约为8~10,对营养细胞则更高,因此,湿热灭菌比干热灭 菌更有效。 湿热法就是利用水蒸汽的热量将物品灭菌。同样温度下,湿热灭菌的效果与干热发 的比较见表3.5.1。水蒸汽具有穿透能力强,易于传导热量的优点,干热和湿热空气穿透 力的比较见表352。实验表明蛋白质的含水量与其凝固温度成反比,见表3.53,因 湿热更易将蛋白质的氢键打断,使其发生变性凝固。另外,由于蒸汽在被灭菌的物品表 面凝结,释放出潜热,这种潜热能迅速提高灭菌物品的温度,缩短灭菌所需的时间。总 ,湿热灭菌具有经济和快速等特点,广泛用于培养基和发酵设备等的灭菌。 湿热条件下,多数细菌和真菌的营养体在60℃左右,5~10分钟即死亡:酵母菌和 真菌的孢子稍耐热,80℃以上才会死亡;而细菌的芽孢一般在120℃,维持15分钟才能 杀死。(嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在121℃,需要12分钟才能杀死。) 表351千热与湿热空气对不同细菌的致死时间比较 方式 干热90℃ 细菌种类 白喉棒杆菌 24小时 2小时 2分钟 痢疾杆菌 3小时 2小时 2分钟 伤寒杆菌 3小时 2分钟 葡萄球菌 8小时 3小时 2分钟 表352干热和湿热空气穿透力的比较 加热方式温度(℃)加热时间 透过布的层数及其温度(℃) (小时) 20层 40层 100层 干热 130~140 70以下 105 4 01 101 表353蛋白质含水量与其凝固温度的关系 蛋白质含水量(%) 蛋白质凝固温度(℃)灭菌时间(分) 30 30 80~90 30
《工业微生物学》 第三章 2 对于不能进行高温处理的物品可以采取过滤除菌、紫外线、射线照射等物理方法， 或采取化学控菌的方法。 3.5.1.1 干热灭菌法（dry heat sterilization） 干热灭菌时，微生物主要由于氧化作用而死亡。干热灭菌的 Q10 值（即温度升高 10 ℃时的生长速度常数与原来温度时的生长速度常数的比值）通常约为 2~3。 1) 灼烧法(incineration) 这是最简单、最彻底的干热灭菌方法，它将被灭菌物品放在 火焰中灼烧，使所有的生物质碳化。但是，该法对被灭菌物品的破坏极大，适用的范围 较小。常用于实验室接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌，也用于工业发酵罐接 种时的火环保护。 2) 烘箱热空气法(hat-air oven) 将物品放入烘箱内，然后升温至 150~170℃，维持 1~2 小时。一般的营养体在 100℃，维持 1 小时即会死亡，芽孢在 160℃，维持 2 小时才会 全部死亡。所以，经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、陶瓷 和金属物品的灭菌。其优点是灭菌后物品干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品， 对液体的样品不适用。 3.5.1.2 湿热灭菌法（Moist heat sterilization ) 湿热灭菌时，微生物死亡与细胞蛋白质等大分子变性有关，其 Q10 值比干热灭菌的 高，对芽孢（在 100~135℃）约为 8~10，对营养细胞则更高，因此，湿热灭菌比干热灭 菌更有效。 湿热法就是利用水蒸汽的热量将物品灭菌。同样温度下，湿热灭菌的效果与干热发 的比较见表 3.5.1。水蒸汽具有穿透能力强，易于传导热量的优点, 干热和湿热空气穿透 力的比较见表 3.5.2。实验表明蛋白质的含水量与其凝固温度成反比，见表 3.5.3，因此 湿热更易将蛋白质的氢键打断，使其发生变性凝固。另外，由于蒸汽在被灭菌的物品表 面凝结，释放出潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物品的温度，缩短灭菌所需的时间。总 之，湿热灭菌具有经济和快速等特点，广泛用于培养基和发酵设备等的灭菌。 湿热条件下，多数细菌和真菌的营养体在 60℃左右，5~10 分钟即死亡；酵母菌和 真菌的孢子稍耐热，80℃以上才会死亡；而细菌的芽孢一般在 120℃，维持 15 分钟才能 杀死。（嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在 121℃，需要 12 分钟才能杀死。） 表 3.5.1 干热与湿热空气对不同细菌的致死时间比较 加热方式 细菌种类 干热 90℃ 90℃，相对湿度分别为 20% 80% 白喉棒杆菌 痢疾杆菌 伤寒杆菌 葡萄球菌 24 小时 3 小时 3 小时 8 小时 2 小时 2 小时 2 小时 3 小时 2 分钟 2 分钟 2 分钟 2 分钟 表 3.5.2 干热和湿热空气穿透力的比较 加热方式 温度（℃） 加热时间 （小时） 透过布的层数及其温度（℃） 20 层 40 层 100 层 干热 湿热 130~140 105 4 4 86 101 72 101 70 以下 101 表 3.5.3 蛋白质含水量与其凝固温度的关系 蛋白质含水量（%） 蛋白质凝固温度（℃） 灭菌时间（分） 50 25 18 6 0 56 74~80 80~90 145 160~170 30 30 30 30 30
《工业微生物学》第三章 常用湿热法有以下几种。 1)巴斯德消毒法( Pasteurization) 巴斯德消毒法是十九世纪六十年代,由巴斯德发展起来的。该法主要针对牛奶、啤 酒、果酒和酱油等不易长时间高温灭菌的液体食品,其目的是杀死无芽孢的病原菌(如 牛奶中的结核杆菌和沙门氏杆菌),但又能保持食品的风味 巴斯德消毒法的一般操作是将待消毒的液体食品置于60~85℃下处理15秒-30分 钟,然后迅速冷却。多年来,具体的处理温度和时间都有所变动。较为传统的操作是低 温维持法( low temperature holding method, LTH或称低温长时法( (low temperature long time,L∏LT),即将液体食品(如牛奶)置于629℃(145F)下处理30分钟。对于较稠的 食品(如冰淇淋,奶油)常采用69.5℃(155F);另一类是高温瞬间法( high temperature short time,HIST),将液体食品置71.6℃(161F)下处理15~17秒种。近年来,由于设备 的改良,尤其是采用流动连续操作系统(见图35.1)后,巴斯德消毒法逐渐演化成一种 采用更高温度、更短时间的灭菌方法,即超高温巴斯德灭菌法( ultrapasteurization),让 液体食品停留在140℃左右(如137℃或143℃)的温度下保持3~4秒钟,急剧冷却至 75℃,然后经均质化后冷却至20℃。该法能够达到灭菌之目的,而且处理后的牛奶等饮 料可存放长达6个月。 冷却器 预冷 消毒牛奶 加热器 预热 温度控制器 待消毒牛奶 图351高温瞬间巴斯德消毒法的操作流程图 2)煮沸消毒法 人们常将饮用水加热至100℃,煮沸数分钟,以达到消毒的目的。