可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,02,0.4,0.6,0.8,1.0毫 升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后, 在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540mm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收 值为纵座标绘制标准曲线 2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度 注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、F。im酚试剂法( Lowry法) (一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于 其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此 法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即 Folin-酚试剂,以 增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是: ①在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。② Folin-酚试剂中的磷钼酸盐 一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合 物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比 Folin-酚试剂法最早由 Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费 时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干 扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰 Lowry反应。而且对后者的 影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干 扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%), 乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时, 必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液,即可显色测定。 若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 进行测定时,加 f olin-酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳 定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Foli一酚试剂加到碱性的铜一蛋 白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即 能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定 此法可检测的最低蛋白质量达5μug。通常测定范围是20~250μug。 (二)试剂与器材 1试剂 (1)试剂甲:173 可见光分光光度计、大试管 15 支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫 升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后， 在室温（20~25℃）下放置 30 分钟，于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收 值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取 2~3 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。 注意样品浓度不要超过 10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于 其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此 法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以 增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐 —磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费 时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干 扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的 影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干 扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%）， 乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时， 必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。 若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时，加 F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳 定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋 白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即 能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5g。通常测定范围是 20~250g。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲：