第六章生产溶剂和有机酸的微生物 溶剂和有机酸都是微生物的初级代谢产物,与工业生产和人们日常生活有着十分密切的 关系,也是发酵工业中历史最悠久、吨位最大、价格最低的产品。自五十年代以来,有机酸 和溶剂发酵工业受到了来自石油化工的竞争,但是由于它们的原料是可再生的生物质资源 (如淀粉、纤维素等),与化学合成产物相比,发酵获得的产品更适用于食品、医药等工业部 门,加上在微生物育种和生产工艺方面的进步,这些传统的发酵工业仍具有强大的生命力 6.1简要的历史回顾 人类利用微生物生产饮料酒和食用醋的历史几乎与人类自身的历史同样古老,有记录的 酿酒历史可以追溯到公元前200年以前,我国在郑州附近商代遗址出土的窖藏酒说明我国 的劳动人们早在商代就掌握了酿酒技术。蒸馏酒精大约出现在十二世纪并首次用于饮料之外 的用途,先是作为溶剂,然后用于医药。无水酒精出现在1796年。到十九世纪末,酒精已 经广泛用于化学工业。五十年代石油化工的发展虽然对酒精发酵工业造成了威胁,但是由于 酒精发酵工业有丰富、廉价、而且可再生的原料来源,由于在发酵工艺及酒精蒸馏技术上的 改进及发酵酒精在饮料酒生产中不可替代的地位,由于无水酒精作为提高汽油辛烷值的无公 害添加剂用途的开发,酒精发酵工业不但没有被石油化工挤垮,反而逐渐收复了失地。以石 油化工最发达的美国为例,在五、六十年代酒精发酵工业几乎被石油化工所取代,但是目前 每年生产的二百万吨酒精中,发酵酒精的比例已经超过了90%。 二十世纪初,生物技术发展历史中具有里程碑意义的丙酮/醇发酵投入了工业化生产 这是人类第一次用人工筛选的微生物采用发酵法生产的化学品。早在1862年,法国微生物 学家 Pasteur就开始研究从乳酸和乳酸钙生产丁醇,随后,波兰人 Prazmowski将用于该过程 的厌氧微生物命名为 clostridia。s直到1905年 Schardinger才发现这种微生物除了能产生丁 醇外还产生丙酮。1912年 Weizmann分离得到了 Clostridium acetobutylicum,证明该菌能将 淀粉转化为丙酮、丁醇和乙醇并申请了英国专利。1914年爆发了第一次世界大战,出于战 争对火药的需要,迫切需要大量的丙酮,于是 Strange& Graham公司开始建厂,试图生产 丙酮,但是没有获得成功。然后 Weizmann接管了该工厂,并按他自己的方法成功地生产出 了丙酮和丁醇。由于当时还没有发现丁醇的适当用途,产量是丙酮一倍的丁醇就成了问题 战后, DuPont公司发明了从丁醇生产乙酸丁酯的方法并大量用于汽车工业用油漆的生产 从此丙酮/醇发酵进入了黄金时期,到1940年,丙酮和丁醇的产量分别达到了45万吨和 9万吨。以后,由于来自石油化工的竞争,各国的丙酮丁醇发酵工业在五、六十年代纷纷停 止了生产,目前只有在中国和南非还有少量生产厂。 乳酸是另一种历史悠久的微生物发酵产物,酸奶可能是人类的第一个发酵食品,而且 直沿用至今。1780年瑞士化学家 Scheele从酸奶中分离出了乳酸,1847年 Bloudeau证明了 乳酸是乳酸杆菌发酵的最终产物。1881年, Avery首先在美国实现了乳酸发酵的工业化生产 乳酸对碳源的利用率高,葡萄糖对乳酸的理论转化率是100%,实际转化率也达到了90%以上, 因此生产成本底廉。今天,乳酸不但在食品、制革和医药等工业部门广泛应用,而且由于乳 酸的聚合物或共聚物是可以生物降解的高分子材料,已经在生物医药工程和包装材料领域中 得到了应用,具有广阔的市场。有人预料,乳酸将成为产量最大的30种有机化学品之 柠檬酸原来是从柠檬中分离得到的,主要应用于食品工业和洗涤剂,意大利人曾经控制 了世界的柠檬酸生产。183年, Wehmer发现一种青霉能够积累柠檬酸,但是他的工业化企 图却以失败而告终。1917年,Curi发现了一株产柠檬酸的黑曲霉,并通过美国的 Pfizer(辉 瑞)公司于19〗23年采用浅盘发酵实现了工业化生产。柠檬酸液体深层发酵到五十年代初才获
1 第六章 生产溶剂和有机酸的微生物 溶剂和有机酸都是微生物的初级代谢产物，与工业生产和人们日常生活有着十分密切的 关系，也是发酵工业中历史最悠久、吨位最大、价格最低的产品。自五十年代以来，有机酸 和溶剂发酵工业受到了来自石油化工的竞争，但是由于它们的原料是可再生的生物质资源 (如淀粉、纤维素等)，与化学合成产物相比，发酵获得的产品更适用于食品、医药等工业部 门，加上在微生物育种和生产工艺方面的进步，这些传统的发酵工业仍具有强大的生命力。 6.1 简要的历史回顾 人类利用微生物生产饮料酒和食用醋的历史几乎与人类自身的历史同样古老，有记录的 酿酒历史可以追溯到公元前 2000 年以前，我国在郑州附近商代遗址出土的窖藏酒说明我国 的劳动人们早在商代就掌握了酿酒技术。蒸馏酒精大约出现在十二世纪并首次用于饮料之外 的用途，先是作为溶剂，然后用于医药。无水酒精出现在 1796 年。到十九世纪末，酒精已 经广泛用于化学工业。五十年代石油化工的发展虽然对酒精发酵工业造成了威胁，但是由于 酒精发酵工业有丰富、廉价、而且可再生的原料来源，由于在发酵工艺及酒精蒸馏技术上的 改进及发酵酒精在饮料酒生产中不可替代的地位，由于无水酒精作为提高汽油辛烷值的无公 害添加剂用途的开发，酒精发酵工业不但没有被石油化工挤垮，反而逐渐收复了失地。以石 油化工最发达的美国为例，在五、六十年代酒精发酵工业几乎被石油化工所取代，但是目前 每年生产的二百万吨酒精中，发酵酒精的比例已经超过了 90%。 二十世纪初，生物技术发展历史中具有里程碑意义的丙酮/丁醇发酵投入了工业化生产。 这是人类第一次用人工筛选的微生物采用发酵法生产的化学品。早在 1862 年，法国微生物 学家 Pasteur 就开始研究从乳酸和乳酸钙生产丁醇，随后，波兰人 Prazmowski 将用于该过程 的厌氧微生物命名为 Clostridium。直到 1905 年 Schardinger 才发现这种微生物除了能产生丁 醇外还产生丙酮。1912 年 Weizmann 分离得到了 Clostridium acetobutylicum，证明该菌能将 淀粉转化为丙酮、丁醇和乙醇并申请了英国专利。1914 年爆发了第一次世界大战，出于战 争对火药的需要，迫切需要大量的丙酮，于是 Strange & Graham 公司开始建厂，试图生产 丙酮，但是没有获得成功。然后 Weizmann 接管了该工厂，并按他自己的方法成功地生产出 了丙酮和丁醇。由于当时还没有发现丁醇的适当用途，产量是丙酮一倍的丁醇就成了问题。 战后，DuPont 公司发明了从丁醇生产乙酸丁酯的方法并大量用于汽车工业用油漆的生产， 从此丙酮/丁醇发酵进入了黄金时期，到 1940 年，丙酮和丁醇的产量分别达到了 4.5 万吨和 9 万吨。以后，由于来自石油化工的竞争，各国的丙酮/丁醇发酵工业在五、六十年代纷纷停 止了生产，目前只有在中国和南非还有少量生产厂。 乳酸是另一种历史悠久的微生物发酵产物，酸奶可能是人类的第一个发酵食品，而且一 直沿用至今。1780 年瑞士化学家 Scheele 从酸奶中分离出了乳酸，1847 年 Bloudeau 证明了 乳酸是乳酸杆菌发酵的最终产物。1881 年，Avery 首先在美国实现了乳酸发酵的工业化生产。 乳酸对碳源的利用率高，葡萄糖对乳酸的理论转化率是 100%，实际转化率也达到了 90%以上， 因此生产成本底廉。今天，乳酸不但在食品、制革和医药等工业部门广泛应用，而且由于乳 酸的聚合物或共聚物是可以生物降解的高分子材料，已经在生物医药工程和包装材料领域中 得到了应用，具有广阔的市场。有人预料，乳酸将成为产量最大的 30 种有机化学品之一。 柠檬酸原来是从柠檬中分离得到的，主要应用于食品工业和洗涤剂, 意大利人曾经控制 了世界的柠檬酸生产。1883 年，Wehmer 发现一种青霉能够积累柠檬酸，但是他的工业化企 图却以失败而告终。1917 年，Currie 发现了一株产柠檬酸的黑曲霉，并通过美国的 Pfizer(辉 瑞)公司于 1923 年采用浅盘发酵实现了工业化生产。柠檬酸液体深层发酵到五十年代初才获