在条件有限的情 况下,可采用该法消毒物品。 3)间歌灭菌法,或称丁达尔灭菌法( Tyndallization) 间歇灭菌法是在80~100℃蒸煮15-60分钟,再搁置室温(28~37℃)下过夜,并重 复以上过程三遍以上。其中蒸煮过程可以杀死微生物的营养体,但不能杀死芽孢,室温 过夜促使芽孢萌发形成营养体,再经蒸煮过程可杀死新的营养体。循环三次以上可以保 证彻底杀死包括芽孢在内的微生物。这种方法可以在较低的温度下,达到彻底灭菌的目 的,对设备的要求较低,适用于不耐高温的物品灭菌。但其缺点是费时。 4)常规加压灭菌法 蒸汽加压灭菌是目前应用最广、最有效的灭菌手段。蒸汽(湿热)灭菌过程是个 级反应,可用下式表示: dN/dt=kN 式中N是现存的活菌数;t是灭菌处理的时间:k是反应速率常数或比死亡速率。对于 一级反应,其反应速度,即k值随温度升高而增大。上式积分可得如下表达式 N /No=e-k 式中No是灭菌处理开始时存在的活菌数目:N1是经过t时间后存在的活菌数目。 Arrhenius 曾提出温度与反应速度常数之间的关系式 dInk/dT=E/RT
《工业微生物学》 第三章 3 常用湿热法有以下几种。 1) 巴斯德消毒法（Pasteurization） 巴斯德消毒法是十九世纪六十年代，由巴斯德发展起来的。该法主要针对牛奶、啤 酒、果酒和酱油等不易长时间高温灭菌的液体食品，其目的是杀死无芽孢的病原菌（如 牛奶中的结核杆菌和沙门氏杆菌），但又能保持食品的风味。 巴斯德消毒法的一般操作是将待消毒的液体食品置于 60 ~85℃下处理 15 秒~30 分 钟，然后迅速冷却。多年来，具体的处理温度和时间都有所变动。较为传统的操作是低 温维持法（low temperature holding method, LTH)或称低温长时法（low temperature long time, LTLT），即将液体食品（如牛奶）置于 62.9℃(145℉)下处理 30 分钟。对于较稠的 食品（如冰淇淋，奶油）常采用 69.5℃(155℉)； 另一类是高温瞬间法（high temperature short time, HTST），将液体食品置 71.6℃(161℉)下处理 15~17 秒种。近年来，由于设备 的改良，尤其是采用流动连续操作系统（见图 3.5.1）后，巴斯德消毒法逐渐演化成一种 采用更高温度、更短时间的灭菌方法，即超高温巴斯德灭菌法（ultrapasteurization），让 液体食品停留在 140℃左右（如 137℃或 143℃）的温度下保持 3~4 秒钟，急剧冷却至 75℃，然后经均质化后冷却至 20℃。该法能够达到灭菌之目的，而且处理后的牛奶等饮 料可存放长达 6 个月。 图 3.5.1 高温瞬间巴斯德消毒法的操作流程图 2) 煮沸消毒法 人们常将饮用水加热至 100℃，煮沸数分钟，以达到消毒的目的。在条件有限的情 况下，可采用该法消毒物品。 3) 间歇灭菌法，或称丁达尔灭菌法（Tyndallization） 间歇灭菌法是在 80 ~100℃蒸煮 15~60 分钟，再搁置室温（28~37℃）下过夜，并重 复以上过程三遍以上。其中蒸煮过程可以杀死微生物的营养体，但不能杀死芽孢，室温 过夜促使芽孢萌发形成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体。循环三次以上可以保 证彻底杀死包括芽孢在内的微生物。这种方法可以在较低的温度下，达到彻底灭菌的目 的，对设备的要求较低，适用于不耐高温的物品灭菌。但其缺点是费时。 4) 常规加压灭菌法 蒸汽加压灭菌是目前应用最广、最有效的灭菌手段。蒸汽（湿热）灭菌过程是个一 级反应，可用下式表示： -dN/dt = kN 式中 N 是现存的活菌数；t 是灭菌处理的时间；k 是反应速率常数或比死亡速率。对于 一级反应，其反应速度，即 k 值随温度升高而增大。上式积分可得如下表达式： Nt/N0 = e-kt 式中N0是灭菌处理开始时存在的活菌数目；Nt是经过t时间后存在的活菌数目。Arrhenius 曾提出温度与反应速度常数之间的关系式： dlnk/dT =E/RT2
《工业微生物学》 式中,E是活化能;R是气体常数;T是绝对温度。积分后可得: K=Ae-ERT 式中,A是 Arrhenius常数。将上述两式联立就可得培养基在一恒定温度下灭菌的表达 n(NN)=A·t·chR 式中,ln(No/N1)被称为Del系数,它表示在一定热量和时间条件下,活菌数目减少的数 量。对为达到某一De值所需灭菌时间的对数和绝对温度的倒数作图,可得一直线。直 线的斜率与反应的活化能有关。见图352。从图中可清楚地看到,在相当大的范围内 不同灭菌时间和温度值可以得到相同的灭菌效果。也就是说,高温瞬时灭菌和低温长时 间灭菌均可达到同样的效果。 因为我们无法了解所有的待灭菌物中微生物的热致死特性,所以,常假设杂菌是嗜 热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus)的芽孢,一种已知耐热性最强的微生物,并 根据是否能够杀死该芽孢来设计,使灭菌过程有可靠的保障。嗜热脂肪芽孢杆菌的热致 死特性为:E=677千卡/摩尔:A=1×10362秒。然而,应该考虑到这些参数会随着培 养基的不同而改变,例如:干燥的嗜热脂肪芽孢杄菌的芽孢悬浮在含水量较低的脂肪和 油中比其在其它湿润条件下的耐热性强十倍。 在考虑获得预期De系数的同时,我们还要注意到灭菌过程对培养基成分的破坏。 图3.5.3说明了延长培养基的灭菌时间对随后的发酵过程的影响。曲线开始一段产量上 升是因为短时灭菌造成培养基的“烹饪效应”而使菌体能更快地获取养分。 el=69.0 灭 菌 间 2.3 30 125120115110105100 01030507090 灭菌温度(0C) 灭菌时间(分钟) 图352灭菌温度和时间对De系数的影响图353灭菌时间对相继发酵产量的影响 表3.5.4纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系 蒸汽压力 蒸汽温度 千克/厘米2( 2)磅/英寸2(1bfim2)兆帕(MPa)℃ 0.00 0.00 100.0212 0.25 0.025107.0|224 0.050 1120234 1.75 0.75 l125 00751155|240 2.50 1.50 22.50 0.1501280262 注:1千克厘米2( Kgf/cm2)=105帕;1磅/英寸2=6894.76帕; 0F=9/5×℃+32:℃=5/9×(0F-32) 实验室常用高压蒸汽锅灭菌。高压蒸汽灭菌不是靠压力,而是靠蒸汽的高温。其主 要过程是煮沸灭菌锅内的水或通入水蒸汽,驱尽空气,使锅或罐内温度升至100℃以上
