(A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O·4H2O) 溶解于500毫升蒸馏水中。 (B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将 50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲 (2)试剂乙: 在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠 ( Na, moo4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充 分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(LiSO) 50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液 呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕 色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1 倍,使最终的酸浓度为1N左右。 (3)标准蛋白质溶液 精确称取结晶牛血清淸蛋白或γ球蛋臼,溶于蒸馏水,浓度为250μg/m左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液。 2.器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管16支 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分 成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,06,08,10毫升标准蛋白质溶液(浓度为250μgml)。 用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于 室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入05毫升试剂乙( Folin一酚试剂),同样立 即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟 以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。 注意:因 Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即 第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲, 2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1 支试管可立即加入05毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后 加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管 174174 （A） 10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。 溶解于 500 毫升蒸馏水中。 （B） 0.5 克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50 份（A）与 1 份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙： 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO4 ·2H2O）,25 克钼酸钠 （Na2MoO4·2H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂（Li2SO4）， 50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液 呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕 色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。 （3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 —球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 g/ml 左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。 2. 器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分 成两组，分别加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250g/ml）。 用水补足到 1.0 毫升，然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于 室温（20～25℃）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立 即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟， 以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。 注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即 第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙，2 分钟后 加第 3 支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管