得成功,八十年代则开发成功了用正烷烃发酵生产柠檬酸的新工艺。柠檬酸不但是食品工业 中最重要的酸味剂,而且是生产无磷洗涤剂的重要原料。目前从柠檬中提取柠檬酸已经完全 被发酵工业所取代。葡萄糖酸发酵生产菌的发现和工业化发展历史几乎与柠檬酸平行;衣康 酸发酵的工业化则要晚得多,在四十年代中期才出现浅盘发酵技术。一些本来采用发酵法生 产的有机酸,如苹果酸、酒石酸、富马酸及琥珀酸等,现在已经改用酶法或者采用化学合成 方法进行生产。 6.2溶剂发酵的微生物 6.2.1酒精发酵的微生物 酒精是产量最大的发酵工业产品,酒精发酵的主要原料是各种糖类物质。由于酒精的价 格低廉,因此微生物对原料的利用率、酒精产率及生产过程的能耗就成了酒精工业的关键因 素,这样用于酒精发酵的微生物应该符合如下要求:产物酒精相对于所利用底物的转化率 高、发酵速度快、对酒精的耐受力强、能够在较高的温度及偏酸性的p条件下发酵、对底 物的适应范围广等。最重要的酒精发酵微生物可以分为以下三大类:代谢葡萄糖的酵母、代 谢葡萄糖的细菌及代谢木糖的酵母 6.2.1.1葡萄糖发酵生产酒精的酵母 葡萄糖的代谢途径为酵解或称为巸 moden- Meyerhof途径。属于厌氧(微耗氧)发酵,理 论产率为每一分子葡萄糖产生各两分子的乙醇、CO2及ATP,或每克葡萄糖生产0.51克乙醇, 实际产率一般能达到理论产率的90%以上。常用的酵母品种有:啤酒酵母( Saccharomvces cerevisiae)、葡萄汁酵母(S.uarⅧ或称为S. carlsbergensis)、裂殖酵母 ( Schizosaccharomyces pombe)及 Kluyveromyces等。上述酵母均属兼性厌氧菌,在酵母生 长期需要一定的氧气,在酒精发酵阶段则需要厌氧条件以提高酒精产率。 产物酒精会对酒精生产和酵母生长产生抑制作用,不同的酵母耐酒精能力也有很大 差别。对大多数酵母而言,当酒精浓度达到5%时就会停止生长,当酒精浓度从6%增加到12% 时,酒精生产速率逐渐减为零。某些耐酒精酵母的酒精浓度能够达到18%,发酵醪中高浓度 酒精有利于降低酒精蒸馏时的能耗。 酒精发酵是一个放热过程,普通啤酒酵母的最适发酵温度为30%C,因此在发酵罐中需 要通冷却水以保持发酵温度在30°℃C左右,为此需消耗大量能量。一些研究者选育得到的高 温酵母的最适发酵温度可以达到40-50°C,适合于气温较高地区的酒精发酵工业 酵母一般只能利用葡萄糖作为碳源,不能直接利用淀粉。在利用淀粉为原料时,必须先 将淀粉釆用酶法或酸法水解为葡萄糖,增加了酒精生产时的原材料消耗和能耗。因此,选育能 够直接代谢淀粉的酵母也将有利于降低酒精的生产成本。 6.2.1.2葡萄糖发酵生产酒精的细菌 许多细菌也能代谢葡萄糖生产酒精,同时还会产生其它醇、有机酸、酮等副产物及各种 气体。能够从每摩尔葡萄糖发酵产生一摩尔以上酒精的细菌见表6.2.1,其中最有实际应用 价值的是运动发酵单胞菌2 ymomonas mobilis。它的生长速率、底物消耗速率、产物生成速 率都高于酵母发酵,而细胞产率则低于酵母,因此具有较高的乙醇产率。Z. mobilis与葡 萄汁酵母间歇发酵的比较见表6.2.2,可以看到该细菌的发酵速率大于酵母,而乙醇产率要 比酵母高6%以上。在细菌发酵时,葡萄糖的代谢途径除 Embden- Meyerhoff(EM)途径外,还 有 Entner-υ oudorof(ED)途径。在ED途径中,葡萄糖磷酸化后被氧化为δ-磷酸葡萄糖酸 随后脱水生成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖(KDPG),再在KPG-缩醛酶的作用下切断。总反 应是一摩尔葡萄糖生成各二摩尔乙醇和CO,并产生一摩尔ATP
2 得成功，八十年代则开发成功了用正烷烃发酵生产柠檬酸的新工艺。柠檬酸不但是食品工业 中最重要的酸味剂，而且是生产无磷洗涤剂的重要原料。目前从柠檬中提取柠檬酸已经完全 被发酵工业所取代。葡萄糖酸发酵生产菌的发现和工业化发展历史几乎与柠檬酸平行；衣康 酸发酵的工业化则要晚得多，在四十年代中期才出现浅盘发酵技术。一些本来采用发酵法生 产的有机酸，如苹果酸、酒石酸、富马酸及琥珀酸等，现在已经改用酶法或者采用化学合成 方法进行生产。 6.2 溶剂发酵的微生物 6.2.1 酒精发酵的微生物 酒精是产量最大的发酵工业产品，酒精发酵的主要原料是各种糖类物质。由于酒精的价 格低廉, 因此微生物对原料的利用率、酒精产率及生产过程的能耗就成了酒精工业的关键因 素, 这样用于酒精发酵的微生物应该符合如下要求：产物酒精相对于所利用底物的转化率 高、发酵速度快、对酒精的耐受力强、能够在较高的温度及偏酸性的 pH 条件下发酵、对底 物的适应范围广等。最重要的酒精发酵微生物可以分为以下三大类：代谢葡萄糖的酵母、代 谢葡萄糖的细菌及代谢木糖的酵母。 6.2.1.1 葡萄糖发酵生产酒精的酵母 葡萄糖的代谢途径为酵解或称为 Embden-Meyerhof 途径。属于厌氧(微耗氧)发酵，理 论产率为每一分子葡萄糖产生各两分子的乙醇、CO2 及 ATP，或每克葡萄糖生产 0.51 克乙醇， 实际产率一般能达到理论产率的 90%以上。常用的酵母品种有：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 、葡萄汁酵母 (S. uvarum 或称为 S. carlsbergensis) 、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)及 Kluyverromyces 等。上述酵母均属兼性厌氧菌，在酵母生 长期需要一定的氧气，在酒精发酵阶段则需要厌氧条件以提高酒精产率。 产物酒精会对酒精生产和酵母生长产生抑制作用，不同的酵母耐酒精能力也有很大的 差别。对大多数酵母而言，当酒精浓度达到 5%时就会停止生长，当酒精浓度从 6%增加到 12% 时，酒精生产速率逐渐减为零。某些耐酒精酵母的酒精浓度能够达到 18%, 发酵醪中高浓度 酒精有利于降低酒精蒸馏时的能耗。 酒精发酵是一个放热过程, 普通啤酒酵母的最适发酵温度为 300 C, 因此在发酵罐中需 要通冷却水以保持发酵温度在 300 C 左右, 为此需消耗大量能量。一些研究者选育得到的高 温酵母的最适发酵温度可以达到 40-500 C, 适合于气温较高地区的酒精发酵工业。 酵母一般只能利用葡萄糖作为碳源,不能直接利用淀粉。在利用淀粉为原料时,必须先 将淀粉采用酶法或酸法水解为葡萄糖,增加了酒精生产时的原材料消耗和能耗。因此,选育能 够直接代谢淀粉的酵母也将有利于降低酒精的生产成本。 6.2.1.2 葡萄糖发酵生产酒精的细菌 许多细菌也能代谢葡萄糖生产酒精，同时还会产生其它醇、有机酸、酮等副产物及各种 气体。能够从每摩尔葡萄糖发酵产生一摩尔以上酒精的细菌见表 6.2.1，其中最有实际应用 价值的是运动发酵单胞菌 Zymomonas mobilis。它的生长速率、底物消耗速率、产物生成速 率都高于酵母发酵，而细胞产率则低于酵母，因此具有较高的乙醇产率。Z. mobilis 与葡 萄汁酵母间歇发酵的比较见表 6.2.2,可以看到该细菌的发酵速率大于酵母, 而乙醇产率要 比酵母高 6%以上。在细菌发酵时，葡萄糖的代谢途径除 Embden-Meyerhoff(EM)途径外，还 有 Entner-Doudorof(ED)途径。在 ED 途径中，葡萄糖磷酸化后被氧化为 6-磷酸葡萄糖酸， 随后脱水生成 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖（KDPG），再在 KDPG-缩醛酶的作用下切断。总反 应是一摩尔葡萄糖生成各二摩尔乙醇和 CO2, 并产生一摩尔 ATP