《工业微生物学》 第三章 4 式中，E 是活化能；R 是气体常数；T 是绝对温度。积分后可得： K =A e-E/RT 式中，A 是 Arrhenius 常数。将上述两式联立就可得培养基在一恒定温度下灭菌的表达 式： ln (N0 /Nt )= A·t·e -E/RT。 式中，ln (N0 /Nt )被称为 Del 系数，它表示在一定热量和时间条件下，活菌数目减少的数 量。对为达到某一 Del 值所需灭菌时间的对数和绝对温度的倒数作图，可得一直线。直 线的斜率与反应的活化能有关。见图 3.5.2。从图中可清楚地看到，在相当大的范围内， 不同灭菌时间和温度值可以得到相同的灭菌效果。也就是说，高温瞬时灭菌和低温长时 间灭菌均可达到同样的效果。 因为我们无法了解所有的待灭菌物中微生物的热致死特性，所以，常假设杂菌是嗜 热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的芽孢，一种已知耐热性最强的微生物，并 根据是否能够杀死该芽孢来设计，使灭菌过程有可靠的保障。嗜热脂肪芽孢杆菌的热致 死特性为：E = 67.7 千卡/摩尔；A = 1×1036.2 秒-1。然而，应该考虑到这些参数会随着培 养基的不同而改变，例如：干燥的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢悬浮在含水量较低的脂肪和 油中比其在其它湿润条件下的耐热性强十倍。 在考虑获得预期 Del 系数的同时，我们还要注意到灭菌过程对培养基成分的破坏。 图 3.5.3 说明了延长培养基的灭菌时间对随后的发酵过程的影响。曲线开始一段产量上 升是因为短时灭菌造成培养基的“烹饪效应”而使菌体能更快地获取养分。 图 3.5.2 灭菌温度和时间对 Del 系数的影响 图 3.5.3 灭菌时间对相继发酵产量的影响 表 3.5.4 纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系 蒸汽压力 蒸汽温度 大气压(atm) 千克/厘米 2 (Kgf/cm2 ) 磅/英寸 2 (1bf/in2 ) 兆帕(MPa) ℃ 0 F 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.50 3.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00 0.00 3.75 7.50 11.25 15.00 22.50 30.00 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.150 0.200 100.0 107.0 112.0 115.5 121.0 128.0 134.5 212 224 234 240 250 262 274 注：1 千克/厘米 2 (Kgf/cm2 ) =105 帕；1 磅/英寸 2 = 6894.76 帕； 0 F=9/5×℃+32；℃=5/9×（0 F-32） 实验室常用高压蒸汽锅灭菌。高压蒸汽灭菌不是靠压力，而是靠蒸汽的高温。其主 要过程是煮沸灭菌锅内的水或通入水蒸汽，驱尽空气，使锅或罐内温度升至 100℃以上
《工业微生物学》第三章 纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系见表354。若锅内留有空气,锅内温度将达不到压力表 所对应的温度。一般将蒸汽压升至0.1MPa,此时的温度是121℃,维持15~30分钟。有 时待灭菌物品中有糖等易受热变性的化合物,则要适当地降低灭菌的压力和时间,尽管 这样做会增大染菌的危险性。也可以采用分别灭菌的方法以避免热敏物质的降解或营养 物之间的反应。灭菌完毕后应缓慢地放气减压,以免被处理容器内液体突然沸腾,弄湿 棉塞或冲出容器。当压力降到零时,才能打开灭菌锅的盖子。高压蒸汽灭菌锅适用于 切微生物实验室、医疗保健单位和工厂菌种室的培养基、器材和其它物料的灭菌。图3.5.4 是一种直接利用蒸汽加热的灭菌器。 气压表 排气阀 灭菌舱门 慈汽 空气 夹套 气阀D→ 之排气孔 蒸汽进口 图354一种高压蒸汽灭菌装置 发酵工厂将培养基和发酵设备放在一起灭菌的过程称为实罐灭菌(实消)。发酵罐 体单独的灭菌过程称为空罐灭菌(空消)。空罐灭菌一般用于连续灭菌的罐体准备以及 染菌罐处理等。实罐灭菌和空罐灭菌都属常规加压灭菌,也可称为批式灭菌。培养基连 续经过流动式灭菌器灭菌后再进入发酵罐的过程称为连续灭菌(连消)。 实罐灭菌先将输料管路内的污水排掉,冲洗干净,然后将配制好的培养基用泵打入 发酵罐〔种子罐或料罐)内,同时开动搅拌器。灭菌前先将各排气阀打开,将蒸汽引入 夹套或蛇管进行预热,待罐温升至80~90℃时,将排气阀逐渐关小。接着,将蒸汽从进 气口、排料口和取样口直接通入罐中(如有冲视镜管也应同时进汽),使罐温上升到 l18~120℃,罐压维持在0.9~10公斤/厘米2(表压),保温30分钟左右。各路蒸汽进口 的进汽要通畅,防止短路逆流。罐内液体翻动要激烈。排气也要通畅,但排气量不宜过 大,以节约蒸汽。灭菌将要结束时,立即引入无菌空气,以保持罐压,然后再开夹套或 蛇管冷却水冷却。这样可以避免罐压迅速下降而产生负压并抽吸外界空气。在引入无菌 空气前,罐内压力必需低于空气过滤器压力,否则,培养基或物料将倒流入过滤器内 灭菌时,总蒸汽压力要求不低于30-35公斤/厘米2,使用压力不低于2公斤/厘米2。(总 蒸汽压力系指蒸汽总管道压力。使用压力系指通入罐中时的蒸汽压力)。 空罐灭菌即发酵罐的罐体灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.5-2.0公斤/厘米ξ、罐温 25~130℃、时间30~45分钟,灭菌时要求总蒸汽压力不低于30~3.5公斤厘米2,使用 蒸汽压力不低于25~30公斤厘米2。灭菌结束后,为避免罐压急速下降造成负压,要 等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后,才可以开冷却水冷却 实罐灭菌和空罐灭菌必需避免“死角”,即活蒸汽到达不了或达不到灭菌温度的地 方。因为“死角”处只能靠热传导进行灭菌,假如积垢过多,单靠热传导会造成灭菌不 彻底而染菌 除了灭菌温度和时间外,蒸汽灭菌效果还受到其它一些因素的影响,如灭菌物品的 含菌量,容器内残留空气量,灭菌对象的pH等等。pH60-8.0时,微生物不易死亡,pl 小于60时,则易被杀死。灭菌对象的体积将影响热传导,体积越大,灭菌所需的时间 也越长
