实验一 ELISA 方法快速检测肉制品中的沙门氏菌 一、实验目的 掌握 ELISA 方法快速检测肉及肉制品中的沙门氏菌的具体方法及操作步骤。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的固相酶免疫测定方法,是在放射免疫分析理论 的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好,所用 试剂稳定、易保存,试验操作简便,结果判断客观等特点常用的 ELISA 测定方法有:根据检测 目的和操作步骤不同, ELISA 有 3 种基本方法。(1)双抗体(原)夹心法 (2)间接法 (3)竞争 法。其中竞争法由于具有反应重复性与完成性好的特点,它是目前使用较广泛的测定方法。 三、实验材料 1．包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH9.6 , 0.1M） Na2CO3.10H2O 11.45g NaHCO3 5.04g NaN3 0.2g 蒸馏水加至 1000mL 2．稀释液 ： PBS(Ph7.4, 0.15M ) 0.2M Na2HPO4 40.5 mL 0.2M NaH2PO4 mL NaCl 8.2g 3．Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 4．洗涤液：NaCl -Tween NaCl 8.5g Tween 20 0.5 mL 蒸馏水加至 1000mL 5．底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0） 0.1M 柠檬酸 24.3 mL 0.2M 磷酸氢二钠 25.7mL 蒸馏水加至 50mL 邻苯二胺 40 mg，溶解后避光保存。临用前加入 30% H2O2 0.15 mL 6．封闭液：0.2% BSA 溶液 7．沙门氏菌血清 8．辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 9．终止剂 ：2M 硫酸 10．ELISA 板 11．酶标检测仪 12．移液枪 13．人工污染沙门氏菌的香肠制品一份。 四、实验步骤 (1)样品前增菌 18-24h. (2)样品包被:取样品 100μｌ/孔包被酶联板 4℃过夜，洗板 3 次。 (3)封闭:BSA 200μｌ/孔,37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (4)加入一抗 100μｌ/孔，洗板 3 次。 (5)加入酶标二抗 100μｌ/孔 37℃孵育 1ｈ，洗板 3 次。 (6)加入底物，37℃孵育 30ｍｉｎ。 (7)加入终止剂。 (8)读取结果。 五、实验结果 通过酶标检测仪读数判定检测结果。 六、思考题 为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的孵育？ 实验二 PCR 检测乳品中金黄色葡萄球菌 一、实验目的