表6.2.1以乙醇为主要发酵产物的细菌 中温菌 嗜温菌 芽孢杆菌 1.8 耐热厌氧菌 1.9 Clostridium sphenoides Thermoanaerobacter ethanolicus 运动发酵单胞菌 1.9芽孢杆菌 Zymomonas mobil C. thermohydrosulfuricum 螺旋体菌 芽孢杆菌 Spirochaeta aurantia C. thermocellum 解淀粉杆菌 1.2 杆菌 1.0 Erwinia amylovora Bacillus stearothermophilus 明串珠菌 耐热厌氧菌 Leuconos toe Thermoanaerobium brock t 注:Y的单位是mol乙醇/mol葡萄糖 表6.2.22. mobilis和S. uvarum不通气间歇发酵结果的比较 (初始葡萄糖浓度为250g/L,30°℃,pH5.0) 动力学参数 S. uvarum 比生长速率,1/h 0.055 比葡萄糖消耗速率,q(gg"h) 比乙醇产生速率,q(g"h) 乙醇产率,Yp5(gg 0.4 相对乙醇产率(%) 92.5 最大乙醇浓度(g/L) 102 108 I核糖醇D阿拉伯糖 核糖0-末糖D-来苏糖D阿拉伯楼醇末糖醇 异构 异构酯异构酶脱氢氢酶 p-核酮糖 核的梗-5-磷 1D核裙5磷酚种蘸 0-末糖-5-磷酸 景天庚橞-7-碘酸 甘油能-3-磷酸 转醛糖 转配糖酶 一果糖-6-龄 图6.2.1在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的代谢途径 6.223戊糖发酵生产酒精的微生物 在木质纤维素中,半纤维素的含量约占20-40%,半纤维素的水解产物是以木糖为主的
3 表 6.2.1 以乙醇为主要发酵产物的细菌 中温菌 Y 嗜温菌 Y 芽孢杆菌 Clostridium sphenoides 1.8 耐热厌氧菌 Thermoanaerobacter ethanolicus 1.9 运动发酵单胞菌 Zymomonas mobilis 1.9 芽孢杆菌 C. thermohydrosulfuricum 1.8 螺旋体菌 Spirochaeta aurantia 1.5 芽孢杆菌 C. thermocellum 1.0 解淀粉杆菌 Erwinia amylovora 1.2 杆菌 Bacillus stearothermophilus 1.0 明串珠菌 Leuconostoe mesenteroides 1.1 耐热厌氧菌 Thermoanaerobium brockit 0.95 注:Y 的单位是 mol 乙醇/mol 葡萄糖 表 6.2.2 Z. mobilis 和 S. uvarum 不通气间歇发酵结果的比较 （初始葡萄糖浓度为 250g/L, 30o C, pH5.0） 动力学参数 Z. mobilis S. uvarum 比生长速率, 1/h 0.13 0.055 比葡萄糖消耗速率, qS(gg-1 h -1 ) 5.5 2.1 比乙醇产生速率, qP(gg-1 h -1 ) 2.5 0.87 细胞产率, YX/S(gg-1 ) 0.019 0.033 乙醇产率, YP/S(gg-1 ) 0.47 0.44 相对乙醇产率(%) 92.5 86 最大乙醇浓度(g/L) 102 108 图 6.2.1 在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的代谢途径 6.2.2.3 戊糖发酵生产酒精的微生物 在木质纤维素中，半纤维素的含量约占 20-40%，半纤维素的水解产物是以木糖为主的
戊糖,因此木糖发酵就成了综合利用可再生生物质资源的关键。自七十年代以来,利用微生 物发酵从木糖生产酒精的研究工作从未间断并取得了很大的进展,发现了许多能够发酵木 糖生产酒精的微生物。它们中既有细菌也有酵母和霉菌 图6.2.1说明了在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的三条不同的代谢途径:1)由异构酶催 化的醛糖异构化反应将醛糖转化为酮糖,然后磷酸化:2)通过脱氢酶催化的氧化还原反应将 戊糖醇转化为戊酮糖然后磷酸化:3)由磷酸激酶催化戊糖直接磷酸化。所得到的D木酮糖 -5-磷酸及D-核糖-5-磷酸必须经过υ景夭庚糖-τ-磷酸,赤藓糖-4-磷酸和D甘油醛-3-磷 酸途径形成果糖-6-磷酸,随后进λ糖酵解途径。图6.2.2则显示了酵母中的戊糖和戊糖醇 的代谢途径。虽然酵母中也存在木糖异构酶,但是戊糖的代谢主要通过氧化-还原反应途径 进行 戊糖醇 脱氢酶 L阿拉伯糖一 >L阿拉伯糖醇 戊糖循环 L-不酮糖 说氢酶 氢酶 D不糖 ≥不糖游 D同拉伯般脱图>p何拉伯博、脱0末酮一 异构梅 木酮糖-5-磷酸 3-差向陈 脱氢酶 D-核酮糖-5-磷酸 脱氢 脱氢 D-核糖 >核糖醇 异构游 ≥D-核毽一5- 图6.22酵母中戊糖和戊糖醇的代谢途径 发酵木糖生产酒精的细菌主要有: Aeromonas hydrophila, Bacillus polymyxa, Aerobacter indologenes等,但是它们在产生酒精的同时还会产生2,3-丁二醇和各种有机 酸等发酵副产物,从而影响酒精的得率。表6.2.3显示了这三种细菌发酵葡萄糖和木糖时的 产物分布,从表中可以看到,产物的分布比较分散,乙醇的转化率比较低。 Bacillus macerans等也能够发酵木糖,主要产物是酒精、CO、H2、乙酸和丙酮,但能够利用的木糖 浓度只有约1%。厌氧嗜热菌 Clostridium thermosaccharolyticum及混合培养的C thermocellⅧm和C. thermosaccharolyticⅧm能够直接利用纤维素和半纤维素生产酒精、乳 酸和乙酸,其中后者可以从一克纤维素生产0.57克酒精。 能够利用木糖生产酒精的酵母见表6.2.4。其中研究得最多的是属于管囊酵母 ( Pachysolen)、假丝酵母( Candida)和毕赤酵母( Pichia)属的一些种,它们发酵木糖生产酒 精的一些典型数据见表6.2.5。可以看到,假丝酵母和毕赤酵母的发酵速率、酒精浓度和酒 精产率都比管囊酵母要高得多,是利用木糖生产酒精的较理想菌种,目前国内外都已经有应 用这两种酵母以亚硫酸纸浆废液中的木糖为碳源发酵生产酒精的工业化生产报道。与利用葡 萄糖进行啤酒酵母酒精发酵相比,木糖发酵生产酒精的过程发酵速率低、酵母对酒精的耐受