《工业微生物学》 第三章 5 纯蒸汽压力与纯蒸汽温度的关系见表 3.5.4。若锅内留有空气，锅内温度将达不到压力表 所对应的温度。一般将蒸汽压升至 0.1MPa，此时的温度是 121℃，维持 15~30 分钟。有 时待灭菌物品中有糖等易受热变性的化合物，则要适当地降低灭菌的压力和时间，尽管 这样做会增大染菌的危险性。也可以采用分别灭菌的方法以避免热敏物质的降解或营养 物之间的反应。灭菌完毕后应缓慢地放气减压，以免被处理容器内液体突然沸腾，弄湿 棉塞或冲出容器。当压力降到零时，才能打开灭菌锅的盖子。高压蒸汽灭菌锅适用于一 切微生物实验室、医疗保健单位和工厂菌种室的培养基、器材和其它物料的灭菌。图 3.5.4 是一种直接利用蒸汽加热的灭菌器。 图 3.5.4 一种高压蒸汽灭菌装置 发酵工厂将培养基和发酵设备放在一起灭菌的过程称为实罐灭菌（实消）。发酵罐 体单独的灭菌过程称为空罐灭菌（空消）。空罐灭菌一般用于连续灭菌的罐体准备以及 染菌罐处理等。实罐灭菌和空罐灭菌都属常规加压灭菌，也可称为批式灭菌。培养基连 续经过流动式灭菌器灭菌后再进入发酵罐的过程称为连续灭菌（连消）。 实罐灭菌先将输料管路内的污水排掉，冲洗干净，然后将配制好的培养基用泵打入 发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入 夹套或蛇管进行预热，待罐温升至 80~90℃时，将排气阀逐渐关小。接着，将蒸汽从进 气口、排料口和取样口直接通入罐中（如有冲视镜管也应同时进汽），使罐温上升到 118~120℃，罐压维持在 0.9~1.0 公斤/厘米 2（表压），保温 30 分钟左右。各路蒸汽进口 的进汽要通畅，防止短路逆流。罐内液体翻动要激烈。排气也要通畅，但排气量不宜过 大，以节约蒸汽。灭菌将要结束时，立即引入无菌空气，以保持罐压，然后再开夹套或 蛇管冷却水冷却。这样可以避免罐压迅速下降而产生负压并抽吸外界空气。在引入无菌 空气前，罐内压力必需低于空气过滤器压力，否则，培养基或物料将倒流入过滤器内。 灭菌时，总蒸汽压力要求不低于 3.0~3.5 公斤/厘米 2，使用压力不低于 2 公斤/厘米 2。（总 蒸汽压力系指蒸汽总管道压力。使用压力系指通入罐中时的蒸汽压力）。 空罐灭菌即发酵罐的罐体灭菌。空罐灭菌一般维持罐压 1.5~2.0 公斤/厘米 2 、罐温 125~130℃、时间 30~45 分钟，灭菌时要求总蒸汽压力不低于 3.0~3.5 公斤/厘米 2，使用 蒸汽压力不低于 2.5~3.0 公斤/厘米 2。灭菌结束后，为避免罐压急速下降造成负压，要 等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。 实罐灭菌和空罐灭菌必需避免“死角”，即活蒸汽到达不了或达不到灭菌温度的地 方。因为“死角”处只能靠热传导进行灭菌，假如积垢过多，单靠热传导会造成灭菌不 彻底而染菌。 除了灭菌温度和时间外，蒸汽灭菌效果还受到其它一些因素的影响，如灭菌物品的 含菌量，容器内残留空气量，灭菌对象的 pH 等等。pH6.0~8.0 时，微生物不易死亡，pH 小于 6.0 时，则易被杀死。灭菌对象的体积将影响热传导，体积越大，灭菌所需的时间 也越长
《工业微生物学》 实罐灭菌需要较长时间在罐内加热和冷却培养基,如一个50m3的发酵罐,装料 35m3,从预热到消后冷却,就需要8小时左右。这段时间发酵罐不能用于发酵,所以, 实罐灭菌的设备利用率要低于连续灭菌。由于实罐灭菌是间歇性操作,蒸汽负荷高峰相 对集中,这也将给蒸汽的供应系统带来一定的困难。然而,实罐灭菌的操作比较简单, 染菌的机会较少,而且当采用较低的冷却温度和较大的冷却面积时,对培养基的质量影 响较小。 为了降低高温对培养基成分的破坏,在设计批式灭菌的工序时,应该将升温和降温 过程也考虑进去,即Del系数a=Del升a+Dl+Del恒温期。 Del系数随发酵罐体积增大而增大。为达到较高的Del系数而增加恒温时间将会增 加养分的破坏,而且,随着规模的增大,升温和降温过程对养分的破坏将会加剧。这是 批式灭菌的规模增大会造成产量下降的原因之一。较好的解决方法是采用连续灭菌法。 5)连续灭菌法( continous sterilization) 在考察Del系数时,显然可见采用高温瞬时灭菌将更有利于达到灭菌目的,而且大 大降低了对培养基成分的破坏。有人做过试验,将芽孢和维生素在高压下加热,当温度 为118℃,加热时间为15分钟时,杀死9999%芽孢,维生素的破坏率为10%;而当加 热温度为128℃,时间1.5分钟时,芽孢同样可杀死999%,维生素的破坏率却下降为 5%。所以,理想的手段是将培养基瞬间升温,然后迅速降温至发酵温度。但是,实际操 作中将一大罐原料迅速加热到髙温,持续片刻后又迅速冷却显然是不可能的。能实现短 时高温灭菌效果的唯一可行方法是流动式连续灭菌。就是将培养基在发酵罐外按需要连 续不断地加热、保温和冷却,然后送入发酵罐内。一般采用135~140℃、5~15秒短暂的 加热过程,然后需要在维持罐内继续保温5-8分钟,以达到彻底灭菌的目的。输送培养 基泵的出口压力一般为6公斤厘米2,所以总蒸汽压力要求达到45~50公斤/厘米2以 上。两者压力接近时才能使培养基的流速维持均匀稳定,否则,流速的变化将影响灭菌 的效果。连续加压灭菌既达到了灭菌的目的,又减少了营养物质的损失。同时,总的灭 菌时间减少了,还能提高发酵罐的利用率。操作过程的劳动强度低,适合采用自动化操 典型的培养基的连续灭菌的流程见图3.5.5。 冷却水 物料和水 蒸汽 AAA无菌培养基 送入发酵罐 配料罐预热罐灭菌器维持罐冷却器 60~75c°)(1300°10-12秒)(保温5~8分钟) 图355培养基连续灭菌示意图 6尽 图536双层螺旋型换热器 早期的连续灭菌器是由一些板式换热器组成的。它们存在两大不足。一是若平板间
《工业微生物学》 第三章 6 实罐灭菌需要较长时间在罐内加热和冷却培养基，如一个 50m3 的发酵罐，装料 35m3，从预热到消后冷却，就需要 8 小时左右。这段时间发酵罐不能用于发酵，所以， 实罐灭菌的设备利用率要低于连续灭菌。由于实罐灭菌是间歇性操作，蒸汽负荷高峰相 对集中，这也将给蒸汽的供应系统带来一定的困难。然而，实罐灭菌的操作比较简单， 染菌的机会较少，而且当采用较低的冷却温度和较大的冷却面积时，对培养基的质量影 响较小。 为了降低高温对培养基成分的破坏，在设计批式灭菌的工序时，应该将升温和降温 过程也考虑进去，即 Del 系数总 = Del 升温 + Del 冷却 + Del 恒温期 。 Del 系数随发酵罐体积增大而增大。为达到较高的 Del 系数而增加恒温时间将会增 加养分的破坏，而且，随着规模的增大，升温和降温过程对养分的破坏将会加剧。这是 批式灭菌的规模增大会造成产量下降的原因之一。较好的解决方法是采用连续灭菌法。 5) 连续灭菌法( continous sterilization) 在考察 Del 系数时，显然可见采用高温瞬时灭菌将更有利于达到灭菌目的，而且大 大降低了对培养基成分的破坏。有人做过试验，将芽孢和维生素在高压下加热，当温度 为 118℃，加热时间为 15 分钟时，杀死 99.99%芽孢，维生素的破坏率为 10%；而当加 热温度为 128℃，时间 1.5 分钟时，芽孢同样可杀死 99.99%，维生素的破坏率却下降为 5%。所以，理想的手段是将培养基瞬间升温，然后迅速降温至发酵温度。但是，实际操 作中将一大罐原料迅速加热到高温，持续片刻后又迅速冷却显然是不可能的。能实现短 时高温灭菌效果的唯一可行方法是流动式连续灭菌。就是将培养基在发酵罐外按需要连 续不断地加热、保温和冷却，然后送入发酵罐内。一般采用 135~140℃、5~15 秒短暂的 加热过程，然后需要在维持罐内继续保温 5~8 分钟，以达到彻底灭菌的目的。输送培养 基泵的出口压力一般为 6 公斤/厘米 2，所以总蒸汽压力要求达到 4.5~5.0 公斤/厘米 2 以 上。两者压力接近时才能使培养基的流速维持均匀稳定，否则，流速的变化将影响灭菌 的效果。连续加压灭菌既达到了灭菌的目的，又减少了营养物质的损失。同时，总的灭 菌时间减少了，还能提高发酵罐的利用率。操作过程的劳动强度低，适合采用自动化操 作。 典型的培养基的连续灭菌的流程见图 3.5.5。 图 3.5.5 培养基连续灭菌示意图 图 5.3.6 双层螺旋型换热器 早期的连续灭菌器是由一些板式换热器组成的。它们存在两大不足。一是若平板间
