除了上面讨论的能够生产抗生素的主要微生物种属外,其它微生物也能够产生一些重要的抗生 素。在细菌中,从葡萄糖杆菌 Gluconobacter SO26445分离得到了磺胺净素( Sulfazecin),属于磺酰基 单环β一内酰胺类抗生素。以后发现农杆菌 agrobacterium、色杆菌 Chromobacterium、纤维粘细菌 Cytophage和曲挠杆菌 Flexibacter的一些种也能产生磺胺净素。黄杆菌 Flavobacterium和黄单胞菌 Xanthomonas的某些菌株则能够产生头孢菌素C 霉菌中的头孢霉 Cephalosporium chrysogenum是最重要的头孢类抗生素生产菌种。头胞霉在分 类学上有一些不同看法,它们的共同特点是分生孢子的结构简单,在一小部分分生孢子的顶上有 个单茎或分枝很少的茎,其菌丝分化形成节孢子。 Cephalosporium chrysogenum的营养要求与青霉类 似,一些糖类、甲基油酸或甘油都能作为碳源,无机氮、氨基酸或复合的多肽作为氮源。除头孢类 抗生素外, Cephalosporium生产的其它重要抗生素都属于聚酮类或萜类化合物,如六酮类的浅蓝菌 素 Cerulenin(C. caerulens)是脂肪酸生物合成的抑制剂;梭链孢酸 Fusidic acid( Acremonium fusidioides 则是抗葡萄球菌剂。 木霉属的 Trichoderma in/amum是环孢A的生产菌,环孢A具有抗霉菌活性,更重要的用途是 作为器官移植的免疫抑制剂 10.3新抗生素生产菌种的筛选 微生物的次级代谢产物是发现新抗生素和其它生物活性物质的巨大宝库。许多国家和大制药公 司都投入了大量的人力和物力从事这项工作,发现了数以万计的新化合物,从中进一步筛选出了具 有临床应用价值的抗生素和生物活性物质等,其中许多产物已经形成了知识产权,在创造了巨大经 济利益的同时,也为人类的健康和工农业生产的发展作出了贡献。今天,虽然基因工程和组合化学 的发展为新药的开发提供了新的思路和方法,但是持之以恒地对各种微生物的次级代谢产物进行分 析鉴别,从中发现新的化合物、筛选出新的抗生素仍然具有重要意义。 10.3.1抗生素的基本筛选方法 自从发现青霉素后,各国科学家已经对发现新抗生素建立了一套比较系统的方法,可以在短时 间内从微生物的次级代谢产物中发现数以千计的活性分子,从中又能够进一步筛选出几个具有临床 应用价值的抗生素。这种筛选方法最初是由美国 Rutgers大学的 Waksman教授于1940年建立起来 的,至今仍然被工业界和学术界广泛采用。 在上一节中我们已经介绍了许多抗生素生产菌都是来自于有机物在自然界的循环过程,因此筛 选的第一步是收集各种环境条件下的土壤和腐败植物样品,从中进行筛选。最常用的筛选过程包括 如下步骤:1)将土壤样品加水后充分搅拌或震荡:2)离心取上清液并稀释后涂在事先准备好的琼 脂平板上:3)在平板上挑选一些菌落接种于液体培养基进行培养:4)吸取培养液检验其抗菌或其 它生物活性 当某一菌落的生物活性得到确证后,就必须将生物活性物质进行分离和部分提纯,以确定该物 质是否具有新颖性,并进行一系列初步的生物试验以评价其应用前景。这一步骤的关键是要避免与 前人工作的重复。一般而言,培养液中生物活性物质的浓度很低,而且存在许多结构类似物,若要 完全将它们分别予以提纯将需要消耗大量的人力和物力。因此对代谢产物的提纯要适度,粗产物的 纯度应该在5-10%以上。在分离前应该确定活性物质是在发酵液中还是菌体中。 确定活性物质的新颖性是筛选工作的重点,为此要对活性物质进行一系列的生物学性质和物理 化学性质检验。主要的生物学性质有:1)对活性物质的抗菌谱进行评价,包括交叉抗菌谱,血清、 pH、接种量及离子等因素对抗菌谱的影响;2)活性物质对实验动物的影响,特别是对已受到感染的 动物鼠的ED50(50%有效剂量)和LD0(50%致死剂量)的测定,除了确定其绝对值外,有效剂量 和致死剂量的相对比值具有更重要的意义,因为经初步提纯的活性物质中,虽然纯度不高,但如果 活性物质只有一种,该比值就与样品的纯度无关;3)如果产物是某一特定代谢途经中某一种酶的抑 制剂,鉴别其新颖性就比较容易,因为需要比较的对象只是具有同样功能的数量有限的几种化合 物,当然也要注意该化合物是否在过去已经根据它的其它活性而被分离、鉴别过。 由于产物只经过初步的分离提纯,还不可能进行纯物质物性的测定,如熔点、红外及NMR谱 等,但是可以进行紫外和可见光谱的测量,从中可以获得许多有用的信息。样品虽然不纯,但活性 物质的含量往往是最多的,因此利用质谱可以测定其正确的分子量,这对于新颖性的鉴别非常有 用。在各种溶剂系统中进行纸层析和薄层层析能获得该物质的酸碱性、亲水或亲脂性等性质,斑点 的迁移值可以用来与已知数据比较。现代HPLC技术既可以用于分离也可以鉴定有关物质,如:毛10 除了上面讨论的能够生产抗生素的主要微生物种属外，其它微生物也能够产生一些重要的抗生 素。