4 戊糖，因此木糖发酵就成了综合利用可再生生物质资源的关键。自七十年代以来，利用微生 物发酵从木糖生产酒精的研究工作从未间断并取得了很大的进展, 发现了许多能够发酵木 糖生产酒精的微生物。它们中既有细菌也有酵母和霉菌。 图 6.2.1 说明了在产气气杆菌中戊糖和戊糖醇的三条不同的代谢途径：1）由异构酶催 化的醛糖异构化反应将醛糖转化为酮糖,然后磷酸化；2）通过脱氢酶催化的氧化还原反应将 戊糖醇转化为戊酮糖然后磷酸化；3）由磷酸激酶催化戊糖直接磷酸化。所得到的 D-木酮糖 -5-磷酸及 D-核糖-5-磷酸必须经过 D-景天庚糖-7-磷酸, 赤藓糖-4-磷酸和 D-甘油醛-3-磷 酸途径形成果糖-6-磷酸, 随后进入糖酵解途径。图 6.2.2 则显示了酵母中的戊糖和戊糖醇 的代谢途径。虽然酵母中也存在木糖异构酶, 但是戊糖的代谢主要通过氧化-还原反应途径 进行。 图 6.2.2 酵母中戊糖和戊糖醇的代谢途径 发酵木糖生产酒精的细菌主要有：Aeromonas hydrophila, Bacillus polymyxa, Aerobacter indologens 等，但是它们在产生酒精的同时还会产生 2，3-丁二醇和各种有机 酸等发酵副产物, 从而影响酒精的得率。表 6.2.3 显示了这三种细菌发酵葡萄糖和木糖时的 产物分布，从表中可以看到，产物的分布比较分散，乙醇的转化率比较低。 Bacillus macerans 等也能够发酵木糖，主要产物是酒精、CO2、H2、乙酸和丙酮，但能够利用的木糖 浓度只有约 1%。厌氧嗜热菌 Clostridium thermosaccharolyticum 及混合培养的 C. thermocellum 和 C. thermosaccharolyticum 能够直接利用纤维素和半纤维素生产酒精、乳 酸和乙酸，其中后者可以从一克纤维素生产 0.57 克酒精。 能够利用木糖生产酒精的酵母见表 6.2.4。其中研究得最多的是属于管囊酵母 (Pachysolen)、假丝酵母(Candida)和毕赤酵母(Pichia)属的一些种，它们发酵木糖生产酒 精的一些典型数据见表 6.2.5。可以看到，假丝酵母和毕赤酵母的发酵速率、酒精浓度和酒 精产率都比管囊酵母要高得多, 是利用木糖生产酒精的较理想菌种, 目前国内外都已经有应 用这两种酵母以亚硫酸纸浆废液中的木糖为碳源发酵生产酒精的工业化生产报道。与利用葡 萄糖进行啤酒酵母酒精发酵相比, 木糖发酵生产酒精的过程发酵速率低、酵母对酒精的耐受
力差,而且发酵过程必须在微溶氧的条件下进行 表6.23三种细菌利用葡萄糖和木糖发酵时的产物分布(产物mo1/100m01糖) 发酵产物 A. hydrophila B. polymyxa indologenes 葡萄糖木糖葡萄糖木糖葡萄糖木糖 2,3-丁二醇 3-羟基丁酮 醇 182 「乙酸 甲 27.926.3 乳酸 23.3 CO2 199.6161.0153.0|114 碳转化率(%) 98.296.6101.692.997.0 表6.24木糖发酵生产酒精的酵母及产酒精和木糖醇能力 酉精(g/L)[木糖醇(g/L 酒香酵母, Bret tanomyces naardenensis CBS6041 1.8 假丝酵母, Candida guilliermondii 2.5 C.shehatae CSIR 57D1 C. shehatae yi2856 24.0 C. tenuis csir-y565 11.0 Kluyveromyces sp. KY5199 4.4 K.cellobiovorus KY5199 27.0 22.0 管囊酵母, Pachysolen tannophi/ US CBS6857 P. tannophilus Y 246050 16.0 丰赤酵母, Pichia stipitis cBs5773 P. stipitis 5Y-7124 20.0 P. stipitis CSIr-Y633 22.0 裂殖酵母, Schizosaccharomyces atco20130 5.0 1.4 表6.25三种酵母木糖发酵生产酒精的典型数据 酵母 浓度(g/L) 乙醇产生速率产率(g/木糖) PaxRi, gL 乙醇 管囊酵母, P. tannophI/1[500160.16 0.076 0.32 Y2460 0.058 半赤酵母,P. stipitis500200.28 0.170 0.000.41 Y7124 50739 0.230 0.42 假丝酵母,C. shehatae 29 0.1900.020.45 Y12856 15025320.320.1600.03044 S—初始木糖浓度;S一残糖浓度;Pax一最高酒精浓度:R:一体积速率:R2一以干酵母计速 表6.2.6利用木糖发酵生产酒精的莓菌 微生物 g/L产率,g/gR,gLh周期,h糖利用率,% 念珠菌 Monilia sp 50 10.0 0.20
5 力差, 而且发酵过程必须在微溶氧的条件下进行。 表 6.2.3 三种细菌利用葡萄糖和木糖发酵时的产物分布（产物 mol/100mol 糖） 发酵产物 A． hydrophila B．polymyxa A．indologenes 葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖 2，3-丁二醇 54．7 39．0 65．1 38．0 64．1 44．0 3-羟基丁酮 1．7 2．6 2．8 2．5 0．7 0．9 乙醇 52．0 48．9 66．2 63．0 66．6 55．9 乙酸 4．6 9．3 2．9 7．7 1．0 11．4 甲酸 -- -- -- -- 27．9 26．3 丁二酸 3．6 1．1 -- -- -- 5．5 乳酸 23．3 20．4 -- -- 3．0 5．2 CO2 166．2 134．7 199．6 161．0 153．0 114．1 H2 57．5 70．9 70．9 82．0 27．6 19．1 碳转化率（%） 98．2 96．6 101．6 92．9 97．0 98．5 表 6.2.4 木糖发酵生产酒精的酵母及产酒精和木糖醇能力 酵母 酒精（g/L） 木糖醇(g/L) 酒香酵母, Brettanomyces naardenensis CBS6041 1.8 假丝酵母, Candida guilliermondii 2.5 C. shehatae CBS 5813 6.5 C. shehatae CSIR 57D1 20.6 C. shehatae Y12856 24.0 0.2 C. tenuis CSIR-Y565 11.0 5.1 Kluyveromyces sp. KY5199 4.4 K. cellobiovorus KY5199 27.0 22.0 管囊酵母, Pachysolen tannophilus CBS 6857 2.1 P. tannophilus Y 246050 16.0 毕赤酵母, Pichia stipitis CBS 5773 5.9 P. stipitis 5Y-7124 20.0 P. stipitis CSIR-Y633 22.0 裂殖酵母, Schizosaccharomyces ATCC 20130 5.0 1.4 表 6.2.5 三种酵母木糖发酵生产酒精的典型数据 酵母 浓度（g/L） 乙醇产生速率 产率（g/g 木糖） S0 SR Pmax R1,gL-1 h -1 R2,gg -1 h -1 木糖醇 乙醇 管囊酵母,P. tannophilus Y 2460 50 0 16 0.16 0.076 0.14 0.32 150 5 24 0.13 0.058 0.24 0.25 毕赤酵母,P. stipitis Y 7124 50 0 20 0.28 0.170 0.00 0.41 150 7 39 0.38 0.230 0.01 0.42 假丝酵母,C. shehatae Y 12856 50 0 29 0.29 0.190 0.02 0.45 150 25 32 0.32 0.160 0.03 0.44 S0—初始木糖浓度；SR—残糖浓度；Pmax—最高酒精浓度；R1—体积速率；R2—以干酵母计速 率 表 6.2.6 利用木糖发酵生产酒精的霉菌 微生物 S0,g/L Pmax,g/L 产率,g/g R1,gL-1 h -1 周期,h 糖利用率,% 念珠菌 Monilia sp. 50 10.0 0.20 0.06 168