《工业微生物学》第三章 的填料出现故障将会造成已消毒的蒸汽和未消毒的蒸汽混合:二是培养基中的颗粒成分 会堵塞换热器。现代的连续灭菌器是双层螺旋型换热器,见图53.6。两层不锈钢薄板 围绕中轴旋转形成两层平行的螺旋通道。螺旋通道的末端被封闭。为达到灭菌温度,蒸 汽通过其中一层螺旋通道,而培养基逆流通过另一层螺旋通道。螺旋换热器也可作为冷 却器用于流岀培养基的冷却。而配料罐流出的培养基在注入灭菌器前可作为第一冷却器 的冷源而被预热,省略了预热罐。同时使流岀的培养基得到一定的冷却。这种换热器能 保证两股流体分开,而且,不易被颗粒堵塞。恒温的时间由蛇管的长度和培养基的流速 来调控 连续处理过程主要优点是可以使用一个较高的灭菌温度和较短的恒温时间,所以养 分损失较小。连续灭菌过程中培养基是一点点加入的,所以相对于批式灭菌系统其升温 和降温所需的时间也较短。但是,批式灭菌与连续灭菌法相比仍有它的优势,如(1) 设备投资省。连续灭菌需要较高的控制精度,需要较为成熟的计算机控制系统;(2)受 污染的风险小,因为连续灭菌时必须将无菌发酵液通过无菌操作输送到发酵罐中;(3)更 易于人工控制:(4)便于对固体成分较高的培养基进行灭菌。所以,目前连续灭菌只是 种供选用的灭菌方法,批式灭菌仍被大多数发酵企业所采用。 发酵过程中需要添加各种各样添加剂。对添加剂灭菌的方法应依其性质、体积和进 料速度而定。如果,添加剂是以大剂量进料,那需要采用连续灭菌法。一般采取将蒸汽 通入补料的储罐进行批式灭菌。如糖水罐灭菌的压力1Kgcm2,时间30分钟左右。油(消 泡剂)罐灭菌的压力1.5~1.8Kg/cm2,时间60分钟。灭菌时,糖水要翻腾良好,但温度 不能过高,否则,将使糖分大量破坏。不论采用哪种灭菌法,都需对进料的辅助设备和 管路进行灭菌。一般都应灭菌保温60分钟。 生产用的大多数微生物存在“异种”基因,所以,它们将受到严格的污染控制。这 些微生物发酵的废液在排放之前必须灭活。灭活可采取分批或连续法。批式操作是将蒸 汽通入恒温槽中。连续法是采用前面讨论过的热交换器。无论哪种方法,处理液都要冷 却到60℃以下再倾倒。 虽然,高温是有效的灭菌手段,但是,它也对被灭菌物品带来以下一些不利的影响 有机物多肽类沉淀 高温灭菌的「形成沉淀物(无机物磷酸盐、碳酸盐沉淀 不利影响 破坏营养成分(产生氨基糖、焦糖和黑色素) 改变pH值 (一般会降低pH值) 降低培养基浓度(冷凝水的聚集) 髙温灭菌过程对培养基的破坏主要有两种情况:造成培养基成分相互作用:造成 热稳定性差的化学成分的破坏 前者在降低培养基质量的同时,还会引起培养基变色、沉淀。变色反应一般是由来 自还原糖的羰基与氨基酸和蛋白质中的氨基反应而引起的。在加热情况下,培养基中 Ca2、Fe3等成分易与磷酸盐发生沉淀反应。 后者使某些维生素、氨基酸、蛋白质和糖等遭到破坏。例如:10%的葡萄糖溶液经 21℃灭菌15分钟后,会被破坏24% 在某些特殊情况下,可采取过滤除菌等方法。然而,对于大多数发酵过程,以上问 题都可以通过选择合适的灭菌条件加以解决 (1)分开灭菌对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其它成分分开灭菌,冷却后 再混合。将培养基中Ca2-、Fe3成分与磷酸盐分别灭菌,以免发生沉淀反应 (2)低温灭菌葡萄糖经过112℃(0.75Kgcm2,或8磅/in2)灭菌l5分钟,只会破坏了 0.60%。所以,对这些成分可通过降低灭菌温度或缩短灭菌时间,尽可能减少损失。 (3)间歇灭菌采用丁达尔灭菌法 (4)连续灭菌连续灭菌可以缩短灭菌的时间,减少营养成分的损失。 在实际工作中,无论采用哪种灭菌的方法,都不能也没有必要做到理论上的彻底无
《工业微生物学》 第三章 7 的填料出现故障将会造成已消毒的蒸汽和未消毒的蒸汽混合；二是培养基中的颗粒成分 会堵塞换热器。现代的连续灭菌器是双层螺旋型换热器，见图 5.3.6 。两层不锈钢薄板， 围绕中轴旋转形成两层平行的螺旋通道。螺旋通道的末端被封闭。为达到灭菌温度，蒸 汽通过其中一层螺旋通道，而培养基逆流通过另一层螺旋通道。螺旋换热器也可作为冷 却器用于流出培养基的冷却。而配料罐流出的培养基在注入灭菌器前可作为第一冷却器 的冷源而被预热，省略了预热罐。同时使流出的培养基得到一定的冷却。这种换热器能 保证两股流体分开，而且，不易被颗粒堵塞。恒温的时间由蛇管的长度和培养基的流速 来调控。 连续处理过程主要优点是可以使用一个较高的灭菌温度和较短的恒温时间，所以养 分损失较小。连续灭菌过程中培养基是一点点加入的，所以相对于批式灭菌系统其升温 和降温所需的时间也较短。但是，批式灭菌与连续灭菌法相比仍有它的优势，如（1） 设备投资省。连续灭菌需要较高的控制精度，需要较为成熟的计算机控制系统；(2 ) 受 污染的风险小，因为连续灭菌时必须将无菌发酵液通过无菌操作输送到发酵罐中；(3) 更 易于人工控制；(4) 便于对固体成分较高的培养基进行灭菌。所以，目前连续灭菌只是 一种供选用的灭菌方法，批式灭菌仍被大多数发酵企业所采用。 发酵过程中需要添加各种各样添加剂。对添加剂灭菌的方法应依其性质、体积和进 料速度而定。如果，添加剂是以大剂量进料，那需要采用连续灭菌法。一般采取将蒸汽 通入补料的储罐进行批式灭菌。如糖水罐灭菌的压力 1Kg/cm2，时间 30 分钟左右。油（消 泡剂）罐灭菌的压力 1.5~1.8Kg/cm2，时间 60 分钟。灭菌时，糖水要翻腾良好，但温度 不能过高，否则，将使糖分大量破坏。.不论采用哪种灭菌法，都需对进料的辅助设备和 管路进行灭菌。一般都应灭菌保温 60 分钟。 生产用的大多数微生物存在“异种”基因，所以，它们将受到严格的污染控制。这 些微生物发酵的废液在排放之前必须灭活。灭活可采取分批或连续法。批式操作是将蒸 汽通入恒温槽中。连续法是采用前面讨论过的热交换器。无论哪种方法，处理液都要冷 却到 60℃以下再倾倒。 虽然，高温是有效的灭菌手段，但是，它也对被灭菌物品带来以下一些不利的影响： 高温灭菌过程对培养基的破坏主要有两种情况：造成培养基成分相互作用；造成 热稳定性差的化学成分的破坏。 前者在降低培养基质量的同时，还会引起培养基变色、沉淀。变色反应一般是由来 自还原糖的羰基与氨基酸和蛋白质中的氨基反应而引起的。