掌握 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌具体方法及操作步骤。 二、实验原理 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ) 简称 PCR，是一种体外酶促合成反应，扩 增特定 DNA 片断的方法。该技术于 1985 年由美国的 Kary Mullis 等人首创并由美国 GETUS 公司开发。其原理是：在存在 DNA 模板、引物、dNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应体系中， 在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的 DNA 片断进行扩增。这种 扩增是通过模板 DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环 进行，使目标 DNA 片段得以扩增。由于每一周期产生的 DNA 片断均能成为下一次循环的 模板，故 PCR 产物以指数形式增加，从而实现信号的放大。 本实验以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶为靶基因进行检测。 三、实验材料 1．菌种：Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)－26003-21 2．乳制品：全脂乳、脱脂乳和奶酪均购自当地超市。 3．培养基：营养肉汤培养基 4．化学试剂：10xPCR buffer、dNTPs、TaKaRa Taq、DNA Marker DL2000， 5．引物： 正向引物：GCGATTGATGGTGATACGGTT 反向引物：AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC 6．实验仪器：PCR 仪、DXY-33A 型电泳仪、UVIpro 凝胶成像系统 四、实验步骤 1.将已人工污染的乳品 25ml 接入 225ml 营养肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜 2.取 1ml 培养液于 1.5ml 离心管中，11000rpm，离心 1 分钟，弃去上清液 3.用灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用 100ul 灭菌纯水溶解沉淀物 4.将菌悬液于沸水浴中煮沸 10 分钟，11000rpm，离心 1 分钟，取上清液，备用 5.PCR 反应体系：总反应体系 50ul。包括 5ul 10XPCR buffer ，4ul dNTPs 混合物，0.5ul 40umol 正向引物，0.5ul40umol 反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq 酶，模板 2ul，水 37.75ul。 6.PCR 扩增程序：PCR 反应采用冷启动。94℃预变性 4 分钟，再按 94℃1 分钟－52℃0.5 分 钟－72℃1.5 分钟进行 35 个循环，最后 72℃延伸 3.5 分钟。 7.电泳检测：取 5ul PCR 产物在 2％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果并 成像。 五.实验结果