毛霉Mcor105 8.0 0.16 0.08 96 54 镰刀菌 Fusarium 50 16.0 0.32 0.17 lycopersici 镰刀菌F. oxysporum50 25.0 0.50 0.17 链孢霉 Neurospora 6.8 0.34 0.05144 表6.2.6列出了能利用木糖发酵生产酒精的霉菌。从表中可以看到,有些霉菌发酵木糖 生产酒精的转化率虽然较高,但是发酵周期很长,没有什么实际应用价值。 近年来,代谢工程在利用木糖发酵生产酒精微生物中的应用发展很快,目的是实现葡萄 糖和木糖的同时代谢、提高木糖的发酵速率及酒精的转化率。 6.2.2甘油发酵 甘油是一种用途广泛的多元醇,是日用化学工业的重要原料,又是制造硝化甘油类炸药 的原料。甘油可以从油脂水解获得,但是不能满足需要,特别是在两次世界大战期间,用微 生物发酵方法生产甘油曾经盛极一时。我国近年来在甘油发酵的研究和工业化方面取得了重 要的进展。 葡萄糖 1,6-二磷酸果糖 甘油醛磷酸 二羟基丙酮磷酸 NAD NADH2 甘油醛二磷酸 甘油磷酸 NaSo 3 乙醛 乙醇磺酸钠 甘油 乙醇 图6.2.3酵母细胞中甘油的生物合成途径和亚硫酸氢钠的调节作用 甘油的生物合成途径见图6.2.3。在用酵母发酵生产乙醇的过程中,总是伴随着生成少 量甘油。如果改变发酵条件,就能够增加甘油的积累。主要的方法有 1)阻遏乙醇的生物合成。在乙醇合成途经中,乙醛是重要中间产物。如果在培养基中加入 亚硫酸钠,将与乙醛形成络合物,使乙醛不能转化为乙醇。同时,在葡萄糖酵解途径中 产生的NADH也就不消耗在从乙醛还原生成乙醇的反应中,转而用于甘油醛磷酸脱氢酶 催化的从二羟基丙酮磷酸还原为甘油磷酸,甘油磷酸经过脱磷酸反应就得到了甘油, 2)在发酵液中加入碱式盐(如KHPO4),使两个乙醛分子发生歧化反应形成各一分子的乙酸 和乙醇,也可以使NADH2转用于甘油合成,促使甘油积累 3)酵母发酵生产甘油一般要在高糖浓度(葡萄糖浓度为20-30%)下进行,发酵液的渗透压 很高,因此应该选育耐高渗透压的酵母,如: Saccharomyces rouxii, Torulopsis 6
6 毛霉 Mucor 105 50 8.0 0.16 0.08 96 54 镰刀菌 Fusarium lycopersici 50 16.0 0.32 0.17 96 100 镰刀菌 F. oxysporum 50 25.0 0.50 0.17 144 100 链孢霉 Neurosporum crassa 20 6.8 0.34 0.05 144 表 6.2.6 列出了能利用木糖发酵生产酒精的霉菌。从表中可以看到，有些霉菌发酵木糖 生产酒精的转化率虽然较高，但是发酵周期很长, 没有什么实际应用价值。 近年来，代谢工程在利用木糖发酵生产酒精微生物中的应用发展很快，目的是实现葡萄 糖和木糖的同时代谢、提高木糖的发酵速率及酒精的转化率。 6.2.2 甘油发酵 甘油是一种用途广泛的多元醇, 是日用化学工业的重要原料，又是制造硝化甘油类炸药 的原料。甘油可以从油脂水解获得，但是不能满足需要，特别是在两次世界大战期间，用微 生物发酵方法生产甘油曾经盛极一时。我国近年来在甘油发酵的研究和工业化方面取得了重 要的进展。 图 6.2.3 酵母细胞中甘油的生物合成途径和亚硫酸氢钠的调节作用 甘油的生物合成途径见图 6.2.3。在用酵母发酵生产乙醇的过程中，总是伴随着生成少 量甘油。如果改变发酵条件，就能够增加甘油的积累。主要的方法有： 1） 阻遏乙醇的生物合成。在乙醇合成途经中，乙醛是重要中间产物。如果在培养基中加入 亚硫酸钠，将与乙醛形成络合物，使乙醛不能转化为乙醇。同时，在葡萄糖酵解途径中 产生的 NADH2 也就不消耗在从乙醛还原生成乙醇的反应中，转而用于甘油醛磷酸脱氢酶 催化的从二羟基丙酮磷酸还原为甘油磷酸，甘油磷酸经过脱磷酸反应就得到了甘油， 2） 在发酵液中加入碱式盐（如 K2HPO4），使两个乙醛分子发生歧化反应形成各一分子的乙酸 和乙醇，也可以使 NADH2 转用于甘油合成，促使甘油积累。 3） 酵母发酵生产甘油一般要在高糖浓度（葡萄糖浓度为 20-30%）下进行，发酵液的渗透压 很高，因此应该选育耐高渗透压的酵母，如：Saccharomyces rouxii, Torulopsis
magnoliae及 Pichia farinosa等 以葡萄糖为碳源,酵母细胞中甘油合成的总反应式是 CHilOe C3H8O3 co2 ChO 以色列科学家筛选了耐盐的藻类,如 Dunaliella salina,用于甘油生产。这种藻类生 长于盐湖,能够合成甘油作为胞内溶质以抗衡环境种高盐浓度引起的高渗透压。当环境中的 盐浓度突然降低时,胞内的甘油就会释放到胞外。因此若在高盐浓度环境下在光生物反应器 中培养 Dunaliella salina,培养结束后离心分离出藻类细胞,再放到低盐培养基中经短期 培养后,就能获得相当高浓度的甘油。 6.2.3其它溶剂发酵 在上一节中,我们己经简要介绍了丙酮/丁醇发酵在发酵工业历史中的重要地位。用于 丙酮/丁醇发酵的微生物都属于梭状芽孢杆菌( Clostridium),比较典型的有: C. acetobut ylicum C. toanum C. sacchrobutylacetonicum-liquefaciens C. celerifactor及C. madison等。它们的共同特点是都属于厌氧菌,都能够形成真正的 孢子,而且具有很强的生命力。最适温度和pH分别为26-32C及pH5.4-6.0。当以葡萄糖为 碳源时,首先经EMP途径形成乙酰辅酶A,一部分脱羧生成丙酮,另一部分则还原形成丁醇 事实上,除了丙酮/丁醇外,还会产生其它有机酸和醇类。梭状芽孢杆菌发酵时还会产生CO2 及H2等气体产物。三种梭状芽孢杆菌发酵产物的分布见表6.2.7。 从表中数据可以看到,丙酮丁醇梭状芽孢杆菌是最好的丙酮/丁醇生产菌种。在丙酮 丁醇发酵过程中,产物(特别是丁醇)对微生物的生长存在着严重的抑制作用,以至于发酵 液最终的总溶剂浓度只有约20gL。产物中丙酮/丁醇的比例受到发酵温度、发酵速率及氮 源的影响,当发酵温度为32C、高稀释率及硫酸胺为氮源时有利于提高丁醇的产率 表6.2.7三种梭状芽孢杆菌的发酵产物分布 产物产率,mo产物/mol葡萄糖 C butylicum C acetobutylicum C butylicum 乙 42 14 17 丁醇 3-羟基丙酮 「二氧化碳 188 221 04 氢气 235 135 78 用发酵法生产2,3-丁二醇在四十年代末受到了人们的重视,因为该产物经脱水反应就 能够生产合成橡胶的原料1,3-丁二烯,但是由于石油化工提供了更经济的原料路线,发酵 法生产2,3-丁二醇的过程始终没有实现工业化。近年来,由于可以利用木糖生产2,3-丁 二醇并进一步用于生产甲乙酮作为提高汽油辛烷值的添加剂,对发酵法生产2,3-丁二醇的 兴趣又在逐渐增加。 能够产生 丁二醇的微生物很多,主要的有产气菌、塞氏菌及杆菌等,如 Aerobacter, Aerobacillus, Aeromonas, Serratia及 Bacillus,其中最重要的生产菌是 Aerobacter aerogenes, Aeromonas hydrophilia, B. polymyxa, B. subtilis FH S