在加热情况下，培养基中 Ca2+、Fe3+等成分易与磷酸盐发生沉淀反应。 后者使某些维生素、氨基酸、蛋白质和糖等遭到破坏。例如：10%的葡萄糖溶液经 121℃灭菌 15 分钟后，会被破坏 24%。 在某些特殊情况下，可采取过滤除菌等方法。然而，对于大多数发酵过程，以上问 题都可以通过选择合适的灭菌条件加以解决： (1) 分开灭菌 对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其它成分分开灭菌，冷却后 再混合。将培养基中 Ca2+、Fe3+成分与磷酸盐分别灭菌，以免发生沉淀反应。 (2) 低温灭菌 葡萄糖经过 112℃（0.75Kg/cm2 ,或 8 磅/in2 ）灭菌 15 分钟，只会破坏了 0.60%。所以，对这些成分可通过降低灭菌温度或缩短灭菌时间，尽可能减少损失。 (3) 间歇灭菌 采用丁达尔灭菌法。 (4) 连续灭菌 连续灭菌可以缩短灭菌的时间，减少营养成分的损失。 在实际工作中，无论采用哪种灭菌的方法，都不能也没有必要做到理论上的彻底无 有机物 多肽类沉淀 高温灭菌的 形成沉淀物 无机物 磷酸盐、碳酸盐沉淀 不利影响 破坏营养成分 （ 产生氨基糖、焦糖和黑色素） 改变 pH 值 （ 一般会降低 pH 值） 降低培养基浓度 （ 冷凝水的聚集）
《工业微生物学》 菌。对发酵工业而言,只要做到染杂菌的概率在1%以下,就可满足发酵的基本要求。 过高的灭菌指标往往造成营养物的过度损失、能耗及其它操作成本的增加。 3513过滤除菌法( filter sterilization) 过滤器主要有两类。一类是绝对过滤器( absolute filter),过滤介质呈膜状,其滤孔比 要除去的颗粒的直径小。理论上可以100%除去微生物;另一类是深层过滤器( deptl fitr),其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大。它们由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维等 组成。“绝对”和“深层”术语的描述并不准确。因为绝对过滤器的过滤作用并不只发 生在过滤器的表面,其实它也有一定厚度,过滤器的内部与表面一样有过滤作用。因此, 有人将前者称为固定孔过滤器( fixed pore filter)),其空隙的孔径均一;后者称为非固定孔 过滤器( non-fixed pore filter)),其空隙的孔径不均一。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是 拦截作用( Interception)。可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为 也有一定的厚度,所以,也可通过惯性碰撞( inertial impaction)、扩散( diffusion)和吸附 ( electrostatic attraction)等作用去除比孔径小的颗粒。这些作用在空气过滤时显得格外重 要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降。采用带许多皱褶的薄膜可 以增大表面积,从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性碰撞、扩散和吸 附等作用除菌,而非拦截作用。从理论上讲,它不可能绝对地去除所有的颗粒。深层过 滤介质可分为两类。一类如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等,它们要 填充在一定的容器中定形:另一类已制成板或管状。如石棉板和烧结材料等。这些材料 的除菌效率比前一类高。 1)培养基的过滤除菌 对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基,无法采用高温灭菌法,但 可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚 丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料,也有石棉板、烧结陶瓷和烧结金属等深层过滤 材料。实验室中常用察氏( Seitz)滤器和一些膜过滤器,见图3.5.7。 待灭菌培养基 褚液杯 今分石棉板 固定夹 固定架 ←一滤膜 沙芯垫台 ◎橡胶塞 接真空泵 收集瓶 无菌培养基 图357实验室用过滤除菌装置1经典的察氏过滤器;2目前常见的膜过滤器 实验室常用滤器的孔径是045μm和0.22um。可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉 菌等通过。图358是采用醋酸纤维素膜过滤器所拦截的大肠杆菌。常用的过滤器一般 无法去除病毒。如果有必要,可使用孔径θ.04μm的过滤器去除病毒。通常情况下,可 将一系列不同的滤器组合使用。如用于制备无菌、无支原体的血清过滤系统。它包括四 个按顺序安装的过滤器。第一道过滤器是带正电的聚丙烯膜过滤器,其直径5μm,用 于去除粗糙的沉淀物、块状物等。第二道也是带正电的聚丙烯膜过滤器,其直径0.5μm 可以去除大部分微生物和脂类物质等。第三道是带正电的单层尼龙/聚酯膜过滤器,其孔 径0.lum,可进一步去除微生物和内毒素。第四道过滤器与第三道相似,但它是双层 结构,可以去除支原体,并保证绝对无菌。联合使用多级过滤器可以延长昂贵的小孔径
《工业微生物学》 第三章 8 菌。对发酵工业而言，只要做到染杂菌的概率在 1%以下，就可满足发酵的基本要求。 过高的灭菌指标往往造成营养物的过度损失、能耗及其它操作成本的增加。 3.5.1.3 过滤除菌法(filter sterilization) 过滤器主要有两类。一类是绝对过滤器(absolute filter)，过滤介质呈膜状，其滤孔比 要除去的颗粒的直径小。理论上可以 100%除去微生物；另一类是深层过滤器(depth filter)，其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大。它们由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维等 组成。“绝对”和“深层”术语的描述并不准确。因为绝对过滤器的过滤作用并不只发 生在过滤器的表面，其实它也有一定厚度，过滤器的内部与表面一样有过滤作用。因此， 有人将前者称为固定孔过滤器(fixed pore filter)，其空隙的孔径均一；后者称为非固定孔 过滤器(non-fixed pore filter)，其空隙的孔径不均一。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是 拦截作用(interception)。