在细菌中，从葡萄糖杆菌 Gluconobacter SQ26445 分离得到了磺胺净素(Sulfazecin)，属于磺酰基 单环−内酰胺类抗生素。以后发现农杆菌 Agrobacterium、色杆菌 Chromobacterium、纤维粘细菌 Cytophage 和曲挠杆菌 Flexibacter 的一些种也能产生磺胺净素。黄杆菌 Flavobacterium 和黄单胞菌 Zanthomonas 的某些菌株则能够产生头孢菌素 C。 霉菌中的头孢霉 Cephalosporium chrysogenum 是最重要的头孢类抗生素生产菌种。头胞霉在分 类学上有一些不同看法，它们的共同特点是分生孢子的结构简单，在一小部分分生孢子的顶上有一 个单茎或分枝很少的茎，其菌丝分化形成节孢子。Cephalosporium chrysogenum 的营养要求与青霉类 似，一些糖类、甲基油酸或甘油都能作为碳源，无机氮、氨基酸或复合的多肽作为氮源。除头孢类 抗生素外，Cephalosporium 生产的其它重要抗生素都属于聚酮类或萜类化合物，如六酮类的浅蓝菌 素 Cerulenin(C. caerulens)是脂肪酸生物合成的抑制剂；梭链孢酸 Fusidic acid(Acremonium fusidioides) 则是抗葡萄球菌剂。 木霉属的 Trichoderma inflatum 是环孢 A 的生产菌，环孢 A 具有抗霉菌活性，更重要的用途是 作为器官移植的免疫抑制剂。 10.3 新抗生素生产菌种的筛选 微生物的次级代谢产物是发现新抗生素和其它生物活性物质的巨大宝库。许多国家和大制药公 司都投入了大量的人力和物力从事这项工作，发现了数以万计的新化合物，从中进一步筛选出了具 有临床应用价值的抗生素和生物活性物质等，其中许多产物已经形成了知识产权，在创造了巨大经 济利益的同时，也为人类的健康和工农业生产的发展作出了贡献。今天，虽然基因工程和组合化学 的发展为新药的开发提供了新的思路和方法，但是持之以恒地对各种微生物的次级代谢产物进行分 析鉴别，从中发现新的化合物、筛选出新的抗生素仍然具有重要意义。 10.3.1 抗生素的基本筛选方法 自从发现青霉素后，各国科学家已经对发现新抗生素建立了一套比较系统的方法，可以在短时 间内从微生物的次级代谢产物中发现数以千计的活性分子，从中又能够进一步筛选出几个具有临床 应用价值的抗生素。这种筛选方法最初是由美国 Rutgers 大学的 Waksman 教授于 1940 年建立起来 的，至今仍然被工业界和学术界广泛采用。 在上一节中我们已经介绍了许多抗生素生产菌都是来自于有机物在自然界的循环过程，因此筛 选的第一步是收集各种环境条件下的土壤和腐败植物样品，从中进行筛选。最常用的筛选过程包括 如下步骤：1）将土壤样品加水后充分搅拌或震荡；2）离心取上清液并稀释后涂在事先准备好的琼 脂平板上；3）在平板上挑选一些菌落接种于液体培养基进行培养；4）吸取培养液检验其抗菌或其 它生物活性。 当某一菌落的生物活性得到确证后，就必须将生物活性物质进行分离和部分提纯，以确定该物 质是否具有新颖性，并进行一系列初步的生物试验以评价其应用前景。这一步骤的关键是要避免与 前人工作的重复。一般而言，培养液中生物活性物质的浓度很低，而且存在许多结构类似物，若要 完全将它们分别予以提纯将需要消耗大量的人力和物力。因此对代谢产物的提纯要适度，粗产物的 纯度应该在 5-10%以上。在分离前应该确定活性物质是在发酵液中还是菌体中。 确定活性物质的新颖性是筛选工作的重点，为此要对活性物质进行一系列的生物学性质和物理 化学性质检验。主要的生物学性质有：1）对活性物质的抗菌谱进行评价，包括交叉抗菌谱，血清、 pH、接种量及离子等因素对抗菌谱的影响；2）活性物质对实验动物的影响，特别是对已受到感染的 动物鼠的 ED50（50%有效剂量）和 LD50（50%致死剂量）的测定，除了确定其绝对值外，有效剂量 和致死剂量的相对比值具有更重要的意义，因为经初步提纯的活性物质中，虽然纯度不高，但如果 活性物质只有一种，该比值就与样品的纯度无关；3）如果产物是某一特定代谢途经中某一种酶的抑 制剂，鉴别其新颖性就比较容易，因为需要比较的对象只是具有同样功能的数量有限的几种化合 物，当然也要注意该化合物是否在过去已经根据它的其它活性而被分离、鉴别过。 由于产物只经过初步的分离提纯，还不可能进行纯物质物性的测定，如熔点、红外及 NMR 谱 等，但是可以进行紫外和可见光谱的测量，从中可以获得许多有用的信息。样品虽然不纯，但活性 物质的含量往往是最多的，因此利用质谱可以测定其正确的分子量，这对于新颖性的鉴别非常有 用。在各种溶剂系统中进行纸层析和薄层层析能获得该物质的酸碱性、亲水或亲脂性等性质，斑点 的迁移值可以用来与已知数据比较。现代 HPLC 技术既可以用于分离也可以鉴定有关物质，如：毛