7 magnoliae 及 Pichia farinosa 等。 以葡萄糖为碳源, 酵母细胞中甘油合成的总反应式是: C6H12O6 C3H8O3 + CO2 + C2H4O 以色列科学家筛选了耐盐的藻类，如 Dunaliella salina，用于甘油生产。这种藻类生 长于盐湖，能够合成甘油作为胞内溶质以抗衡环境种高盐浓度引起的高渗透压。当环境中的 盐浓度突然降低时，胞内的甘油就会释放到胞外。因此若在高盐浓度环境下在光生物反应器 中培养 Dunaliella salina，培养结束后离心分离出藻类细胞，再放到低盐培养基中经短期 培养后，就能获得相当高浓度的甘油。 6.2.3 其它溶剂发酵 在上一节中，我们已经简要介绍了丙酮/丁醇发酵在发酵工业历史中的重要地位。用于 丙 酮 / 丁 醇 发酵 的 微 生 物都 属 于 梭 状芽 孢 杆 菌 (Clostridium)， 比 较 典型 的 有 ： C.acetobutylicum, C.toanum, C.sacchrobutylacetonicum-liquefaciens, C.celerifactor 及 C.madisonii 等。它们的共同特点是都属于厌氧菌，都能够形成真正的 孢子，而且具有很强的生命力。最适温度和 pH 分别为 26-320 C 及 pH5.4-6.0。当以葡萄糖为 碳源时，首先经 EMP 途径形成乙酰辅酶 A，一部分脱羧生成丙酮，另一部分则还原形成丁醇。 事实上，除了丙酮/丁醇外，还会产生其它有机酸和醇类。梭状芽孢杆菌发酵时还会产生 CO2 及 H2 等气体产物。三种梭状芽孢杆菌发酵产物的分布见表 6.2.7。 从表中数据可以看到，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌是最好的丙酮/丁醇生产菌种。在丙酮/ 丁醇发酵过程中，产物（特别是丁醇）对微生物的生长存在着严重的抑制作用，以至于发酵 液最终的总溶剂浓度只有约 20g/L。产物中丙酮/丁醇的比例受到发酵温度、发酵速率及氮 源的影响，当发酵温度为 320 C、高稀释率及硫酸胺为氮源时有利于提高丁醇的产率。 表 6.2.7 三种梭状芽孢杆菌的发酵产物分布 产物 产物产率，mmol 产物/mmol 葡萄糖 C.butylicum C.acetobutylicum C.butylicum 丁酸 76 4 17 乙酸 42 14 17 乙醇 7 丁醇 56 59 丙酮 22 异丙醇 12 3-羟基丙酮 6 二氧化碳 188 221 204 氢气 235 135 78 总碳利用率，% 96 100 96 用发酵法生产 2，3-丁二醇在四十年代末受到了人们的重视，因为该产物经脱水反应就 能够生产合成橡胶的原料 1，3-丁二烯，但是由于石油化工提供了更经济的原料路线，发酵 法生产 2，3-丁二醇的过程始终没有实现工业化。近年来，由于可以利用木糖生产 2，3-丁 二醇并进一步用于生产甲乙酮作为提高汽油辛烷值的添加剂，对发酵法生产 2，3-丁二醇的 兴趣又在逐渐增加。 能够产生 2，3-丁二醇的微生物很多，主要的有产气菌、塞氏菌及杆菌等, 如： Aerobacter, Aerobacillus, Aeromonas, Serratia 及 Bacillus，其中最重要的生产菌是： Aerobacter aerogenes, Aeromonas hydrophilia, B. polymyxa, B. subtilis 和 S
marcescens。这些细菌中既有好氧的也有厌氧的,但是在微生物内合成2,3-丁二醇的途 径都是通过乙酰辅酶A经2-羟基丁酮还原得到。好氧菌能够利用的碳源很广,不但能利用 葡萄糖,而且能够利用木糖和甘露醇等。厌氧菌则只能利用葡萄糖。适宜的发酵温度和p 分别为30C及pH6.0 表6.2.8及表6.2.9分别列出了用两种典型细菌发酵生产2,3-丁二醇的发酵产物分布 从表6.2.8可以看到B. polymyxa具有较强的同化葡萄糖和木糖的能力及较高的2,3-丁二 醇产率。表6.2.9列出了同样属于S. marcescens的四个不同菌株的产物分布,可以看到 不同菌株间存在很大的差异。从两个表中的数据比较得知,好氧和厌氧发酵的产物分布是不 同的,主要原因是电子供体和受体不一样。另外从表中的产物分布也可以看到,发酵液中出 2,3-丁二醇外还有很多副产物,产物的分离将很困难 表628B. polymyxa, NrC25利用四种不同碳源好氧发酵的产物分布 葡萄糖 甘露糖, 发酵消耗原料量 5.21 4.20 1.28 2.04 发酵产物 3-丁二醇 1.70 0.14 2-羟基丁酮 07 0.26 0.01 乙醇 0.88 0.05 0.46 0.13 0.61 0.73 0.04 0.05 0.02 收率,% 101.6 92.9 93.0 106.8 表6.2.9S. marcescens不同菌株厌氧发酵葡萄糖的产物分布 发酵产物 每消耗100mmol葡萄糖生成的产物mnol数 菌株1 菌株3 57.9 55.20 42.45 2-羟基丁酮 0.25 0.50 1.14 甘油 6.14 4.18 4.54 5.63 40.85 41.30 42.24 5.90 乳酸 15.70 26.50 33.09 54.15 甲酸 48.50 44.00 39.80 27.60 琥珀酸 2.98 3.34 18.80 CO2 103.8 102.5 106.1 78.2 0.27 6.3柠檬酸发酵的微生物 能够产生柠檬酸的微生物很多,青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能 够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸:节杄菌、放线菌及假丝酵母则能够利用正烷烃为碳源生 产柠檬酸。真正用于工业生产的是利用淀粉的黑曲霉及利用正烷烃的假丝酵母。 6.3.1利用淀粉作为碳源发酵生产柠檬酸的黑曲莓 柠檬酸是三羧酸循环中的一种有机酸,以葡萄糖为碳源利用黑曲霉发酵生产柠檬酸的代 谢途径已经很清楚,图6.3.1显示了代谢途径和调节机理。该代谢途径中第一个调节酶是磷 酸果糖激酶(PK),在极大多数真核生物细胞中,PκK受到柠檬酸的反馈抑制,细胞中柠檬 酸的生理浓度只有约0.25mmol/L,但是在黑曲霉中,由于高强度通氧并在低镁离子浓度的