可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为 也有一定的厚度，所以，也可通过惯性碰撞(inertial impaction)、扩散(diffusion)和吸附 (electrostatic attraction)等作用去除比孔径小的颗粒。这些作用在空气过滤时显得格外重 要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降。采用带许多皱褶的薄膜可 以增大表面积，从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性碰撞、扩散和吸 附等作用除菌，而非拦截作用。从理论上讲，它不可能绝对地去除所有的颗粒。深层过 滤介质可分为两类。一类如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，它们要 填充在一定的容器中定形；另一类已制成板或管状。如石棉板和烧结材料等。这些材料 的除菌效率比前一类高。 1)培养基的过滤除菌 对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基，无法采用高温灭菌法，但 可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚 丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料，也有石棉板、烧结陶瓷和烧结金属等深层过滤 材料。实验室中常用察氏（Seitz）滤器和一些膜过滤器，见图 3.5.7。 图 3.5.7 实验室用过滤除菌装置 1.经典的察氏过滤器；2.目前常见的膜过滤器 实验室常用滤器的孔径是 0.45m 和 0.22m 。可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉 菌等通过。图 3.5.8 是采用醋酸纤维素膜过滤器所拦截的大肠杆菌。常用的过滤器一般 无法去除病毒。如果有必要，可使用孔径 0.04m 的过滤器去除病毒。通常情况下，可 将一系列不同的滤器组合使用。如用于制备无菌、无支原体的血清过滤系统。它包括四 个按顺序安装的过滤器。第一道过滤器是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径 5m ，用 于去除粗糙的沉淀物、块状物等。第二道也是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径 0.5m 。 可以去除大部分微生物和脂类物质等。第三道是带正电的单层尼龙/聚酯膜过滤器，其孔 径 0.1m ，可进一步去除微生物和内毒素。第四道过滤器与第三道相似，但它是双层 结构，可以去除支原体，并保证绝对无菌。联合使用多级过滤器可以延长昂贵的小孔径
《工业微生物学》第三章 过滤器的使用寿命 图358醋酸纤维素膜过滤器拦截的大肠杆菌图片 2)空气过滤除菌 绝大多数工业生产菌是好氧性的,发酵过程中必须通入无菌空气来满足生产菌的生 理需求。工业发酵中的空气系统通常采用过滤法去除空气中的菌体、灰尘和水分等。其 一般过程见图359 通常将天空高处的空气吸入后,经过粗过滤器初滤,然后进入空气压缩机。提高空 气吸入口的高度可以减少吸入空气的微生物的含量。据报道,吸气口每提高3.05米,微 生物数量减少一个数量级。由于空气中的微生物数量因地区、气候而不同,因此吸气口 的高度也应因地制宜。一般以离地面5~10米较好。在吸气口处需要设置防止颗粒及杂 质吸入的筛网(也可装在粗过滤器上)。吸入空气在进入压缩机前先经过粗过滤器过滤 可以减少进入空压机的灰尘和微生物,减少往复式压缩机活塞和汽缸的磨损,也减轻过 滤除菌的负荷。常用的粗过滤器由油浸铁丝网、油浸铁环或泡沫塑料等材料构成。 空气吸风[ 空气储罐 空气加热器 丝网除沫器 进发酵罐 空气冷却器 粗过滤器 分过滤器 旋风分离器 总过滤器 空气压缩机 分水器 图359空气过滤除菌系统 从空气压缩机出来的空气(一般压力在20Kgcm2以上,温度120~150℃),先冷却 至适当温度(20~25℃)除去油和水,再加热至30-35℃,最后通过总空气过滤器和分过 滤器(有时不用分过滤器)除菌,获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭 菌空气 空气中的微生物通常不单独存在,而是依附在尘埃和雾滴上。因此,空气进入压缩 机前应尽量去除尘埃和雾滴。空气中的雾滴不仅带有微生物,而且,还会使空气过滤器 中的过滤介质受潮而降低除菌效率,以及使空气过滤器的阻力增大。因此,必须设法使 进入过滤器的空气保持相对湿度在50~60%左右。从空气压缩机出来的空气,温度为120
《工业微生物学》 第三章 9 过滤器的使用寿命。 图 3.5.8 醋酸纤维素膜过滤器拦截的大肠杆菌图片 2) 空气过滤除菌 绝大多数工业生产菌是好氧性的，发酵过程中必须通入无菌空气来满足生产菌的生 理需求。工业发酵中的空气系统通常采用过滤法去除空气中的菌体、灰尘和水分等。其 一般过程见图 3.5.9。 通常将天空高处的空气吸入后，经过粗过滤器初滤，然后进入空气压缩机。提高空 气吸入口的高度可以减少吸入空气的微生物的含量。据报道，吸气口每提高 3.05 米，微 生物数量减少一个数量级。由于空气中的微生物数量因地区、气候而不同，因此吸气口 的高度也应因地制宜。一般以离地面 5~10 米较好。在吸气口处需要设置防止颗粒及杂 质吸入的筛网（也可装在粗过滤器上）。吸入空气在进入压缩机前先经过粗过滤器过滤， 可以减少进入空压机的灰尘和微生物，减少往复式压缩机活塞和汽缸的磨损，也减轻过 滤除菌的负荷。常用的粗过滤器由油浸铁丝网、油浸铁环或泡沫塑料等材料构成。 图 3.5.9 空气过滤除菌系统 从空气压缩机出来的空气（一般压力在 2.0Kg/cm2 以上，温度 120~150℃），先冷却 至适当温度（20~ 25℃)除去油和水，再加热至 30~35℃，最后通过总空气过滤器和分过 滤器（有时不用分过滤器）除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭 菌空气。 空气中的微生物通常不单独存在，而是依附在尘埃和雾滴上。因此，空气进入压缩 机前应尽量去除尘埃和雾滴。空气中的雾滴不仅带有微生物，而且，还会使空气过滤器 中的过滤介质受潮而降低除菌效率，以及使空气过滤器的阻力增大。因此，必须设法使 进入过滤器的空气保持相对湿度在 50~60%左右。从空气压缩机出来的空气，温度为 120
