细管色谱可以达到很高的理论板数,因此有很好的分离效果。从紫外扫描得到的谱图可以与已知谱 图比较以确定其新颖性,半制备色谱能提供一定数量的纯物质供进一步的生物活性鉴定。 为了确定新发现的生物活性物质是否具有新颖性,需要建立一个所有已知抗生素的数据库,如 Bioactive Natural Product Database(BNPD)。如果确实发现了一个具有特殊结构又具有特殊生物活性的 新化合物,就需要将它提纯并精确测定其物理化学性质和化学结构。与此同时,可以考虑申请专利 以保护知识产权 10.32改进筛选效率 发现新的微生物是发现新抗生素的基础。经过四十年代和五十年代大规模的抗生素生产菌筛选 以后,人们发现要筛选得到新的抗生素已经变得越来越难了,筛选得到的活性物质与以前已经发现 的抗生素相同的频率越来越高。为了解决这一问题,人们一方面采取了从不同的地域和生态环境的 土壤样品中进行筛选的方法,如:从海洋沉积物、特殊气候条件地区的土样或特殊土壤成分的土样 等:另一方面则采用了一些特殊的筛选方法从普通的土样中筛选出新的微生物及新的抗生素。事实 证明,后一种方法也取得了许多意想不到的成果 10321改进筛选方法 新筛选方法的目标是尽可能地提高某一类微生物的富集度。例如,如果要从土样中分离杆菌 可以首先将土样加热到70C或在50%乙醇溶液中浸泡一小时。经过这种条件的处理,只有杆菌的孢 子才能存活,这样就使杆菌的富集度大大提高。再与选择性培养基相结合,就能得到性能更特殊的 微生物,如嗜酸菌或Gram阴性菌等。 对于除链霉菌以外的其它放线菌,一种很有用的筛选方法是先将土样在空气中干燥,然后加热 到100~120℃,并保温一小时。虽然这种方法的选择性不是很理想,但是能大大减少细菌和链霉菌 的数量,结合应用选择性培养基往往能起到很好的筛选效果。如:利用含溶菌酶或土霉素的培养基 能筛选到链轮丝菌 Streptoverticillium;含脱甲基金霉素或甲烯土霉素的培养基则用于诺卡氏菌 nocardia的筛选;指孢囊菌 Dactylosporangiun会在含几丁质的培养基中选择性地生长,等等 在筛选霉菌时,可以在培养基中加入四环素等抗生素以抑制细菌的生长,同时可选择在20°C 的温度下培养,在较低温度下,放线菌基本上不会生长。另外,生长在极端气候条件下及与高等生 物共同生活的霉菌中筛选出新抗生素的概率也比较大。 10322试验方法的改进 除了改进微生物的筛选技术外,发展新的生物活性试验方法对于提高新抗生素的筛选效率也非 常重要 对于抗细菌剂的筛选,可以采用两种策略。一种是以获得新化合物为目标,可以应用与传统概 念不同的方法进行试验。传统筛选方法往往根据是否能杀死或抑制金黄色葡萄球菌S.auvεus和枯草 芽孢杆菌B. subtilis的生长来试验抗生素的抗性。因为对这两种细菌有抗性的物质已被广泛研究,取 而代之的是筛选对其它细菌,如梭状芽孢杆菌( Clostridium)等有抗性的物质,黄色霉素 Kirromycin 就是这样筛选得到的。又如:将传统的以是否抑制细菌的生长作为筛选目标,改变为根据是否抑制 细菌的某些功能,如运动性或夹膜形成等作为目标进行筛选。另外也可以筛选那些具有特殊基团或 结构的化合物,如含硝基、含氯的化合物,然后再测定其抗菌活性 种策略是以寻找已知抗生 素的类似物为目标。一种比较简单的方法是将两种同基因菌株的发酵液活性进行比较,其中一个菌 株是对所筛选的抗生素具有抗性的突变株,另一菌株则是对该类抗生素十分敏感而对其它抗生素不 敏感的菌株。这种策略在筛选新的β-内酰胺类抗生素时取得了成功,如诺卡杀菌素的发现就是用这 种方法筛选成功的一个典型例子 个更先进而且有效的方法是根据事先确定的目标去筛选新的抗生素。例如,若目标是要筛选 对细菌细胞膜的合成起抑制作用的新抗生素,就可以采用比较发酵液对正常金黄色葡萄球菌S aureus和缺少细胞壁突变株的作用差别来确定其是否具有所需的活性;也可以利用细菌代谢途经中 任意一个必需酶的抑制剂作为筛选目标,或者利用生物活性物质是否能与细菌中的特定受体形成复 合物的方法进行筛选 抗霉菌生物活性物质的筛选比较困难,主要原因是霉菌是真核生物,与哺乳动物细胞的性质比 较接近,许多具有杀霉菌功能的抗生素对人体也具有毒性。因此必须根据霉菌的特点进行筛选。例 如霉菌的细胞壁含有大量的几丁质,而哺乳动物细胞则不含几丁质。虽然直接筛选霉菌细胞壁合成 抑制剂的工作没有取得成功,但是以后采用了在无细胞体系中对几丁质合成酶的抑制剂进行筛选,11 细管色谱可以达到很高的理论板数，因此有很好的分离效果。