8 marcenscens。这些细菌中既有好氧的也有厌氧的，但是在微生物内合成 2，3-丁二醇的途 径都是通过乙酰辅酶 A 经 2-羟基丁酮还原得到。好氧菌能够利用的碳源很广，不但能利用 葡萄糖，而且能够利用木糖和甘露醇等。厌氧菌则只能利用葡萄糖。适宜的发酵温度和 pH 分别为 300 C 及 pH6.0。 表6.2.8及表6.2.9分别列出了用两种典型细菌发酵生产2，3-丁二醇的发酵产物分布。 从表 6.2.8 可以看到 B. polymyxa 具有较强的同化葡萄糖和木糖的能力及较高的 2，3-丁二 醇产率。表 6.2.9 列出了同样属于 S. marcenscens 的四个不同菌株的产物分布, 可以看到 不同菌株间存在很大的差异。从两个表中的数据比较得知，好氧和厌氧发酵的产物分布是不 同的，主要原因是电子供体和受体不一样。另外从表中的产物分布也可以看到，发酵液中出 2,3-丁二醇外还有很多副产物, 产物的分离将很困难。 表 6.2.8 B. polymyxa,NRC25 利用四种不同碳源好氧发酵的产物分布 葡萄糖, g 木糖, g 丙酮酸, g 甘露糖, g 发酵消耗原料量 5.21 4.20 1.28 2.04 发酵产物 2，3-丁二醇 1.70 0.96 ___ 0.14 2-羟基丁酮 0.07 0.06 0.26 0.01 乙醇 0.88 0.81 ___ 0.52 乙酸 0.05 0.13 0.46 0.13 CO2 2.54 1.99 0.61 0.73 H2 0.04 0.05 0.02 0.04 碳收率，% 101.6 92.9 93.0 106.8 表 6.2.9 S. marcescens 不同菌株厌氧发酵葡萄糖的产物分布 发酵产物 每消耗 100mmol 葡萄糖生成的产物 mmol 数 菌株 1 菌株 2 菌株 3 菌株 4 2，3-丁二醇 57.90 55.20 51.45 42.45 2-羟基丁酮 0.25 0.50 0.81 1.14 甘油 6.14 4.18 4.54 5.63 乙醇 40.85 41.30 42.24 25.90 乳酸 15.70 26.50 33.09 54.15 甲酸 48.50 44.00 39.80 27.60 琥珀酸 2.98 3.34 3.41 18.80 CO2 103.8 102.5 106.1 78.2 H2 0.0 0.0 0.52 0.27 6.3 柠檬酸发酵的微生物 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能 够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸；节杆菌、放线菌及假丝酵母则能够利用正烷烃为碳源生 产柠檬酸。真正用于工业生产的是利用淀粉的黑曲霉及利用正烷烃的假丝酵母。 6.3.1 利用淀粉作为碳源发酵生产柠檬酸的黑曲霉 柠檬酸是三羧酸循环中的一种有机酸，以葡萄糖为碳源利用黑曲霉发酵生产柠檬酸的代 谢途径已经很清楚，图 6.3.1 显示了代谢途径和调节机理。该代谢途径中第一个调节酶是磷 酸果糖激酶（PFK），在极大多数真核生物细胞中，PFK 受到柠檬酸的反馈抑制，细胞中柠檬 酸的生理浓度只有约 0.25mmol/L，但是在黑曲霉中，由于高强度通氧并在低镁离子浓度的
条件下培养,PFK对柠檬酸不敏感。镁离子浓度还会影响细胞表面的生物化学和改变细胞壁 磷酯的含量(见表6.3.1)。氧是柠檬酸发酵的理论底物之一,总反应式可写为: 葡萄糖+3/2O2=柠檬酸+2H2O 同时,在NAD重新氧化过程中还需要氧气作为底物,因此柠檬酸发酵需要高通氧强度。在 黑曲霉中不但有标准的呼吸链,而且存在对水杨基氧肟酸(SHAM)敏感的呼吸支链。研究证 明,只有在高氧强度下才能维持SHAM敏感的呼吸支链活性,该支链的功能是在细胞质中氧 化NADH但不形成ATP。从图6.3.1可以看到,ATP是PFK的抑制剂,因此保持该支链活性对 于降低ATP浓度、促进柠檬酸生产都是必须的。高浓度的胞内铵离子对解除柠檬酸的反馈调 节也很重要,而且与镁离子的影响密切相关,已经发现在镁离子缺乏及供应充分的培养基中, 铵离子的对PFK的影响存在很大差别,这可能与吐根碱和亚胺环己酮能够阻断镁离子的抑制 功能有关。镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响见表6.3.2。 商萄糖 P④果糖-6-6酸 PFK 糖-1,6-三6酸 乙酰辅A 联乙酸 马來酸 稼酸 富马酸④ 异柠榢酸 琥珀酸 -酮戍二酸 图6.3.1以葡萄糖为原料发酵生产柠檬酸的代谢途径和调节机理 激活 抑制 柠檬酸合成的第二个调节酶是丙酮酸激酶(FK),PK的调节机制尚不清楚,它对胞内代 谢产物都不敏感,只有1,6-二磷酸果糖对它有激活作用,铵离子和钾离子也有激活作用, 至今还没有发现对该酶有负调节作用的因素。在A. nigar中存在丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧 化酶对丙酮酸的竞争,由于后者是结构酶,在生长开始时就已形成,因此在竞争中处于优势, 但对它的调节作用不明显。在A. nagar中也存在CO2的固定作用,由PEP羧激酶催化 表6.3.1镁离子对黑曲霉细胞壁组成的影响 细胞壁组成 不加镁离子 agCl 2H20 0. 1mg/L α-葡聚 59.0 β-葡聚糖 7.0 18.2 20.0 6.8
9 条件下培养，PFK 对柠檬酸不敏感。镁离子浓度还会影响细胞表面的生物化学和改变细胞壁 磷酯的含量（见表 6.3.1）。氧是柠檬酸发酵的理论底物之一，总反应式可写为： 葡萄糖 + 3/2 O2 = 柠檬酸 + 2 H2O 同时，在 NADH 重新氧化过程中还需要氧气作为底物，因此柠檬酸发酵需要高通氧强度。在 黑曲霉中不但有标准的呼吸链，而且存在对水杨基氧肟酸（SHAM）敏感的呼吸支链。研究证 明，只有在高氧强度下才能维持 SHAM 敏感的呼吸支链活性，该支链的功能是在细胞质中氧 化 NADH 但不形成 ATP。从图 6.3.1 可以看到，ATP 是 PFK 的抑制剂，因此保持该支链活性对 于降低 ATP 浓度、促进柠檬酸生产都是必须的。高浓度的胞内铵离子对解除柠檬酸的反馈调 节也很重要，而且与镁离子的影响密切相关，已经发现在镁离子缺乏及供应充分的培养基中， 铵离子的对 PFK 的影响存在很大差别，这可能与吐根碱和亚胺环己酮能够阻断镁离子的抑制 功能有关。镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响见表 6.3.2。 图 6.3.1 以葡萄糖为原料发酵生产柠檬酸的代谢途径和调节机理 + ——激活；- ——抑制 柠檬酸合成的第二个调节酶是丙酮酸激酶（PK），PK 的调节机制尚不清楚，它对胞内代 谢产物都不敏感，只有 1，6-二磷酸果糖对它有激活作用，铵离子和钾离子也有激活作用， 至今还没有发现对该酶有负调节作用的因素。在 A. nigar 中存在丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧 化酶对丙酮酸的竞争, 由于后者是结构酶，在生长开始时就已形成，因此在竞争中处于优势, 但对它的调节作用不明显。在 A. nigar 中也存在 CO2 的固定作用，由 PEP 羧激酶催化。 表 6.3.1 镁离子对黑曲霉细胞壁组成的影响 细胞壁组成 不加镁离子 MgCl2 . 2H2O 0.1mg/L -葡聚糖 66．4 59．0 -葡聚糖 7．0 18．2 几丁质 20．0 6．8