《工业微生物学》第三章 ℃(往复式压缩机)或150℃(涡轮式压缩机),其相对湿度大大降低,如果在此高温下 就进入空气过滤器,可减少压缩空气中夹带的水分,使过滤介质保持干燥。但是,一般 的过滤介质耐受不了这样的高温,因此,压缩空气一般是先经过一级冷却器将温度降至 40~50℃左右,再经二级冷却器将温度降至20~25℃。冷却后空气的相对湿度提高到 100%,所以,水分凝结成水滴或雾沫。用旋风分离器和丝网除沫器等将它们分离出去 然后再将压缩空气加热,降低其相对湿度,使未除尽的水分不致于凝结出来 空气通过往复式压缩机的汽缸后所夹带的油雾滴,同样也会粘附微生物、降低过滤 器的除菌效率及使过滤阻力增大。通过以上冷却分离过程可以和水分一起分离除去。如 果往复式压缩机采用半无油润滑或无油润滑的,可大大降低压缩空气的油雾含量 空气过滤介质不仅要有较高的除菌效率,而且,还要能用高温灭菌、不易受油水沾 污、阻力小、成本低、来源充足、经久耐用和便于调换操作等特点。常用的空气过滤介 质有棉花和活性炭(总过滤器和分过滤器)、玻璃棉和活性炭(一级过滤)、超细玻璃纤 维纸(一般用在分过滤器)、石棉滤板(分过滤器)、烧结陶瓷和金属。 棉花和活性炭过滤器,因其介质层厚、体积大、吸油水的容量大,受油水影响相对 要小。但这种过滤器调换介质时较为麻烦。填充也不易均匀。气体处理的量不大且质量 差。尤其是遇水湿润会造成气阻增大。这种过滤器已逐渐被淘汰 超细玻璃纤维纸作为过滤介质时,一般采用4~6层叠在一起使用。其除菌效果较好 调换方便,但易被水、油所沾污,易被蒸汽冲击折裂。在空气预处理较好的情况下,采 用超细玻璃纤维纸作为总过滤器和分过滤器的介质,染菌率很低。但在空气预处理较差 的情况下,其除菌效果往往受影响较大 金属过滤器是用超细镍粉经压延等加工处理制成的管状的金属多孔滤膜,膜厚度约 07mm,每个短管即为一个过滤单元,根据处理量,可采用易一系列多管复式过滤装置 金属过滤器的除菌效率也较高,这使得过滤器体积可大大减小。一般在空气进罐前设置 粗滤(0.45μm)和精滤(0.2m)两道金属过滤器 聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯等疏水性微孔滤膜构成的过滤器是国际上八十年代发 展起来的高效空气滤菌新技术。聚四氟乙烯类是疏水性的,不会受潮,可以用蒸汽灭菌 由于质地柔软,可以随意褶叠,具有体积小,过滤面积大的优点,能抗气流和抗氨(有 时空气需加氨调整pH)。因为膜孔径可以均匀控制,所以气体净化的质量高。上述优势 使这类绝对过滤器已成为较理想的空气滤菌的替代产品 实验室中的超净工作台和超净室也是通过空气过滤系统,送入无菌的空气。 3514紫外线灭菌 紫外线是一种较常用的杀菌剂波长在210~313nm范围都有效,最常用的波长是 253.7nm左右。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用,但其穿透力很弱,一般只用于物 体表面和空间的消毒。其灭菌的原理主要是它作用于生物体的DNA,促其形成胸腺嘧 啶二聚体,造成菌体死亡。另外,它可使空气中氧形成臭氧(O3),臭氧也会与生物体 的活性成分发生氧化反应,造成它们失活 3515其它放射线灭菌 C0可放出y射线,它是较先进的杀菌剂。将待灭菌物品通过传送带经过Co0照射 区就可达到灭菌的目的。其优点每次可灭菌较多的物品,尤其是密封的物品,不耐热的 物品。不会留下污染物。医用的一次性塑料用品就是用Co0照射灭菌的。但是,该法对 设备的要求高,适用范围有限。如培养基等就不宜通过该法灭菌。 352常用控菌的化学方法 能抑制、杀死微生物的化学因素种类较多,用途也相当广泛,主要可以分为以下几
《工业微生物学》 第三章 10 ℃（往复式压缩机）或 150℃（涡轮式压缩机），其相对湿度大大降低，如果在此高温下 就进入空气过滤器，可减少压缩空气中夹带的水分，使过滤介质保持干燥。但是，一般 的过滤介质耐受不了这样的高温，因此，压缩空气一般是先经过一级冷却器将温度降至 40~50℃左右，再经二级冷却器将温度降至 20~25℃。冷却后空气的相对湿度提高到 100%，所以，水分凝结成水滴或雾沫。用旋风分离器和丝网除沫器等将它们分离出去。 然后再将压缩空气加热，降低其相对湿度，使未除尽的水分不致于凝结出来。 空气通过往复式压缩机的汽缸后所夹带的油雾滴，同样也会粘附微生物、降低过滤 器的除菌效率及使过滤阻力增大。通过以上冷却分离过程可以和水分一起分离除去。如 果往复式压缩机采用半无油润滑或无油润滑的，可大大降低压缩空气的油雾含量。 空气过滤介质不仅要有较高的除菌效率，而且，还要能用高温灭菌、不易受油水沾 污、阻力小、成本低、来源充足、经久耐用和便于调换操作等特点。常用的空气过滤介 质有棉花和活性炭（总过滤器和分过滤器）、玻璃棉和活性炭（一级过滤）、超细玻璃纤 维纸（一般用在分过滤器）、石棉滤板（分过滤器）、烧结陶瓷和金属。 棉花和活性炭过滤器，因其介质层厚、体积大、吸油水的容量大，受油水影响相对 要小。但这种过滤器调换介质时较为麻烦。填充也不易均匀。气体处理的量不大且质量 差。尤其是遇水湿润会造成气阻增大。这种过滤器已逐渐被淘汰。 超细玻璃纤维纸作为过滤介质时，一般采用 4~6 层叠在一起使用。其除菌效果较好， 调换方便，但易被水、油所沾污，易被蒸汽冲击折裂。在空气预处理较好的情况下，采 用超细玻璃纤维纸作为总过滤器和分过滤器的介质，染菌率很低。但在空气预处理较差 的情况下，其除菌效果往往受影响较大。 金属过滤器是用超细镍粉经压延等加工处理制成的管状的金属多孔滤膜，膜厚度约 0.7mm，每个短管即为一个过滤单元，根据处理量，可采用易一系列多管复式过滤装置。 金属过滤器的除菌效率也较高，这使得过滤器体积可大大减小。一般在空气进罐前设置 粗滤（0.45m）和精滤(0.22m)两道金属过滤器。 聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯等疏水性微孔滤膜构成的过滤器是国际上八十年代发 展起来的高效空气滤菌新技术。聚四氟乙烯类是疏水性的，不会受潮，可以用蒸汽灭菌。 由于质地柔软，可以随意褶叠，具有体积小，过滤面积大的优点，能抗气流和抗氨（有 时空气需加氨调整 pH）。因为膜孔径可以均匀控制，所以气体净化的质量高。上述优势 使这类绝对过滤器已成为较理想的空气滤菌的替代产品。 实验室中的超净工作台和超净室也是通过空气过滤系统，送入无菌的空气。 3.5.1.4 紫外线灭菌 紫外线是一种较常用的杀菌剂.波长在 210~313nm 范围都有效，最常用的波长是 253.7nm 左右。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力很弱，一般只用于物 体表面和空间的消毒。其灭菌的原理主要是它作用于生物体的 DNA，促其形成胸腺嘧 啶二聚体，造成菌体死亡。另外，它可使空气中氧形成臭氧（O3），臭氧也会与生物体 的活性成分发生氧化反应，造成它们失活。 3.5.1.5 其它放射线灭菌 CO 60 可放出射线，它是较先进的杀菌剂。将待灭菌物品通过传送带经过 CO 60 照射 区就可达到灭菌的目的。其优点每次可灭菌较多的物品，尤其是密封的物品，不耐热的 物品。不会留下污染物。医用的一次性塑料用品就是用 CO 60 照射灭菌的。但是，该法对 设备的要求高，适用范围有限。如培养基等就不宜通过该法灭菌。 3.5.2 常用控菌的化学方法 能抑制、杀死微生物的化学因素种类较多，用途也相当广泛，主要可以分为以下几 类：