从紫外扫描得到的谱图可以与已知谱 图比较以确定其新颖性，半制备色谱能提供一定数量的纯物质供进一步的生物活性鉴定。 为了确定新发现的生物活性物质是否具有新颖性，需要建立一个所有已知抗生素的数据库，如 Bioactive Natural Product Database(BNPD)。如果确实发现了一个具有特殊结构又具有特殊生物活性的 新化合物，就需要将它提纯并精确测定其物理化学性质和化学结构。与此同时，可以考虑申请专利 以保护知识产权。 10.3.2 改进筛选效率 发现新的微生物是发现新抗生素的基础。经过四十年代和五十年代大规模的抗生素生产菌筛选 以后，人们发现要筛选得到新的抗生素已经变得越来越难了，筛选得到的活性物质与以前已经发现 的抗生素相同的频率越来越高。为了解决这一问题，人们一方面采取了从不同的地域和生态环境的 土壤样品中进行筛选的方法，如：从海洋沉积物、特殊气候条件地区的土样或特殊土壤成分的土样 等；另一方面则采用了一些特殊的筛选方法从普通的土样中筛选出新的微生物及新的抗生素。事实 证明，后一种方法也取得了许多意想不到的成果。 10.3.2.1 改进筛选方法 新筛选方法的目标是尽可能地提高某一类微生物的富集度。例如，如果要从土样中分离杆菌， 可以首先将土样加热到 70oC 或在 50%乙醇溶液中浸泡一小时。经过这种条件的处理，只有杆菌的孢 子才能存活，这样就使杆菌的富集度大大提高。再与选择性培养基相结合，就能得到性能更特殊的 微生物，如嗜酸菌或 Gram 阴性菌等。 对于除链霉菌以外的其它放线菌，一种很有用的筛选方法是先将土样在空气中干燥，然后加热 到 100~120oC，并保温一小时。虽然这种方法的选择性不是很理想，但是能大大减少细菌和链霉菌 的数量，结合应用选择性培养基往往能起到很好的筛选效果。如：利用含溶菌酶或土霉素的培养基 能筛选到链轮丝菌 Streptoverticillium；含脱甲基金霉素或甲烯土霉素的培养基则用于诺卡氏菌 Nocardia 的筛选；指孢囊菌 Dactylosporangium 会在含几丁质的培养基中选择性地生长，等等。 在筛选霉菌时，可以在培养基中加入四环素等抗生素以抑制细菌的生长，同时可选择在 20 oC 的温度下培养，在较低温度下，放线菌基本上不会生长。另外，生长在极端气候条件下及与高等生 物共同生活的霉菌中筛选出新抗生素的概率也比较大。 10.3.2.2 试验方法的改进 除了改进微生物的筛选技术外，发展新的生物活性试验方法对于提高新抗生素的筛选效率也非 常重要。 对于抗细菌剂的筛选，可以采用两种策略。一种是以获得新化合物为目标，可以应用与传统概 念不同的方法进行试验。传统筛选方法往往根据是否能杀死或抑制金黄色葡萄球菌 S. aureus 和枯草 芽孢杆菌 B. subtilis 的生长来试验抗生素的抗性。因为对这两种细菌有抗性的物质已被广泛研究，取 而代之的是筛选对其它细菌，如梭状芽孢杆菌（Clostridium）等有抗性的物质，黄色霉素 Kirromycin 就是这样筛选得到的。又如：将传统的以是否抑制细菌的生长作为筛选目标，改变为根据是否抑制 细菌的某些功能，如运动性或夹膜形成等作为目标进行筛选。另外也可以筛选那些具有特殊基团或 结构的化合物，如含硝基、含氯的化合物，然后再测定其抗菌活性。另一种策略是以寻找已知抗生 素的类似物为目标。一种比较简单的方法是将两种同基因菌株的发酵液活性进行比较，其中一个菌 株是对所筛选的抗生素具有抗性的突变株，另一菌株则是对该类抗生素十分敏感而对其它抗生素不 敏感的菌株。这种策略在筛选新的-内酰胺类抗生素时取得了成功，如诺卡杀菌素的发现就是用这 种方法筛选成功的一个典型例子。 一个更先进而且有效的方法是根据事先确定的目标去筛选新的抗生素。例如，若目标是要筛选 对细菌细胞膜的合成起抑制作用的新抗生素，就可以采用比较发酵液对正常金黄色葡萄球菌 S. aureus 和缺少细胞壁突变株的作用差别来确定其是否具有所需的活性；也可以利用细菌代谢途经中 任意一个必需酶的抑制剂作为筛选目标，或者利用生物活性物质是否能与细菌中的特定受体形成复 合物的方法进行筛选。 抗霉菌生物活性物质的筛选比较困难，主要原因是霉菌是真核生物，与哺乳动物细胞的性质比 较接近，许多具有杀霉菌功能的抗生素对人体也具有毒性。因此必须根据霉菌的特点进行筛选。例 如霉菌的细胞壁含有大量的几丁质，而哺乳动物细胞则不含几丁质。虽然直接筛选霉菌细胞壁合成 抑制剂的工作没有取得成功，但是以后采用了在无细胞体系中对几丁质合成酶的抑制剂进行筛选