蛋白质 半乳甘露聚糖3.7 半乳糖胺 表6.3.2镁离子和铵离子对柠棣酸发酵的影响 因素 镁缺乏 镁充分 PFK (任意单位)1 0 柠檬酸的合成发生在TCA循环中,由柠檬酸合成酶催化。对柠檬酸能在A. nigar中积 累的机理曾提出过一些不同的看法。有人认为是A. nigar中缺少乌头酸水合酶和异柠檬酸 脱氢酶,但以后有人从A. nigar中分离得到了这两种酶,而且进一步确定了乌头酸水合酶 存在于线粒体中,它催化的反应存在着柠檬酸:异柠檬酸:顺式乌头酸=90:7:3的平衡 关系:同时还发现在A. nigar中对辅酶NAD专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低,却有三种 依赖于辅酶NADP的异柠檬酸脱氢酶,其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关,它 们受到生理浓度柠檬酸的抑制。这一现象可以解释为什么在A. nigar中异柠檬酸不会进 步分解及柠檬酸的积累机制。在A. nigar中还发现了高浓度葡萄糖和铵离子对α-酮戊二酸 脱氢酶的阻遏作用,该酶催化TCA循环中唯一的不可逆反应。TCA循环中的二羧酸部分只有 琥珀酸脱氢酶受到低浓度草酰乙酸的强烈抑制,从而防止了柠檬酸分解为草酰乙酸的反应, 促进了柠檬酸积累。其它酶似乎不受代谢调节,只是受到底物和产物的控制。 总之,在A. nigar发酵生产柠檬酸的过程中,应该保持高底物浓度、高铵离子浓度、 高通氧强度及低镁离子浓度、低磷酸盐浓度,发酵的温度应在28-35℃的范围内,pH调节到 2.2-2.6之间。在上述条件下,从葡萄糖生产柠檬酸的转化率可以达到理论转化率的90%以 上。在柠檬酸发酵中,国外一般采用糖蜜或淀粉水解的葡萄糖作为原料。我国的微生物工作 者根据中国的国情及A. nigar能够产生淀粉酶的特点,成功地选育了能够直接利用淀粉质 粗原料(如薯干粉及玉米粉等)发酵生产柠檬酸的高产菌种,并用于大规模工业化生产,降低 了生产成本,取得了良好的效果 6.3.2利用烷烃生产柠檬酸的假丝酵母 1963年, Yamada等人发现棒状杆菌( corynebacteria)能够利用正烷烃为碳源生产谷氨 酸,几乎同时,日本的发酵工业界也开始了从正烷烃为碳源生产柠檬酸的研究和开发,并发 现假丝酵母是符合要求的微生物。在假丝酵母中,正烷烃首先被氧化为脂肪酸,随后脂肪酸 进一步经β-氧化生成乙酰辅酶A进入TCA循环,为了补充草酰乙酸,还存在一个额外的乙醛 酸循环。 假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程的代谢调节机理至今仍不清楚,但发酵过程具有以 下一些特点:1)发酵分为两个阶段,第一阶段只生长酵母,只有当培养基中的氮源消耗完 以后才开始积累柠檬酸:2)发酵液的p值应保持在p5以上;3)高铁离子浓度会增加乌 头酸水合酶的活性,引起柠檬酸产量减少:4)产物中异柠檬酸的比例很高,甚至达到50% 通过各种诱变育种及添加乌头酸水合酶抑制剂(如氮氟乙酸、2,4-二硝基苯酚及某些醇类) 可以降低异柠檬酸的比例,但仍高于黑曲霉葡萄糖发酵生产柠檬酸的过程 七十年代初,假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程首先在日本实现了工业化生产,并 将该技术输出到美国和欧洲。但是由于七十年代中期出现了石油危机及过程本身存在的缺 点,该过程很快就停止了工业化生产
10 蛋白质 2．4 3．9 半乳甘露聚糖 半乳糖胺 3．7 12．8 脂类物质 0．5 0．5 表 6.3.2 镁离子和铵离子对柠檬酸发酵的影响 因素 镁缺乏 镁充分 NH4 + 15mM 3mM 柠檬酸 4mM 1mM PFK 酶活（任意单位） 1.1 1.0 柠檬酸的合成发生在 TCA 循环中，由柠檬酸合成酶催化。对柠檬酸能在 A. nigar 中积 累的机理曾提出过一些不同的看法。有人认为是 A. nigar 中缺少乌头酸水合酶和异柠檬酸 脱氢酶，但以后有人从 A. nigar 中分离得到了这两种酶，而且进一步确定了乌头酸水合酶 存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3 的平衡 关系；同时还发现在 A. nigar 中对辅酶 NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种 依赖于辅酶 NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及 TCA 循环有关，它 们受到生理浓度柠檬酸的抑制。这一现象可以解释为什么在 A. nigar 中异柠檬酸不会进一 步分解及柠檬酸的积累机制。在 A. nigar 中还发现了高浓度葡萄糖和铵离子对-酮戊二酸 脱氢酶的阻遏作用，该酶催化 TCA 循环中唯一的不可逆反应。TCA 循环中的二羧酸部分只有 琥珀酸脱氢酶受到低浓度草酰乙酸的强烈抑制，从而防止了柠檬酸分解为草酰乙酸的反应， 促进了柠檬酸积累。其它酶似乎不受代谢调节，只是受到底物和产物的控制。 总之，在 A. nigar 发酵生产柠檬酸的过程中，应该保持高底物浓度、高铵离子浓度、 高通氧强度及低镁离子浓度、低磷酸盐浓度，发酵的温度应在 28-350 C 的范围内，pH 调节到 2.2-2.6 之间。在上述条件下，从葡萄糖生产柠檬酸的转化率可以达到理论转化率的 90%以 上。在柠檬酸发酵中，国外一般采用糖蜜或淀粉水解的葡萄糖作为原料。我国的微生物工作 者根据中国的国情及 A. nigar 能够产生淀粉酶的特点，成功地选育了能够直接利用淀粉质 粗原料(如薯干粉及玉米粉等)发酵生产柠檬酸的高产菌种，并用于大规模工业化生产，降低 了生产成本, 取得了良好的效果。 6.3.2 利用烷烃生产柠檬酸的假丝酵母 1963 年，Yamada 等人发现棒状杆菌(Corynebacteria)能够利用正烷烃为碳源生产谷氨 酸，几乎同时，日本的发酵工业界也开始了从正烷烃为碳源生产柠檬酸的研究和开发，并发 现假丝酵母是符合要求的微生物。在假丝酵母中，正烷烃首先被氧化为脂肪酸，随后脂肪酸 进一步经-氧化生成乙酰辅酶 A 进入 TCA 循环，为了补充草酰乙酸，还存在一个额外的乙醛 酸循环。 假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程的代谢调节机理至今仍不清楚，但发酵过程具有以 下一些特点：1）发酵分为两个阶段，第一阶段只生长酵母，只有当培养基中的氮源消耗完 以后才开始积累柠檬酸；2）发酵液的 pH 值应保持在 pH5 以上；3）高铁离子浓度会增加乌 头酸水合酶的活性，引起柠檬酸产量减少；4）产物中异柠檬酸的比例很高，甚至达到 50%， 通过各种诱变育种及添加乌头酸水合酶抑制剂（如氮氟乙酸、2，4-二硝基苯酚及某些醇类） 可以降低异柠檬酸的比例，但仍高于黑曲霉葡萄糖发酵生产柠檬酸的过程。 七十年代初，假丝酵母利用正烷烃生产柠檬酸过程首先在日本实现了工业化生产，并 将该技术输出到美国和欧洲。但是由于七十年代中期出现了石油危机及过程本身存在的缺 点，该过程很快就停止了工业化生产
